富油新綠藻對四種抗生素敏感性的研究

張　茜,李雁群,盧少霞,鐘　敏,胡雪瓊,楊青峰,楊慧敏

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088)

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富油新綠藻對四種抗生素敏感性的研究

張茜,李雁群*,盧少霞,鐘敏,胡雪瓊,楊青峰,楊慧敏

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088)

為了探討富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)對氯霉素、青霉素、鏈霉素和四環(huán)素4種常用抗生素的敏感性,以液體培養(yǎng)下藻細胞生物量和固體平板培養(yǎng)下藻落的形成和生長為指標,研究富油新綠藻在四種抗生素的濃度為10、25、100和500 μg/mL條件下的生長情況。結(jié)果表明:液體培養(yǎng)條件下,四種抗生素對富油新綠藻的生長均表現(xiàn)出了抑制作用。鏈霉素抑制作用最為明顯,濃度10 μg/mL便可完全抑制藻細胞的生長;其次為氯霉素和四環(huán)素,100 μg/mL時能表現(xiàn)出明顯抑制效果;但是青霉素要在濃度達到500 μg/mL時才表現(xiàn)出明顯的抑制。通過對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析得出,鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、青霉素對富油新綠藻生長的半抑制濃度分別為:0.25、72、119和164 μg/mL。在固體培養(yǎng)中,鏈霉素濃度為10 μg/mL時完全抑制了藻細胞的生長,氯霉素和四環(huán)素的抑制濃度為100 μg/mL,而青霉素沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

富油新綠藻,抗生素,微藻，敏感性

微藻作為單細胞生物,相比于陸生高等植物,具有生長快、產(chǎn)量高、占地少、淡水消耗少、易于工業(yè)化培養(yǎng)等特點[1-2]。微藻與陸生植物一樣,可以根據(jù)其不同的生物特性用以生產(chǎn)蛋白質(zhì)、油脂、淀粉以及其他多種生物活性物質(zhì)[3-6]。一些微藻甚至可以直接作為食品,如螺旋藻、小球藻等[7-8]。因此,微藻作為食品材料的研究越來越受到人們的重視。一些微藻具有在細胞內(nèi)大量積累油脂的能力,高的可以達到其細胞干重的70%以上,一些微藻已經(jīng)被用來生產(chǎn)功能性油脂,如利用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA[9-10]。通過生物工程技術(shù),微藻還具有生產(chǎn)其他保健作用的多種功能性食用油的潛在可能[11]。富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)是1962年從沙漠中分離得到的一株淡水藻,經(jīng)鑒定為綠藻門,綠藻綱,綠球藻目,綠球藻科,新綠藻屬(Neochloris)的一種單細胞真核綠藻[12]。這種藻脂質(zhì)含量可達到干重的17.5%～54%,三脂肪酰甘油酯占總脂質(zhì)含量的80%,且其脂肪酸組成中大多數(shù)是16～18碳的脂肪酸[13]。本實驗室分析表明,富油新綠藻油脂中不飽和脂肪酸占66.28%,其中油酸和亞麻酸的含量達到總脂肪酸的48.98%,由此可見,富油新綠藻油脂具有可作為優(yōu)質(zhì)食用油的潛在可能[14]。

微藻培養(yǎng)極易受其他微生物侵染[15]。在微藻受到嚴重污染需要采取補救措施或者需要純化藻種,以及微藻基礎(chǔ)研究中,微藻的純種培養(yǎng)和保存中,都需要用到抗生素的處理[16-17]。在微藻基因工程技術(shù)研發(fā)中更要用到抗生素抗性作為轉(zhuǎn)基因藻的篩選特性[18]。因此,研究微藻對各種不同抗生素的敏感性,以指導和幫助微藻培養(yǎng)研究和實踐中對抗生素的應(yīng)用具有實際意義。

