高速逆流色譜法分離純化龍膽堿性乙醇提取物中的龍膽堿*

石 垚，王琳琳，余河水，賴青海，丁 輝，張麗娟，宋新波

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

Abstract:［Objective］To explore three different fatty acid ratio of different proportions of single and whether the prescription icariin nanoparticles affect their formation.［Methods］By using single analog processing method，by using single analog processing methods，analog the process of processing and boiling，it takes particle size and potential sweep detection for the liquid and try to separate particles，detect the drug content and free particle dose by HPLC.［Results］Determined by the size of the potential discovery of three fatty acids could be found in different proportions and the ratio of single use will form nanoparticles and will epimedium glycoside drug content and particle size of nanoparticles formed impact.［Conclusion］Suet different fatty acid composition may have different effects on the formation of nanoparticles icariin.
Key words:fatty acids；oil sunburn；icariin；nanoparticles

高速逆流色譜法分離純化龍膽堿性乙醇提取物中的龍膽堿*

石 垚，王琳琳，余河水，賴青海，丁 輝，張麗娟，宋新波

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

［目的］建立從龍膽堿性乙醇提取物中分離龍膽堿的高速逆流色譜（HSCCC）方法。［方法］采用高速逆流色譜儀分離純化龍膽堿性乙醇提取物中的龍膽堿，通過(guò)優(yōu)化溶劑系統(tǒng)，以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水（5∶5∶4∶6）為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，儀器轉(zhuǎn)速為850 r/min，流速為1.5 mL/min，溫度為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。［結(jié)果］龍膽堿性乙醇提取物經(jīng)過(guò)D151弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂富集（20%乙醇洗脫部分），再采用HSCCC技術(shù)進(jìn)行分離純化，制備得到的98.8%純度的龍膽堿。［結(jié)論］該方法穩(wěn)定、回收率高，可高效地從龍膽堿性乙醇提取物中分離龍膽堿。

龍膽；龍膽堿；高速逆流色譜

龍膽為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabra Bge）、條葉龍膽（G.manshurica Kitag）、三花龍膽（G.triflora Pal1）、或滇龍膽（G.rigescens Franch）的干燥根和根莖。前3種習(xí)稱“龍膽”，后一種習(xí)稱“堅(jiān)龍膽”。性寒、味苦、歸肝、膽經(jīng)；能清熱燥濕、瀉肝膽火，用于濕熱黃疸、陰部濕癢、帶下、肝火目赤、耳鳴耳聾、肋痛口苦、驚風(fēng)抽搐等［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明龍膽具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗病毒、抑菌等藥理作用［2-4］，近年來(lái)主要用于治療急慢性肝炎、乙型腦炎和抗腫瘤等［5］。龍膽中主要的化學(xué)成分是環(huán)烯醚萜類化合物，其中龍膽苦苷是龍膽的主要有效成分［6］，龍膽堿（又名秦艽甲素）是龍膽苦苷體內(nèi)經(jīng)代謝的重要活性產(chǎn)物［7］。文獻(xiàn)報(bào)道，具有抗糖尿病活性的獐牙菜苦苷的體內(nèi)代謝產(chǎn)物龍膽堿能上調(diào)胰島素抵抗3T3-L1 （PPAR 3T3-L1）脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)［8］。藥理研究表明，龍膽堿具有抗炎［9］、解熱［10］、抗驚厥［11］和鎮(zhèn)靜催眠［12］等藥理活性。龍膽堿（秦艽甲素）不是植物本身存在的化合物，而是龍膽苦苷與氨水反應(yīng)的人工產(chǎn)物［13］。目前龍膽堿的制備主要有以龍膽苦苷為原料合成［14］和龍膽藥材堿性提取后通過(guò)離子交換樹(shù)脂柱和硅膠柱層析進(jìn)一步純化［15］。工藝相對(duì)繁瑣，操作周期長(zhǎng)，不利于大量制備。

