高分子聚合物γ-PGA對長雙歧桿菌的凍干保護(hù)作用

宋玉萍,梁金鐘,王風(fēng)青，梅劍秋

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

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高分子聚合物γ-PGA對長雙歧桿菌的凍干保護(hù)作用

宋玉萍,梁金鐘*,王風(fēng)青，梅劍秋

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

以長雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)菌株,以高分子聚合物γ-PGA為主要保護(hù)劑進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn)。通過對凍干菌粉的存活率、發(fā)酵產(chǎn)酸能力,凍干菌粉和反復(fù)凍融3次后菌體形態(tài)的微觀變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明:用10%脫脂乳粉作為保護(hù)劑菌體存活率為47.3%,以2.5%γ-PGA為保護(hù)劑菌體存活率為54.8%。以10%脫脂乳粉和1.5%γ-PGA作為保護(hù)劑其存活率為79.8%,復(fù)合保護(hù)劑比10%脫脂乳粉單一保護(hù)劑存活率高25.0%左右。電鏡觀察采用復(fù)合保護(hù)劑菌體外層形態(tài)呈致密包裹結(jié)構(gòu),凍融3次后菌體形態(tài)完整,細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見嚴(yán)重?fù)p傷和變形,復(fù)水后作為菌種進(jìn)行發(fā)酵,18 h時的酸度達(dá)到65.5°T,室溫貯藏90 d存活率仍能達(dá)到48.7%。

γ-PGA,冷凍干燥,長雙歧桿菌,凍干保護(hù)劑

γ-PGA(poly-γ-glutamic acid,γ-聚谷氨酸)是一種由微生物發(fā)酵合成的氨基酸高分子線型均聚物,由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基聚合而成[1],γ-PGA主鏈由酰胺鍵鏈接,且存在大量游離的親水性羧基[2],在分子內(nèi)部或分子之間可形成大量氫鍵。由于γ-PGA特殊的分子結(jié)構(gòu)賦予其具有極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、粘結(jié)性、懸浮性、增粘性、保濕性、極強(qiáng)吸水性、可食用性和可生物降解性[3],且具有極佳的抗冷凍性能[4]。雙歧桿菌是人類的腸道益生菌,具有多種生物學(xué)功能,能通過糖酵解產(chǎn)生大量有機(jī)酸,降低腸道環(huán)境的pH,可有效抑制腸道中腐敗菌和有害菌的生長繁殖[5],對人體健康有利。因此,近年來益生菌產(chǎn)品廣受人們青睞,但雙歧桿菌在凍干生產(chǎn)中細(xì)胞極易損傷而失活,在貯存期間其活性保持也較困難[6]。為提高益生菌凍干菌粉的存活率,需添加適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑使菌體細(xì)胞免受凍干的損害。本文的目的就是研究不同濃度的γ-PGA及γ-PGA與脫脂乳粉作為復(fù)合凍干保護(hù)劑,研究γ-PGA在冷凍干燥過程中對雙歧桿菌存活率的影響,并對其作用機(jī)理進(jìn)行分析探討。目前γ-PGA尚未被用于益生菌的凍干保護(hù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

PBS緩沖溶液:準(zhǔn)確稱取NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、KH2PO40.24 g、Na2HPO4·12H2O 0.3628 g溶于800 mL蒸餾水中,用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4,然后用蒸餾水定容至1000 mL,高壓滅菌后室溫保存。

混合鹽溶液:CaCl20.20 g/L、KH2PO41.00 g/L、K2HPO41.00 g/L、MgSO40.48 g/L、NaHCO310.00 g/L、NaCl 2.00 g/L。

γ-PGA純品由哈爾濱商業(yè)大學(xué)發(fā)酵自制;脫脂乳粉完達(dá)山乳業(yè)有限公司;半胱氨酸(L-Cysteine)(分析純)美國Amresco公司。

長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)由哈爾濱商業(yè)大學(xué)發(fā)酵學(xué)科組耐氧馴化培養(yǎng)得到。