但是,目前有關(guān)富油新綠藻的抗生素敏感性的研究尚未見到文獻報道,本文擬通過分別采用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種不同的手段,觀察富油新綠藻對于青霉素、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素等四種抗生素的敏感性,找出這些抗生素對這種藻的抑制濃度,為以后富油新綠藻培養(yǎng)和基因工程研究和實際應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)原購自美國德克薩斯州立大學藻種保藏中心(The Culture Collection of Algae at the University of Texas in Austin,Austin,TX,USA),編號UTEX LB #1185,由加拿大渥太華大學Christopher Lan 教授惠贈;改良SE培養(yǎng)基含NaNO351 g/L,CaCl·22H2O 5 g/L,NaCl 5 g/L,MgSO4·7H2O 15 g/L,FeCl·6H2O 1 g/L,KH2PO435 g/L,K2HPO4·3H2O 15 g/L,混合微量元素鹽溶液1 mL,其中的試劑均為分析純,購自湛江林達化學試劑公司;抗生素氨芐青霉素、氯霉素、硫酸鏈霉素、鹽酸四環(huán)素純度均為99%,均購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。

YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;CJT-12超凈工作臺廣州瑞智科學儀器有限公司;98-2磁力攪拌器上海司樂儀器有限公司;WFJ7200分光光度計尤尼柯上海儀器有限公司;AK-1200電子天平(d=0.01 g)中韓合資科威電子儀器有限公司;CHZ-98B恒溫光照培養(yǎng)箱金壇市萬華實驗儀器廠。

1.2實驗方法1.2.1藻細胞培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為27～30 ℃,用500 mL血清瓶裝培養(yǎng)基400 mL,2000 Lux連續(xù)光照,通入含5%二氧化碳的空氣,通氣量為400～600 mL/min,用磁力攪拌器攪拌[19]。

1.2.2藻細胞濃度的測定抽取2 mL培養(yǎng)液于分光光度計上測定在600 nm處的吸光度值OD600,以細胞干物質(zhì)重計的細胞濃度計算為[19]

CDW(g/L)=OD600×0.4

式(1)

其中:CDW為細胞干重。

1.2.3液體培養(yǎng)抗生素的敏感性實驗取300 mL無菌改良SE液體培養(yǎng)基分別加入不同濃度的抗生素,抗生素濃度見表1;另外以同樣的培養(yǎng)基不加抗生素作為對照樣。接種100 mL對數(shù)生長期藻液,按1.2.1條件培養(yǎng),每天測定培養(yǎng)液的藻細胞濃度,做3個平行測定,在接種后觀察5 d,進行數(shù)據(jù)分析。

表1　用于敏感性實驗抗生素濃度(μg/mL)Table 1　Concentrations of antibiotics(μg/mL)

1.2.4固體培養(yǎng)抗生素敏感性實驗在100 mL改良SE培養(yǎng)液中加入1.5%瓊脂粉,高壓滅菌,冷卻到50 ℃左右,加入相應(yīng)濃度抗生素(抗生素濃度同液體篩選濃度一致),倒固體平板。按照細胞計數(shù)法計算細胞濃度,將生長至對數(shù)期的微藻培養(yǎng)液稀釋到適當濃度,定量吸取藻液200 μL均勻涂布于平板上,28 ℃恒溫2000 Lux連續(xù)光照培養(yǎng),觀察20 d,以微藻藻落形成和生長情況評價微藻對抗生素的敏感性。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Origin 6.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1富油新綠藻對氯霉素的敏感性

2.1.1富油新綠藻液體培養(yǎng)下對氯霉素的敏感性氯霉素敏感性實驗結(jié)果見圖1。由圖1可見,氯霉素對富油新綠藻生長情況有一定的抑制作用;隨著氯霉素濃度的增加,抑制作用增強;當氯霉素濃度為100 μg/mL時對富油新綠藻的生長產(chǎn)生了較為明顯的抑制;當氯霉素濃度為500 μg/mL時抑制作用顯著,此時富油新綠藻幾乎不能生長;然而,在氯霉素濃度≤25 μg/mL時對富油新綠藻的生長影響卻不明顯,說明富油新綠藻可以耐受25 μg/mL以下濃度的氯霉素。

圖1　氯霉素對富油新綠藻生長的影響Fig.1　The effect of chloramphenicol on the growth of Neochloris oleoabundans

