松針提取物對腎性高血壓大鼠的治療效果觀察*

楊澤填，賴錦茂，黃錦菁，陳勝賢，林銳珊，蘇 寧

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 510405）

·學(xué)生園地·

松針提取物對腎性高血壓大鼠的治療效果觀察*

楊澤填1，賴錦茂1，黃錦菁1，陳勝賢1，林銳珊2，蘇 寧2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 510405）

［目的］探討松針提取物對兩腎一夾（2k1c）大鼠高血壓的影響及其機制。［方法］建立2k1c高血壓大鼠模型，隨機分為模型組、陽性藥物組、松針提取物高劑量組、松針提取物中劑量組、松針提取物低劑量組、假手術(shù)組，各組分別予0.9%氯化鈉（NaCl）溶液、1kg/L的卡托普利懸濁液、50、30、20 kg/L的松針提取物、0.9%NaCl溶液，連續(xù)灌胃4周，監(jiān)測血壓、檢測血清中一氧化氮（NO）和血漿中血管內(nèi)皮素（ET）變化。［結(jié)果］與模型組相比，松針提取物各劑量組大鼠收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）均有下降，尤其SBP效果顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其血漿中ET含量下降，血清中NO含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與陽性藥物組相比，血壓下降較緩慢，幅度較小，ET含量下降及NO含量升高無明顯差異。［結(jié)論］松針提取物通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)舒縮因子平衡達到降血壓效果。

松針提取物；兩腎一夾；高血壓；舒縮因子

馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）為松屬植物，是中國亞熱帶南部潮濕地區(qū)分布最廣、資源最大的樹種。松針是馬尾松的葉子，現(xiàn)代研究表明松針具有抗炎、鎮(zhèn)咳、抗突變、降血脂、降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等作用，近年來醫(yī)學(xué)臨床上用來治療感冒、咳喘、腹痛腸炎、高血壓、腫瘤等［1］。民間有采用新鮮松針治療高血壓病的實例［2］，也有學(xué)者用含松針的中成藥治療心血管疾病的案例，如陳維云等［3］報道了參松養(yǎng)心膠囊治療慢性心力衰竭的臨床觀察，且都取得了較為滿意的效果。

有學(xué)者進行關(guān)于降血壓中藥影響血管內(nèi)皮舒縮因子的研究［4］。但是關(guān)于松針提取物通過調(diào)節(jié)血管舒縮因子平衡的研究在國內(nèi)外研究中尚未見相關(guān)報道。本次實驗以兩腎一夾（2k1c）高血壓大鼠為實驗對象，選取代表血管舒張因子（EDRF）的一氧化氮（NO）和血管收縮因子（EDCF）的血管內(nèi)皮素（ET）為指標(biāo)，通過監(jiān)測大鼠舒張壓（DBP）和收縮壓（SBP）、血清中NO和血漿中ET兩個指標(biāo)來研究松針提取物降血壓的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量150～180 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號SYXK（粵）2013-0001；質(zhì)量合格證明：NO.44005800000006。

1.1.2 藥品 10%水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠），注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號J3048403），0.9%氯化鈉（NaCl）注射液（四川科倫大藥廠制藥有限公司，批號T13070604），松針提取物（規(guī)格：10∶1，陜西瑞康生物工程有限公司，批號20140118），卡托普利片（規(guī)格每片25 mg，山西津華暉星制藥有限公司，批號140307）。

1.1.3 試劑 大鼠ET酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒，由上海西唐生物科技有限公司提供，批號201404。大鼠NO ELISA檢測試劑盒，由上海西唐生物科技有限公司提供，批號201404。

1.1.4 器材 無菌針灸針（規(guī)格0.25 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，批號130310），醫(yī)用真絲編織線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司），真空采血器配套用針（上?？祪z醫(yī)療器械有限公司），乙二胺四乙酸（EDTA）真空采血管、普通采血管（山東省皮武縣華博醫(yī)療器械有限公司）。

1.1.5 儀器 BP-6動物無創(chuàng)血壓測試儀系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），DENLEY DRAGON Wellscan MK 3全自動酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司），BL-420生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 腎性高血壓大鼠模型建立 將SD雄性大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，選取其中10只作為假手術(shù)組，其余50只進行結(jié)扎單側(cè)腎動脈手術(shù)，建立2k1c動物模型。大鼠稱重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg），開腹分離左腎動靜脈。無菌線穿過腎動脈，用直徑0.25 mm的無菌針灸針與腎動脈緊貼平行放置，扎緊無菌線，再抽出無菌針灸針?？p合腹腔，注射抗生素，待清醒后置于干凈籠內(nèi)飼養(yǎng)。假手術(shù)組只分離左腎，不結(jié)扎腎動脈。

1.2.2 動物分組 手術(shù)4周后用BP-6動物無創(chuàng)血壓測定儀測定血壓，SBP＞130 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa，下同）為成模標(biāo)準(zhǔn)，篩選出40只動物模型。按隨機數(shù)字表法隨機分為：模型組、陽性藥物組、松針提取物低劑量組、松針提取物中劑量組、松針提取物高劑量組，另加假手術(shù)組10只。

