腸道微生物體外發(fā)酵模型研究進(jìn)展及其在食品中的應(yīng)用

支梓鑒,俞邱豪,程　煥,陳健樂,葉興乾,陳士國

(浙江大學(xué),生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

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腸道微生物體外發(fā)酵模型研究進(jìn)展及其在食品中的應(yīng)用

支梓鑒,俞邱豪,程煥,陳健樂,葉興乾,陳士國*

(浙江大學(xué),生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

隨著分子微生態(tài)學(xué),特別是高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,人們對(duì)腸道微生物的作用有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。腸道不僅是消化吸收的場(chǎng)所,其微生物菌群現(xiàn)更被認(rèn)為是一個(gè)高度特異化的“器官”,其代謝活力直接影響人體的健康。但直接對(duì)人體或動(dòng)物模型腸道內(nèi)容物取樣進(jìn)行研究,操作復(fù)雜且有悖道德倫理,因此近來體外腸道發(fā)酵模型成為研究熱點(diǎn),為此類研究提供了一個(gè)新的可行性途徑。本文綜述了體外發(fā)酵模型的研究進(jìn)展及其在食品功能研究中的部分應(yīng)用,并結(jié)合相關(guān)高通量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展提出展望,以期為腸道微生物或食品代謝等相關(guān)研究提供一定的參考依據(jù)。

腸道微生物,體外發(fā)酵模型,高通量測(cè)序

人體腸道菌群是高度復(fù)雜多樣性的微生物菌落,其數(shù)量眾多、種類豐富,廣泛參與人體多種生理活動(dòng),對(duì)人體健康起著至關(guān)重要的作用[1-4]。正常成年人腸道微生物主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門和疣微菌門[5],其中,擬桿菌門和梭桿菌門參與分解代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸鹽,抑制炎癥和結(jié)腸癌;雙歧桿菌、乳酸桿菌可合成部分維生素,促進(jìn)腸道蠕動(dòng),抑制致病菌生長(zhǎng);真桿菌和一些梭菌代謝產(chǎn)生次級(jí)膽酸,提高膽固醇含量,具有誘變和致癌作用[6]。同時(shí),近些年研究表明,人體腸道不僅負(fù)責(zé)食物加工,而且其微生物菌群與心情、免疫、肥胖、糖尿病、大腸癌、心腦血管疾病等有著密切關(guān)系[3-4,7]。

目前,腸道微生物生物組成和多樣性評(píng)價(jià)主要集中于利用宏基因組學(xué)等方法檢測(cè)糞便樣品,但這僅代表了遠(yuǎn)端大腸的菌群特征。然而這些研究并未提供深入探討動(dòng)態(tài)微生物進(jìn)程和腸道特定位置功能或消化性能的信息。體外發(fā)酵模型從簡(jiǎn)單的厭氧環(huán)境中糞便微生物的批量發(fā)酵到復(fù)雜的一級(jí)或多級(jí)連續(xù)發(fā)酵模型,為其逐步演變?yōu)榭茖W(xué)研究提供了更多可能。體外發(fā)酵模型是研究大量底物篩選的有效工具,其中包括膳食組分、藥物和有毒或放射性組分,同時(shí)也可對(duì)腸道微生物環(huán)境的變化進(jìn)行測(cè)定。模型的主要目的是在可控條件下培育復(fù)雜腸道微生物菌群,用于微生物調(diào)控和代謝的相關(guān)研究。目前,有關(guān)體外發(fā)酵模型和腸道微生物的相關(guān)研究已成為食品領(lǐng)域的新熱點(diǎn),但還比較薄弱,需要進(jìn)一步深入研究。本文就國內(nèi)外目前經(jīng)典的體外腸道模型及其發(fā)展和應(yīng)用進(jìn)行綜述,旨在加快該領(lǐng)域的發(fā)展。

表1　體外發(fā)酵模型特定及其局限性Table 1　The characteristics and limitations of in vitro fermentation models

1　體外發(fā)酵模型

從單一發(fā)酵罐到多相連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng),體外發(fā)酵模型的設(shè)計(jì)和復(fù)雜性隨著接種技術(shù)的發(fā)展而不斷升級(jí)[8-11]。模型均需特定的時(shí)間使完整的微生物菌群處于穩(wěn)定狀態(tài),因此需根據(jù)研究目標(biāo)進(jìn)行不同的選擇,其中,模型種類、特點(diǎn)及其局限性如表1所示。

1.1批式發(fā)酵模型

批式發(fā)酵是單一或混合細(xì)菌懸浮液在特定選擇培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵,期間不再添加新的營(yíng)養(yǎng)物,且模型一般為密封瓶子或反應(yīng)器,保證其厭氧環(huán)境。此模型具有簡(jiǎn)單、易操作和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。然而,在實(shí)驗(yàn)過程中,微生物發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致短鏈脂肪酸產(chǎn)生并積累,從而造成發(fā)酵系統(tǒng)中pH的改變,影響發(fā)酵正常進(jìn)行。系統(tǒng)中微生物的生長(zhǎng)主要依靠接種濃度和底物消耗速率控制。低細(xì)胞濃度接種的系統(tǒng)呈現(xiàn)出典型的S-型生長(zhǎng)曲線,發(fā)酵前期存在豐富營(yíng)養(yǎng)物,隨后營(yíng)養(yǎng)物被消耗,同時(shí)產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物積累,生長(zhǎng)受到抑制。微生物菌群的評(píng)價(jià)和微生物代謝調(diào)控等復(fù)雜性實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)性的底物補(bǔ)給,否則,發(fā)酵時(shí)間會(huì)大大縮短，從而抑制體外穩(wěn)定條件的形成。因此,此模型僅適用于短期發(fā)酵的相關(guān)研究,以及底物對(duì)腸道微生物生理和生物多樣性的影響。如抗性淀粉和果聚糖等碳水化合物是否具有益生元潛力[12-13],以及食物組分被腸道微生物作用時(shí)短鏈脂肪酸短期代謝情況研究[14]。