菌體的活化、培養(yǎng)及保藏培養(yǎng)基(TPY培養(yǎng)基):酪蛋白胨12.0 g/L、胰蛋白胨3.0 g/L、大豆蛋白胨3.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、吐溫80 1.0 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、混合鹽溶液10.0 mL/L。500 mL三角瓶裝液量300 mL,121 ℃高壓滅菌20 min。

L535-1低速離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司;FD5系列凍干機(jī)SIM西蒙國際儀器有限公司;DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;超低溫保存箱Haier BIO-MEDICAL;SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司;BS224S電子臺秤賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1活菌粉的制備工藝活化菌種→液體培養(yǎng)→菌體收集→PBS洗滌→離心收集→細(xì)胞懸浮液(添加凍干保護(hù)溶液)→布盤→冷凍干燥→凍干菌粉

1.2.2菌體的培養(yǎng)、收集以及細(xì)胞懸浮液的制備將活化的長雙歧桿菌以2%的接種量接種于5000 mL TPY液體培養(yǎng)基,37 ℃靜止培養(yǎng)36 h,3500 r/min離心20 min棄上清,將得到的菌體沉淀用PBS緩沖溶液洗滌2次。將離心得到的菌泥懸浮于100 mL的PBS緩沖溶液中。凍干前先進(jìn)行厭氧活菌計(jì)數(shù)。

冷凍干燥:取10 mL的菌懸液于大平皿中,分別加入不同配方的保護(hù)劑溶液,用PBS定容至60 mL,使大平皿中保護(hù)劑的濃度為目標(biāo)配方最終濃度。將樣品放置于4 ℃冰箱中預(yù)冷2 h,然后放入-70 ℃冰箱中冷凍24 h,最后在真空度為3～15 mb的條件下干燥約48 h左右,待樣品恢復(fù)至室溫取出。

儲存:將制得的菌粉立即轉(zhuǎn)入塑封袋中,抽真空塑封以隔絕空氣并防止水分變化,室溫放置每隔一段時間取出測活菌數(shù)。

1.2.3存活率的計(jì)算細(xì)胞懸浮液活菌數(shù)測定:每個厭氧管中加入5 mL的TPY固體培養(yǎng)基后充入氮?dú)夥庋b,121 ℃高壓滅菌20 min,在水浴鍋中維持溫度在65 ℃,注入0.5 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的菌液,在冰水浴中滾管,使固體培養(yǎng)基均勻凝固在厭氧管管壁上。37 ℃培養(yǎng)72 h,計(jì)厭氧管壁的菌落數(shù)。

凍干菌粉活菌數(shù)的測定:將制得的凍干菌粉加入含玻璃珠的100 mL無菌的PBS緩沖溶液中復(fù)水2 h后搖勻進(jìn)行厭氧活菌數(shù)的測定。

式中:n1為10 mL原有長雙歧桿菌菌懸液的活菌數(shù);n2為菌粉復(fù)水后活菌數(shù)。

1.2.4電鏡樣品的制備將復(fù)水菌懸液離心得到菌泥,加入2.5% pH7.2戊二醛并置于4 ℃冰箱中固定1.5 h,用磷酸緩沖溶液沖洗2次后用50%、70%、90%乙醇脫水各一次,100%乙醇脫水2次,100%乙醇與叔丁醇1∶1、純叔丁醇各置換一次,每個操作間隔15 min。然后將樣品放入-20 ℃冰箱中冷凍30 min再放入凍干機(jī)中干燥,大約4 h。將得到的干粉用導(dǎo)電膠帶粘在樣品臺上,濺射鍍上金屬膜。

1.2.5酸度滴定將前述菌懸液無菌稀釋至100 mL,作為未凍干處理的菌懸液。取未凍干處理的菌懸液和復(fù)水后的各種菌粉溶液2 mL分別接種于100 mL TPY培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。將得到的發(fā)酵液按GB5409-89[7]方法進(jìn)行酸度測定。