從圖1可見,沒有抗生素影響的對照組,富油新綠藻在第4 d已經(jīng)到達生長階段的穩(wěn)定期,用第4 d的細胞生長數(shù)據(jù)分析抗生素抑制濃度,得到藻細胞濃度與抗生素濃度關(guān)系曲線。

擬合所得的富油新綠藻對氯霉素敏感性曲線表達式為:

Y=2.997-0.005 X,R2=0.9974

式(2)

取Y=1/2Y0=1.53求得半抑制濃度為,X1/2=119 μg/mL,即氯霉素對富油新綠藻的半抑制濃度為119 μg/mL。

2.1.2富油新綠藻固體培養(yǎng)下對氯霉素的敏感性固體培養(yǎng)條件下,富油新綠藻對氯霉素的敏感性見圖2。結(jié)果表明,低濃度氯霉素對于富油新綠藻抑制效果不明顯,當濃度達到100 μg/mL時,固體平板上沒有藻落長出,富油新綠藻的生長完全被抑制。

圖2　固體培養(yǎng)富油新綠藻對氯霉素敏感性Fig.2　The sensitivity of chloramphenicol on Neochloris oleoabundans grown on solid medium 注:從左至右濃度依次為 0、10、25、100、500 μg/mL。圖4、圖6、圖8同。

2.2富油新綠藻對青霉素的敏感性

2.2.1富油新綠藻液體培養(yǎng)下對青霉素的敏感性青霉素敏感性實驗結(jié)果見圖3,從圖3中可見,青霉素對富油新綠藻生長有一定的抑制作用,隨著青霉素濃度的增加抑制作用更加明顯。但是與氯霉素相比,青霉素的抑制作用比較溫和,氯霉素濃度為100 μg/mL時對富油新綠藻的生長就表現(xiàn)為出較為明顯的抑制,而青霉素只有在500 μg/mL的濃度下才表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

圖3　青霉素對富油新綠藻量生長的影響Fig.3　The effect of penicillin on the growth of Neochloris oleoabundans

取富油新綠藻第4 d的生長數(shù)據(jù),得到式(3):

式(3)

由式(3)得青霉素對富油新綠藻細胞生長的半抑制濃度為164 μg/mL。

2.2.2富油新綠藻固體培養(yǎng)下對青霉素的敏感性固體培養(yǎng)條件下,富油新綠藻對青霉素的敏感性見圖4。由圖4可知,各個濃度平板上均有藻細胞長出,濃度500 μg/mL藻細胞相對于其他濃度偏少,500 μg/mL青霉素對于富油新綠藻生長具有輕微抑制,所以500 μg/mL以下的青霉素濃度對于富油新綠藻的生長沒有明顯的抑制效果。

圖4　固體培養(yǎng)富油新綠藻對青霉素敏感性Fig.4　The sensitivity of penicillin on Neochloris oleoabundans grown on solid medium

2.3富油新綠藻對鏈霉素的敏感性

2.3.1富油新綠藻液體培養(yǎng)下對鏈霉素的敏感性富油新綠藻對鏈霉素敏感性實驗結(jié)果見圖5,結(jié)果表明鏈霉素在實驗濃度范圍內(nèi)對富油新綠藻生長均有明顯的抑制作用。隨著鏈霉素濃度的增加,抑制作用越明顯。鏈霉素濃度在實驗的最低濃度10 μg/mL時就對富油新綠藻的生長產(chǎn)生了明顯的抑制,鏈霉素濃度越高,抑制作用就越強烈,當濃度≥25 μg/mL時,富油新綠藻幾乎不能生長。這說明富油新綠藻對鏈霉素很敏感。

圖5　鏈霉素對富油新綠藻生長的影響Fig.5　The effect of streptomycin on the growth of Neochloris oleoabundans

取圖5中富油新綠藻第4 d的生長數(shù)據(jù),得到式(4):

R2=0.99955

式(4)