1.2.3 藥物制備及給藥方式 按照50、30、20 kg/L的松針提取物配備松針提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組；按照1 kg/L的卡托普利懸濁液配備陽性藥物劑量組

每日予各組大鼠相應(yīng)藥物灌胃給藥1次，每次2 mL，連續(xù)灌胃4周。假手術(shù)組、模型組予0.9%NaCl溶液。

1.3 指標(biāo)的檢測與方法

1.3.1 大鼠血壓的測定 給藥期間大鼠血壓每周測定1次。BP-6動物無創(chuàng)血壓測試儀預(yù)熱30 min后，將大鼠置于固定器中，鼠尾套入套袖，適應(yīng)15 min（37℃），動物安靜后充氣測定大鼠收縮壓和舒張壓。

1.3.2 標(biāo)本采集 各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg），稱重并記錄，經(jīng)腹主動脈采血。用普通采血管采集制備血清樣本，4℃下3 000 r/min離心10 min，分離上清液-80℃保存，按試劑盒說明測定血清NO的含量。用EDTA采血管采集制備血漿樣本，搖勻，4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液-80℃以下保存待測，測定血漿ET的含量。

1.3.3 指標(biāo)檢測 本實驗檢測ET、NO含量采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ABC-ELISA）法。具體步驟如下：每孔各加入待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃40 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白除外）。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃20 min。洗板同前。每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板置37℃10 min。洗板同前。每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應(yīng)15 min。每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值。ET濃度與A值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中ET濃度。

1.4 統(tǒng)計方法 用SPASS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模 本次實驗采用了腎性高血壓模型中經(jīng)典的2k1c大鼠模型，造模50只，1只因術(shù)后處理不當(dāng)互相撕咬致死，無感染，存活率98%，4周后符合高血壓標(biāo)準(zhǔn)為40只，造模成功率80%。因灌胃手法不當(dāng)或取材時血液污染，最后納入統(tǒng)計的大鼠為模型組7只、假手術(shù)組7只、陽性藥物組6只、松針提取物高劑量組6只、松針提取物中劑量組7只、松針提取物低劑量組6只［5-6］。

2.2 松針提取物對血壓影響 與模型組比較，假手術(shù)組SBP明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組SBP與DBP明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；松針提取物各劑量組，SBP明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），DBP降低但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。松針提取物各劑量組與陽性藥物組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 第7周松針提取物對2k1c大鼠模型血壓影響（±s） mmHg

表1 第7周松針提取物對2k1c大鼠模型血壓影響（±s） mmHg

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

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2.3 松針提取物對2k1c大鼠血漿ET的影響 與模型組比較，假手術(shù)組ET含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陽性藥物組ET含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。松針提取物各劑量組，ET含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。松針提取物各劑量組與陽性藥物組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

圖1 松針提取物對2k1c大鼠模型血壓影響

表2 松針提取物對2k1c大鼠血漿ET的影響（±s）ng/L

表2 松針提取物對2k1c大鼠血漿ET的影響（±s）ng/L

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 n ET模型組 7 108.1±23.3*假手術(shù)組 7 70.0±21.1陽性藥物組 6 67.4±7.0#松針提取物高劑量組 6 72.2±14.9松針提取物中劑量組 7 71.3±8.9#松針提取物低劑量組 6 84.5±11.9

2.4 松針提取物對2k1c大鼠血清NO的影響 與模型組比較，假手術(shù)組NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陽性藥物組NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。松針提取物各劑量組NO含量明顯升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。松針提取物各劑量組與陽性藥物組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表3 松針提取物對2k1c大鼠血清NO的影響（±s） mmol/L

表3 松針提取物對2k1c大鼠血清NO的影響（±s） mmol/L

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 n NO模型組 7 6.36±1.16*假手術(shù)組 7 7.71±1.15陽性藥物組 6 7.50±1.30#松針提取物高劑量組 6 7.32±2.38松針提取物中劑量組 7 7.48±1.35松針提取物低劑量組 6 8.06±2.23

3 討論分析

3.1 證實松針提取物降血壓的療效 血壓形成取決于心臟收縮、大血管彈性、血液本身、血液的黏稠度及外周阻力等因素。心臟收縮形成SBP，大動脈回縮形成DBP。在臨床中，SBP增高最常見，往往與年齡增長相關(guān)，也更難控制，SBP高說明大動脈彈性低，動脈已經(jīng)硬化，往往比SBP和DBP都高的患者還要嚴重［7］。