2　 結(jié)果與分析

2.1 不同類型保護(hù)劑對長雙歧桿菌的凍干保護(hù)

以10%脫脂乳粉和2%的蔗糖、海藻糖、γ-PGA、甘露醇、谷氨酸為保護(hù)劑,以凍干菌粉的菌體存活率為依據(jù),選取最佳的保護(hù)劑種類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1　不同類型保護(hù)劑長雙歧桿菌凍干菌粉存活率的影響Fig.1　Effect of different cryoprotectants on the survival rate of Bifidobacterium longum after lyophilization

從圖1可以看出,脫脂乳粉、蔗糖、海藻糖和γ-PGA的保護(hù)效果比較好,這四種保護(hù)劑的保護(hù)效果大小為:γ-PGA>海藻糖>脫脂乳粉>蔗糖。其中2%γ-PGA的菌體存活率最高為54.8%。

γ-PGA具有極好的抗冷凍性、成膜性以及持水性,可能在凍干過程中能穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),γ-PGA分子的大量羧基與菌體蛋白的羥基形成氫鍵[8],使蛋白質(zhì)表面形成水化膜,穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu),凍干過程中的冰晶不易損傷細(xì)胞。

2.2不同濃度γ-PGA對長雙歧桿菌的凍干保護(hù)

實(shí)驗(yàn)以不同濃度的γ-PGA作為保護(hù)劑,通過對長雙歧桿菌凍干菌粉存活率的考察,確定γ-PGA作為凍干保護(hù)劑的最佳濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2　γ-PGA濃度對長雙歧桿菌凍干菌粉存活率的影響Fig.2　Effect of γ-PGA concentration on the survival rate of Bifidobacterium longum after lyophilization

從圖2可以看出,γ-PGA的添加明顯提高了長雙歧桿菌凍干菌粉的存活率,其中添加量為1%時菌體存活率提高效果顯著,添加量4%處達(dá)到最大,繼續(xù)增大γ-PGA添加量,影響效果逐漸減少。由于γ-PGA分子易附著于細(xì)胞表面[9],在凍干過程中細(xì)胞中的水分子緩慢向細(xì)胞表面遷移并和γ-PGA的親水基團(tuán)結(jié)合,極大的減少游離水的含量進(jìn)而減緩冰晶的生長,因而減輕了細(xì)胞的損傷。但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)隨著γ-PGA添加量的增加,菌粉的吸潮也越來越加重,而且γ-PGA價(jià)格比較高[10],綜合考慮將γ-PGA的添加量確定在2.5%以內(nèi)。

2.3γ-PGA與脫脂乳粉復(fù)配對長雙歧桿菌的凍干保護(hù)

用濃度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%γ-PGA分別與10%脫脂乳粉復(fù)配,以長雙歧桿菌凍干菌粉中菌體存活率為指標(biāo),確定最佳的保護(hù)劑配方濃度。不同配方的保護(hù)劑對長雙歧桿菌凍干菌粉中菌體的存活率影響見圖3。

圖3　不同配方保護(hù)劑對長雙歧桿菌凍干存活率的影響Fig.3　Effect of different cryoprotectants on survival rate of Bifidobacterium longum after lyophilization

從圖3可以看出,10%脫脂乳粉添加γ-PGA的保護(hù)劑較單一脫脂乳粉的保護(hù)效果明顯提高,在γ-PGA濃度1.5%左右達(dá)到最高,之后隨著γ-PGA濃度的增大,凍干菌粉的存活率幾乎不再增大。而且添加脫脂乳粉后,樣品吸潮有所緩解,基于保存條件和成本效益的綜合考慮,確定采用10%脫脂乳粉和1.5%γ-PGA的復(fù)合保護(hù)劑,菌體存活率達(dá)到79.8%。

2.4添加保護(hù)劑凍干菌體微觀形態(tài)的電鏡觀察

為了從微觀探討保護(hù)劑的作用,選擇未添加保護(hù)劑的對照樣、添加2.5%γ-PGA的凍干樣、添加脫脂乳粉的對照樣與1.5%γ-PGA和10%脫脂乳粉的復(fù)配凍干樣品四種凍干菌粉進(jìn)行掃描電鏡觀察,結(jié)果如圖4。