式(4),可得鏈霉素對富油新綠藻生長量的半抑制濃度為0.25 μg/mL。

2.3.2富油新綠藻固體培養(yǎng)下對鏈霉素的敏感性固體培養(yǎng)條件下,富油新綠藻對鏈霉素的敏感性見圖6。由圖6可明顯觀察到,所選四種濃度的固體培養(yǎng)基中均無藻細胞長出,可見,鏈霉素對于富油新綠藻的生長抑制作用明顯,濃度10 μg/mL時可完全抑制富油新綠藻的生長。

圖6　固體培養(yǎng)富油新綠藻對鏈霉素敏感性Fig.6　The sensitivity of streptomycin on Neochloris oleoabundans grown on solid medium

2.4富油新綠藻對四環(huán)素的敏感性

2.4.1富油新綠藻液體培養(yǎng)下對四環(huán)素的敏感性富油新綠藻對四環(huán)素敏感性實驗結(jié)果如圖7所示,由圖7中可見,四環(huán)素對富油新綠藻生長有一定的抑制作用,隨著四環(huán)素濃度的增加抑制作用更加明顯。但是與鏈霉素相比,四環(huán)素的抑制作用比較溫和,四環(huán)素濃度為100 μg/mL時對富油新綠藻的生長表現(xiàn)為出較為明顯的抑制,而四環(huán)素只有在500 μg/mL的濃度下才表現(xiàn)出明顯的抑制作用,說明富油新綠藻可以耐受100 μg/mL以下濃度的四環(huán)素。

圖7　四環(huán)素對綠藻量生長的影響Fig.7　The effect of tetracycline on the growth of Neochloris oleoabundans

取圖7中富油新綠藻第4 d的生長數(shù)據(jù),用Origin 6.0軟件分析擬合,得到式(5)。

R2=1

式(5)

可取對照組生長量的一半Y1/2=1.84對應(yīng)的濃度作為半抑制濃度X1/2,代入式(5),可得X1/2=72 μg/mL,故四環(huán)素對富油新綠藻生長量的半抑制濃度為72 μg/mL。

2.4.2富油新綠藻固體培養(yǎng)下對四環(huán)素的敏感性固體培養(yǎng)條件下,富油新綠藻對四環(huán)素的敏感性見圖8。由圖8可知,當濃度為0和10 μg/mL時,固體平板上有藻細胞長出,濃度25和100 μg/mL時平板上有少量藻落長出,藻細胞生長明顯受到抑制,當濃度達到500 μg/mL時,沒有藻落長出,生長完全被抑制。

圖8　固體培養(yǎng)富油新綠藻對四環(huán)素敏感性Fig.8　The sensitivity of tetracycline on Neochloris oleoabundans grown on solid medium

3　討論

青霉素的主要作用是抑制細菌的細胞壁的合成,會使細胞壁缺損,抗?jié)B透壓能力降低,引起細菌細胞變形、破裂而死亡。然而,由于真菌和微藻的細胞壁化學成分和結(jié)構(gòu)都有不同,青霉素對其他微生物的作用也不相同,不同微藻對青霉素的敏感性也有差異[20]。氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素也是抗生素篩選常用的抗生素,通過抑制細菌的蛋白質(zhì)合成來抑制細菌的生長。但是,同樣的抗生素對不同種類的微藻的作用也表現(xiàn)出多樣性。王逸云[18]等的研究表明,小球藻對鏈霉素不敏感,對氯霉素較敏感,當氯霉素濃度達到100 μg/mL時,已經(jīng)抑制其生長。周文禮等[21]發(fā)現(xiàn),低濃度的氯霉素和青霉素均可促進金藻的生長,隨著濃度增高,才表現(xiàn)出抑制作用。黃健等[22]對6種微藻進行了鏈霉素的敏感性分析發(fā)現(xiàn),當鏈霉素濃度低到一定程度時,對6種微藻均表現(xiàn)出一定的生長刺激作用。楊芳芳等[23]選取了3種真眼點藻和3種綠藻,分別進行氯霉素和硫酸新霉素的敏感性研究,發(fā)現(xiàn)氯霉素可以作為抗性篩選劑。在微藻對抗生素敏感性實驗方法上,固體培養(yǎng)法簡便易行,但不能像液體培養(yǎng)法一樣定量描述藻細胞的生長情況。李杰等[24]研究發(fā)現(xiàn),在不同的培養(yǎng)條件下,微藻對抗生素的敏感性有差異,因此固體培養(yǎng)條件下分析出的抗性濃度不一定適合液體培養(yǎng)。所以本實驗分別觀察了液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種條件下,富油新綠藻對四種抗生素的敏感性。本研究中,液體培養(yǎng)條件下氯霉素濃度為100 μg/mL時,富油新綠藻生長未完全被抑制,但是固體培養(yǎng)條件下相同濃度的氯霉素完全抑制了細胞在培養(yǎng)平板中長出。