高速逆流色譜（HSCCC）技術(shù)是一種無(wú)需任何固態(tài)載體或支撐的液-液分配色譜技術(shù)，具有眾多優(yōu)點(diǎn)，如：不需要固體做固定相；色譜柱無(wú)填料；容積極性可調(diào)范圍大；可采用多種洗脫方式；對(duì)樣品的吸附少，回收率高；容易實(shí)現(xiàn)放大生產(chǎn)等。被廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物中有效成分包括生物堿類、黃酮類、皂苷類、醌類、多酚類、苯丙素類、多肽，以及蛋白質(zhì)、抗生素等的分離分析和制備［16-22］。本實(shí)驗(yàn)采用HSCCC技術(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂富集的龍膽堿性乙醇提取物進(jìn)行分離純化，制備得到高純度的龍膽堿，方法穩(wěn)定，回收率高，適應(yīng)性強(qiáng)，為分離純化龍膽堿提供了一種新技術(shù)路線。

1 儀器與材料

ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），DLSB型低溫冷卻循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限公司），KQ-250E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），LC-2010 AHT高效液相色譜儀（Shimadzu日本島津公司），AL204電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］，Kromasil C18（250mm×4.6 mm，5 μm）（美瑞泰克科技有限公司），Agilent 1290高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6520（安捷倫科技有限公司），TBE 300 B高速逆流色譜儀（上海同田生物技術(shù)有限公司），D151弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（天津波鴻樹(shù)脂科技有限公司），甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、氨水（分析純）（天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠），甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、正己烷（色譜純）（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司），氯仿（天津江天化工技術(shù)有限公司）。

龍膽藥材購(gòu)自百善（唐山）藥業(yè)有限公司，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張麗娟教授鑒定為滇龍膽（G.rigescens Franch）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 高效液相色譜（HPLC）分離條件 LC-2010 AHT高效液相色譜儀，Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（30∶70），等梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，柱溫為30℃。

2.2 HSCCC分離過(guò)程 以20 mL/min的流速泵入固定相（上相），等檢測(cè)器出口有溶劑流出，停泵，換上流動(dòng)相（下相），選擇正向旋轉(zhuǎn)（FWD）緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速至850 r/min，以流速1.5 mL/min泵入流動(dòng)相，分離溫度為25℃，檢測(cè)器波長(zhǎng)280 nm。

2.3 龍膽堿粗品的制備 由于龍膽堿為龍膽中環(huán)烯醚萜苷類和氮原子的反應(yīng)產(chǎn)物，其反應(yīng)流程圖見(jiàn)圖1。影響其合成的主要條件有溶液的pH值和浸泡時(shí)間，通過(guò)對(duì)龍膽堿的轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行優(yōu)化確定提取溶液的最佳pH值為9.5，最佳浸泡時(shí)間為16 h。

圖1 龍膽苦苷轉(zhuǎn)化龍膽堿的流程圖

龍膽藥材1.2 kg，粉碎，用堿性乙醇溶液（pH 9.5）浸泡16 h，回流提取，提取2次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至浸膏，加等量水混懸，等體積三氯甲烷萃取5次。合并三氯甲烷部分，回收三氯甲烷得到浸膏285.0 g。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 龍膽堿粗品的初步分離 取D151弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，預(yù)處理后濕法裝柱，用濃度為1%的鹽酸（HCl）酸溶液平衡。取“2.3”項(xiàng)下的浸膏205.0 g，用1%的HCl-水溶液超聲溶解，離心（6 000 r/min，10 min），上清液經(jīng)過(guò)D151弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，依次用水、10%、15%、20%、25%、30%的乙醇梯度洗脫，HPLC、薄層層析技術(shù)（TLC）跟蹤檢測(cè)，其中20%乙醇部分檢測(cè)到龍膽堿，收集20%乙醇洗脫部分，減壓回收溶劑，濃縮，得到浸膏（龍膽堿粗品）12.0 g。

3.2 HSCCC分離純化龍膽堿

3.2.1 HSCCC溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化 溶劑體系的選擇是HSCCC分離重要的一個(gè)環(huán)節(jié)［23］。選擇逆流色譜的溶劑體系的方法多樣，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC測(cè)定分配系數(shù)K（0.5＜K＜2）法。