圖4　長雙歧桿菌凍干菌粉的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4　Picture of different cryoprotectants on structure of bacterial powder after lyophilization注:A：未添加保護(hù)劑的空白樣;B：2.5% γ-PGA凍干樣; C：10%脫脂乳粉凍干樣; D：10%脫脂乳粉+1.5%γ-PGA凍干樣。

冷凍干燥中,當(dāng)細(xì)胞的生理?xiàng)l件和胞外環(huán)境相同時,菌體死亡的可能性表達(dá)為:P=cS(P為菌體死亡的可能性,c為常數(shù),S為暴露在介質(zhì)中的區(qū)域)[11],說明菌體死亡的可能性與暴露在外部的區(qū)域面積有很大的關(guān)系。從圖4中可以看出,B中菌體被保護(hù)劑均勻包裹,而且分散性良好,菌體與保護(hù)劑呈沙琪瑪狀態(tài)分布;C中保護(hù)劑與菌體呈海綿狀,雖然保護(hù)劑將長雙歧桿菌包裹的很致密,但仍有部分菌體暴露在空氣和介質(zhì)中;D中保護(hù)劑與菌體呈現(xiàn)墻體結(jié)構(gòu),保護(hù)劑對長雙歧桿菌的包裹不僅致密而且?guī)缀鯖]有菌體露在表面,包裹的涂層均勻且致密。說明10%脫脂乳粉中添加1.5%γ-PGA能提供良好的物理屏障來抵御惡劣的外界環(huán)境,極大的減少了菌體暴露在介質(zhì)中的面積,有效地保護(hù)細(xì)胞免受冷凍傷害。

2.5反復(fù)凍融后的菌體形態(tài)

將制得的凍干菌粉反復(fù)凍干復(fù)水,即將得到的菌粉進(jìn)行復(fù)水洗滌去保護(hù)劑,離心得菌體后制成菌懸液,重新加入相對應(yīng)的保護(hù)劑進(jìn)行布盤凍干,如此反復(fù)2次,將得到的菌粉再進(jìn)行復(fù)水洗滌去掉保護(hù)劑,離心得到菌體后,進(jìn)行掃描電鏡觀察,結(jié)果如圖5。

圖5　反復(fù)凍干復(fù)水的長雙歧桿菌掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5　Picture of different cryoprotectants on the structure of Bifidobacterium longum after repeat lyophilization and hydration注:A：未添加保護(hù)劑的空白樣;B：2.5% γ-PGA凍干樣; C:10%脫脂乳粉凍干樣; D:10%脫脂乳粉+1.5% γ-PGA凍干樣。

為了能夠直觀的觀察保護(hù)劑對菌體的保護(hù)作用,驗(yàn)證不同配方保護(hù)劑緩解凍干過程對菌體的損傷,將制得的凍干菌粉反復(fù)凍融。菌體反復(fù)凍干復(fù)水后對菌體的損傷主要有冰晶機(jī)械應(yīng)力[12]和冷凍脫水導(dǎo)致細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)向非層狀結(jié)構(gòu)相變,導(dǎo)致復(fù)水時膜蛋白分離引起細(xì)胞內(nèi)溶物泄露甚至細(xì)胞破碎[13]。從圖5可以看出,不加任何保護(hù)劑的對照樣品A受到了極大的損傷,出現(xiàn)了大量的細(xì)胞碎片;添加2.5%γ-PGA作為保護(hù)劑的B樣品雖然也受到了損傷,但是未出現(xiàn)細(xì)胞碎片,菌體細(xì)胞表面有泡狀的突出部分,應(yīng)該是內(nèi)溶物輕微的泄露所導(dǎo)致;以10%脫脂乳粉為保護(hù)劑的C樣品雖然未出現(xiàn)細(xì)胞碎片,但是菌體變形得較為嚴(yán)重。10%脫脂乳粉與1.5%γ-PGA復(fù)配保護(hù)的樣品D細(xì)胞飽滿、形態(tài)完整、分散性好,未見細(xì)胞變形或粘連。電鏡結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在凍干過程中γ-PGA能有效的保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整和細(xì)胞膜的滲透屏障,有效的防止凍干損傷。