從研究結(jié)果可以看出,在液體培養(yǎng)條件下,四種抗生素對富油新綠藻的生長均有抑制作用,但是該藻種對各種抗生素的敏感性存在差異,敏感程度為:鏈霉素>四環(huán)素>氯霉素>青霉素。其中鏈霉素作用最為明顯,其次為氯霉素和四環(huán)素,在液體培養(yǎng)條件下,適當?shù)目刂坡让顾睾退沫h(huán)素的濃度,可以在殺滅細菌的同時保持富油新綠藻的正常生長。在固體培養(yǎng)的條件下,鏈霉素濃度為10 μg/mL抑制作用明顯,氯霉素和四環(huán)素沒有表現(xiàn)出明顯的抑制效果,故

固體培養(yǎng)條件下,氯霉素和四環(huán)素也可作為抑制劑使用。鏈霉素對富油新綠藻抑制作用明顯,在富油新綠藻基因工程領(lǐng)域中,可以作為轉(zhuǎn)基因操作時用于抗性篩選的抗生素。

4　結(jié)論

在液體培養(yǎng)條件下,氯霉素、青霉素、鏈霉素和四環(huán)素對富油新綠藻生長都有抑制作用,4種抗生素對富油新綠藻的半抑制濃度分別為:119、164、0.25、72 μg/mL。鏈霉素抑制力最強,當濃度為10 μg/mL時富油新綠藻生長完全被抑制。在固體培養(yǎng)條件下,鏈霉素的完全抑制濃度為10 μg/mL,氯霉素和四環(huán)素的完全抑制濃度為100 μg/mL,但是青霉素卻沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

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Research on the sensitivity ofNeochlorisoleoabundansto four antibiotics

ZHANG Xi,LI Yan-qun*,LU Shao-xia,ZHONG Min,HU Xue-qiong,YANG Qing-feng,YANG Hui-min

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of quatic Products of Guangdong Higher Education Institution,College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

In order to study the sensitivity of theNeochlorisoleoabundansto cloramphenicol,penicillin,streptomycin and tetracycline,the growth of algal cells was observed in the media with the antibiotics at the concentrations of 10,25,100 and 500 μg/mL under liqid culture and agar medium plates. The results revealed that all these four kinds of antibiotics could inhibit the growth of alga cells. Among the four antibiotics,streptomycin had a severe inhibition to the alga growth as the completely inhibiting concentration was 10 μg/mL,while the inhibition concentrations of chloramphenicol and tetracycline were 100 μg/mL. However,penicillin behaved inhibition only when the concentration of it reached to 500 μg/mL. The data analysis showed that the half inhibitory concentrations of streptomycin,tetracycline,cloramphenicol and penicillin were 0.25,72,119 and 164 μg/mL respectively. Under solid culture,the inhibition concentrations of streptomycin,chloramphenicol and tetracycline were 10,100 and 100 μg/mL respectively,while penicillin behaved no significant inhibition effection on the alga growth.

Neochlorisoleoabundans;antibiotic;microalgae;sensitivity

2016-01-06

張茜(1989-),女,碩士研究生,研究方向:海洋生物活性物質(zhì)研究,E-mail:493605980@qq.com。

李雁群(1963-),男,博士,教授,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:liyq2004@126.com。

廣東省國際合作項目(2011B050400027);廣東海洋大學引進人才啟動項目(1112096)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0154-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.022