用HSCCC技術(shù)進(jìn)行分離，其首要條件是保證樣品在互不相溶的上下兩相中有合適的分配系數(shù)。即K=溶質(zhì)在固定相中的質(zhì)量濃度（Cs）同溶質(zhì)在流動(dòng)相中的質(zhì)量濃度（Cm）之比。用公式（1-1）表示：K= Cs/Cm（1－1），同時(shí)，HPLC的峰面積是與各組分的濃度是成正比的，即：Cs/Cm=As/Am（1－2），其中Am為樣品在流動(dòng)相中的峰面積，As為樣品在固定相中的峰面積。通過(guò)調(diào)研文獻(xiàn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)篩選，本實(shí)驗(yàn)選擇了正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水為溶劑系統(tǒng)。

稱取“3.1”項(xiàng)下少量的粗龍膽堿，選擇正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶5∶5、正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶5∶6∶正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶6∶5，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶4∶6和測(cè)定樣品在上下相中的分配系數(shù)K。見(jiàn)表1。

表1 在不同溶劑系統(tǒng)中龍膽堿的分配系數(shù)

結(jié)合分配系數(shù)K和不同的體積比的正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水經(jīng)過(guò)HSCCC后得到的龍膽堿的純度，本實(shí)驗(yàn)選擇了正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水（5∶5∶4∶5）為溶劑系統(tǒng)。

3.2.2 龍膽堿的純化 按照“3.2.1”項(xiàng)下正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶4∶6的比例，配置溶劑體系2 000 mL于室溫條件下靜置過(guò)夜，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，分別超聲脫氣20 min。稱取龍膽堿粗品950.8 mg，用上下相溶解進(jìn)行制備。根據(jù)HSCCC圖收集目標(biāo)化合物1流份。見(jiàn)圖2。

3.3 龍膽堿的結(jié)構(gòu)鑒定及純度檢驗(yàn) 利用HPLC 對(duì)HSCCC分離純化到的目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和純度檢測(cè)。得到的目標(biāo)化合物與龍膽堿對(duì)照品進(jìn)行HPLC分析，相同條件下，兩者保留時(shí)間相同。采用外標(biāo)法測(cè)定純度為98.8%；樣品與龍膽堿對(duì)照品進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS）分析，［M+H］+m/z 176.070 7，［M+Na］+m/z 198.052 8。說(shuō)明HSCCC分離純化得到的目標(biāo)化合物是龍膽堿。見(jiàn)圖3。

圖2 龍膽堿的HSCCC圖

圖3 粗龍膽堿以及龍膽堿化合物的HPLC圖

4 討論

龍膽堿又名秦艽甲素，系裂環(huán)烯醚萜苷類在堿性環(huán)境下轉(zhuǎn)化而來(lái)的人工產(chǎn)物［13］。文獻(xiàn)報(bào)道的合成方法主要是利用龍膽苦苷經(jīng)吡啶反應(yīng)制得四乙酰龍膽苦苷，而后再以氨水反應(yīng)后分離獲得［14］，還有利用龍膽藥材堿性提取后通過(guò)離子交換樹(shù)脂柱和硅膠柱層析進(jìn)一步制備［15］。上述方法相對(duì)繁瑣，產(chǎn)量低，不利于工業(yè)化制備。筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，龍膽堿在溫度過(guò)高時(shí)容易發(fā)生變化，因此在回流提取時(shí)保持微沸即可。通過(guò)硅膠柱層析分離龍膽堿時(shí)，不能直接完全將其解吸附，需要在流動(dòng)相添加堿性溶液，回收處理較為繁瑣。本實(shí)驗(yàn)采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)龍膽堿粗品進(jìn)行富集，再利用高速逆流色譜（HSCCC）技術(shù)，在分離的過(guò)程中不存在不可逆吸附，使用的樣品可以全部回收再利用。該方法穩(wěn)定，回收率高、適應(yīng)性強(qiáng)，為高效分離純化龍膽堿提供了一種新方法，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)產(chǎn)物的體外制備。

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HSCCC separation and purification gentian alkaline ethanol extracts of gentian

SHI Yao，WANG Lin-lin，YU He-shui，LAI Qing-hai，DING Hui，ZHANG Li-juan，SONG Xin-bo
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

R284.2

A

1673－9043（2016）01－0044-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.01.12

天津市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（12TXGCCX03800）。

石 垚（1990-），男，碩士研究生，主要從事中藥化學(xué)方向研究。

宋新波，E-mail：songxinbo@tjutcm.edu.cn。

（2015-09-26）