2.6菌體的產(chǎn)酸能力

將前述菌懸液無菌稀釋至100 mL,作為未凍干處理的菌懸液。取未凍干處理的菌懸液和復(fù)水后的各種菌粉溶液2 mL分別接種于100 mL TPY培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。酸度測定的結(jié)果見圖6。

圖6　不同配方保護(hù)劑對長雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸活力的影響Fig.6　Effect of different cryoprotectants on acidogenic of Bifidobacterium longum after lyophilization

長雙歧桿菌凍干時易導(dǎo)致部分菌體的損傷、某些酶的鈍化影響菌體的正常代謝[14],進(jìn)而使菌體的遲滯期明顯延長、對數(shù)生長期的產(chǎn)酸能力下降[15],所以通過酸度的測定可以表征菌體的活性。酸度的大小是菌體代謝的結(jié)果,亦是菌體活性的直觀反映。從圖6可以看出,10%脫脂乳粉與1.5%γ-PGA復(fù)配的保護(hù)劑保護(hù)的菌體與未進(jìn)行凍干的菌體產(chǎn)酸能力相差最小,說明復(fù)配的保護(hù)劑優(yōu)于10%脫脂乳粉的保護(hù)劑。雖然2.5%γ-PGA作為保護(hù)劑的樣品產(chǎn)酸能力不如10%脫脂乳粉作為保護(hù)劑的樣品,但也相差不是很大,綜合前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出γ-PGA可以很好的維持菌體的活性、快速的恢復(fù)活力,降低凍干過程帶來的代謝損傷,這應(yīng)該與γ-PGA分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外,γ-PGA具有很好的成膜性以及阻氧性,能有效的創(chuàng)造一個低氧的環(huán)境,保持長雙歧桿菌的代謝活性。

2.7凍干菌粉的貯存實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)10%脫脂乳粉與1.5%γ-PGA復(fù)合保護(hù)的長雙歧桿菌凍干菌粉,抽真空塑封置于室溫貯藏,每隔15 d進(jìn)行一次計(jì)數(shù),具體結(jié)果見圖7。

圖7　貯存過程中凍干菌粉活菌數(shù)Fig.7　The survival number of Bifidobacterium longum after lyophilization

將長雙歧桿菌制成菌粉的主要目的就是提高雙歧桿菌類產(chǎn)品的貨架期,將制得的凍干菌粉進(jìn)行貯存實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證保護(hù)劑的實(shí)用效果,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。從圖7可以看出復(fù)配保護(hù)劑在儲存90 d時活菌數(shù)為9.6 log(CFU/g)即4.02×109CFU/g,仍然保持在109CFU/g的水平,此時凍干菌粉的菌體存活率為48.3%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國際標(biāo)準(zhǔn)化委員會的規(guī)定[16]。

3　結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)得出,用10.0%脫脂乳粉作凍干保護(hù)劑菌體存活率為47.3%,而2.0%γ-PGA的菌體存活率可達(dá)到51.0%,與海藻糖效果相當(dāng)。在不同濃度γ-PGA與脫脂乳粉復(fù)配的實(shí)驗(yàn)中,添加γ-PGA的樣品活菌率要明顯高于單一脫脂乳粉的樣品,其中10.0%與1.5%γ-PGA復(fù)合保護(hù)長雙歧桿菌效果最為顯著,菌體的存活率達(dá)到79.8%。電鏡觀察經(jīng)保護(hù)劑包埋后的菌體形態(tài)呈墻體結(jié)構(gòu)將菌體致密的包裹,凍融3次后菌體形態(tài)依然飽滿、完整、未見細(xì)胞變形或粘連,復(fù)水后作為發(fā)酵菌種18 h時的酸度為65.5 °T,貯藏90 d存活率為48.3%。