從實驗結(jié)果看，模型組大鼠與假手術(shù)組比較，SBP、DBP明顯升高（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，證明了2k1c大鼠模型造模成功。松針提取物高、中、低劑量組與模型組比較，大鼠SBP明顯降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，DBP降低但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。松針提取物各劑量組與陽性藥物組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。大鼠血壓在第5周至第6周時可趨于穩(wěn)定，松針提取物及卡托普利在用藥后1周可出現(xiàn)大鼠血壓低于模型組，松針提取物各組用藥后2周血壓值趨于穩(wěn)定，但卡托普利組血壓值繼續(xù)下降。實驗結(jié)果提示，松針提取物各劑量組均對SBP有一定程度的降低作用，且可以避免臨床上長期服用降壓藥導(dǎo)致的血壓值偏低現(xiàn)象，降壓效果比較溫和。

3.2 探究松針提取物降血壓的機制 高血壓是當(dāng)今危害人類健康的重要疾病，嚴重影響心、腦、腎等靶器官的功能，人群患病率高，且有逐年上升趨勢［8］。目前研究表明，血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓密切相關(guān)。覆蓋血管內(nèi)膜面的內(nèi)皮細胞能生產(chǎn)、激活和釋放各種血管活性物質(zhì)，通過釋放血管內(nèi)皮依賴性舒張因子和收縮因子調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞以維持血管張力。血管內(nèi)皮發(fā)揮調(diào)節(jié)血管舒縮功能是通過調(diào)控舒張因子NO、血漿前列環(huán)素（PGI2）與ET、血栓系B2（TXB2）的釋放平衡來實現(xiàn)的。ET和NO是體內(nèi)血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)的重要標(biāo)志物，其保持動態(tài)平衡在血管平滑肌功能及血管張力調(diào)節(jié)系統(tǒng)中具有很重要作用，在正常生理情況下ET和NO之間相互制約，使血壓維持在一定的水平［9-10］。

實驗結(jié)果表明，模型組與假手術(shù)組比較，ET含量明顯升高（P＜0.05），NO含量明顯降低（P＜0.05），都具有統(tǒng)計學(xué)意義，符合造模成功標(biāo)準(zhǔn)。陽性藥物組與模型組相比ET含量明顯降低（P＜0.05），NO含量明顯升高（P＜0.05）。松針提取物中劑量組與模型組相比，ET含量明顯降低（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，NO含量明顯升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。松針提取物各劑量組與陽性藥物組比較無明顯差異（P＞0.05）。松針提取物可能通過抑制內(nèi)皮衍生收縮因子ET的釋放，而促進內(nèi)皮依賴性舒血管物質(zhì)NO的釋放，調(diào)節(jié)ET和NO間平衡狀態(tài)，從而舒張血管，降低外周阻力，減少回心血量，從而達到降低血壓效果。本實驗動物給藥時間過短，且實驗組高、中、低劑量組劑量梯度過小可能是造成實驗組結(jié)果差異不明顯的主要原因。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，松針提取物可以明顯降低2k1c大鼠SBP和DBP，尤其對于SBP效果顯著，與臨床經(jīng)典藥卡托普利相比，具有降壓效果溫和特點。其降壓機制可能是通過調(diào)節(jié)ET和NO間平衡狀態(tài)，從而舒張血管，降低外周阻力，減少回心血量，達到降低血壓效果。

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Effect observation of PNE on treating renal hypertension rats

YANG Ze-tian1，LAI Jin-mao1，HUANG Jin-jing1，CHEN Sheng-xian1，LIN Yue-shan2，SU Ning2
（1.The First School of Clinical Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2.Basic Medical College，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

［Objective］To investigate antihypertensive effect and possible mechanism of the Pineneedle Extract （PNE）in 2-kidney-1-clip（2k1c）hypertensive animal model.［Methods］Established the 2k1c hypertensive animal models.The rats were divided randomly into six groups：model group，western medicine group（Captopril），PNE highdose group，PNE medium-dose group，PNE low-dose group and sham-operation group.Model group and shamoperation group both

0.9%sodium chloride.Western medicine group

1 kg/L Captopril suspensions.PNE high-dose group，PNE medium-dose group，PNE low-dose group

PNE solution，5 kg/L，3 kg/L，2 kg/L，separately.Each group rats was given corresponding drugs by gavage for 4 weeks.Then monitor their blood pressure，measure serum nitric oxide（NO）and plasma endothelin（ET）content.［Results］Compared with model group，the PNE each groups rats of diastolic pressure（DBP）and systolic pressure（SBP）both reduced，especially SBP，which were statistically significant（P＜0.05）.The level of serum NO fell，while the level of plasma ET raised，which were statistically significant（P＜0.05）.Contrasted to western medicine group，the PNE each group rats of blood pressure decrease slowly.Both the decline of ET content and the rise of NO content were not statistically significant.［Conclusion］PNE can reduce blood pressure by adjusting endothelium-derived relaxing and contracting factor.

Pineneedle Extract（PNE）；2k1c；hypertensive；endothelium-derived relaxing and contracting factor

R544.1

A

1673-9043（2016）01-0060-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.01.16

2012年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃訓(xùn)練項目（201210572016）。

楊澤填（1994-），男，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2011級本科生。

蘇 寧，E-mail：346393409@qq.com。

（2015-11-08）