當(dāng)前,γ-PGA用作凍干保護(hù)劑還少有研究,它保護(hù)菌體的機(jī)理可能源于以下幾點(diǎn):γ-PGA是谷氨酸聚合而成的同聚肽,分子鏈上有大量的羧基,能夠與菌體表面上的活性基團(tuán)結(jié)合,使菌體包裹的更嚴(yán)實(shí),還可以與菌體表面的蛋白以氫鍵結(jié)合,保證了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性;而且γ-PGA的持水性好,易與水分子結(jié)合,能夠極大的減少游離水的含量進(jìn)而減緩冰晶的生長,使形成的冰晶細(xì)小,達(dá)到理想的保護(hù)效果;另外隨著凍干過程中水分的升華,γ-PGA的濃度不斷增大,粘度也極度上升,因而分子擴(kuò)散系數(shù)降低,有效的避免了細(xì)胞內(nèi)溶物的泄露。γ-PGA屬于非滲透性的保護(hù)劑,雖然分子量比較大不能滲透進(jìn)入細(xì)胞,但分布在一定的范圍內(nèi),能在細(xì)胞表面形成更密封的保護(hù)層來阻止冷凍損傷,且它的成膜性以及阻氧性能使雙歧桿菌免受氧氣的毒害,保護(hù)內(nèi)部酶的活性,而且低氧環(huán)境還可降低細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)的過氧化作用。另外,γ-PGA在水中的溶解速度比較慢,可以減緩溶液進(jìn)入凍干菌體中的速度,起到一個滲透緩沖作用,如果沒有這個緩沖作用,水很快就會進(jìn)入細(xì)胞,造成活細(xì)胞的暫時滲透壓休克、受損細(xì)胞的破裂死亡。

γ-PGA在中性環(huán)境中是無規(guī)則卷曲狀態(tài),在酸性溶液中以平行的β-片層結(jié)構(gòu)為主[17],如果將它應(yīng)用于微膠囊,具有潛在的保護(hù)能力,使長雙歧桿菌有效的抵御體系中有害成分的破壞,尤其是在酸性和液體食品體系中。而且能使長雙歧桿菌在通過胃消化時對抗較強(qiáng)的酸環(huán)境,使益生菌高存活并有效的到達(dá)腸道的靶位點(diǎn),這將對人體微生態(tài)十分有益。

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Effect of polymerγ-PGA on freeze-dried protection ofBifidobacteriumlongum

SONG Yu-ping,LIANG Jin-zhong*,WANG Feng-qing,MEI Jian-qiu

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

WithBifidobacteriumlongumas experimental strain,in polymerγ-PGA as main protective agent,freeze-drying experiment was carried out.The optimal formulation of protective agent was studied by survival rate,the ability of producing acid,the morphology of the protective agent and the cell morphology that was repeated freezing and thawing after 3 times.The results showed that using 10% dried skim milk as a protectant cell survival rate was 47.3%,with 2.5%γ-PGA as a protectant cell survival rate was 54.8%.The survival rate of compound that 1.5%γ-PGA mixed with 10% Skim Milk Power was up to 79.8%,which was about 25.0% higher than using the single dried skim milk protectant at 10%.Electron microscope results showed that,with composite protective agent bacteria surface form a dense structure.After repeat freezing and thawing 3 times,there was no serious damage on bacteria.With strains that freeze-dried bacteria powder watered 2 h for fermentation,the fermentation acidity was 65.5 °T after 18 h.The survival rate stored 90 d at room temperature could reach 48.7%.

poly-γ-glutamic acid;lyophilization;Bifidobacteriumlongum;cryoprotectants

2015-11-19

宋玉萍(1990-)，女，碩士，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：846718795@qq.com。

梁金鐘(1957-)，男，本科，教授，研究方向：微生物學(xué)與發(fā)酵工程，E-mail：Ljz2050@126.com。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD32B08)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.028