1.2連續(xù)發(fā)酵模型

連續(xù)發(fā)酵模型克服了批式發(fā)酵模型的一些弱點(diǎn),通過連續(xù)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)底物,同時(shí)轉(zhuǎn)移有毒代謝產(chǎn)物,達(dá)到延長(zhǎng)微生物發(fā)酵時(shí)間的目的。連續(xù)發(fā)酵模型分為單相和多相連續(xù)發(fā)酵模型,其中,單相發(fā)酵模型能夠較好模擬盲腸和升結(jié)腸的消化情況,因此常被用于闡明近端結(jié)腸功能和代謝活力[9]。

然而,人體腸道環(huán)境是一個(gè)多相環(huán)境,分為升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸三個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域在代謝活力和微生物組成上均存在差異。因此,多相連續(xù)發(fā)酵模型設(shè)置不同反應(yīng)器模擬腸道不同階段,能更準(zhǔn)確模擬腸道生態(tài)環(huán)境。Macfarlane等[15]開發(fā)出三相發(fā)酵模型,如圖1所示,圖中Vessel 1、Vessel 2和Vessel 3三個(gè)恒化器串聯(lián)模擬近端、橫向、遠(yuǎn)端結(jié)腸區(qū)域,其體積分別為0.22、0.32和0.32 L,pH分別為5.5、6.6和6.8,系統(tǒng)溫度維持在37 ℃,且充入CO2保持厭氧環(huán)境。整體系統(tǒng)參數(shù)按照人體生理情況進(jìn)行設(shè)定,實(shí)現(xiàn)發(fā)酵在空間、時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)和理化特性上的準(zhǔn)確性和合理性。此外,微生物接種液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵模型過程中的適應(yīng)、生長(zhǎng)和增殖均要依靠環(huán)境參數(shù),如pH、保留時(shí)間、溫度、厭氧環(huán)境和介質(zhì)流速,因此實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制參數(shù)是構(gòu)建微生物組成和代謝活力穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。

圖1　三相發(fā)酵模型示意圖Fig.1　Schematic diagram of the three-stage fermentation model

圖2　五相發(fā)酵模型示意圖Fig.2　Schematic diagram of the five-stage fermentation model

1993年,Molly等[16]開發(fā)SHIME(The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)模型。它是一個(gè)五相發(fā)酵模型,包含五部分組件,分別模擬了食物經(jīng)過上消化道(胃部、小腸)和下消化道(升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸)整個(gè)過程。整個(gè)SHIME反應(yīng)器應(yīng)在37 ℃進(jìn)行工作,反應(yīng)器均為雙層夾套的玻璃容器,且通過磁力攪拌進(jìn)行混合溶液。研究人員需每天添加3次營(yíng)養(yǎng)液至胃室,胰液和膽汁至小腸室。在胃和小腸室內(nèi)消化的基礎(chǔ)上,懸浮液在泵作用下抽入升結(jié)腸容器進(jìn)行結(jié)腸消化。消化液在反應(yīng)器中的保留時(shí)間可根據(jù)研究目的通過改變流速進(jìn)行調(diào)整,胃室、小腸室、升結(jié)腸室、橫結(jié)腸室、降結(jié)腸室反應(yīng)體積分別為0.2、0.3、0.7、1.3、0.8 L,保留時(shí)間分別為2、6、18、36、22 h,pH分別為2、6.8、5.6～5.9、6.1～6.4和6.6～6.9。同時(shí),整個(gè)模型通過頂端空間充入氮?dú)饣騈2/CO2(9∶1)來維持厭氧環(huán)境。

粘膜微生物是腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,它與腔內(nèi)微生物在菌群組成上存在本質(zhì)區(qū)別,且定居于腸道上皮細(xì)胞的粘液,因此,粘膜微生物對(duì)調(diào)節(jié)腸道健康有更高效能[17]。Abbeele等發(fā)現(xiàn)柔嫩梭菌(aecalibacterium prausnitzii)的存在能夠抑制克羅恩病的發(fā)生[17]和術(shù)后復(fù)發(fā)[18]。隨后,Abbeele等[19]通過黏蛋白覆蓋微生物群來模擬粘膜微生物群落,梭狀芽孢桿菌IV和XIVa產(chǎn)生大量丁酸并轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸細(xì)胞,加強(qiáng)細(xì)胞間連,提高腸道屏障功能。同時(shí),研究表明,M-SHIME模型能夠維持個(gè)體微生物群落中粘膜微生物組成特有屬性。

此外,為解決發(fā)酵過程中系統(tǒng)游離細(xì)胞不易控制等問題,細(xì)胞固定化技術(shù)與連續(xù)發(fā)酵聯(lián)用以期達(dá)到持久發(fā)酵等目的,其中,應(yīng)用最為廣泛固定化技術(shù)的是多孔糖基質(zhì)固定化。固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)液后,受到底物和產(chǎn)物擴(kuò)散的限制,能夠在糖基質(zhì)上形成高細(xì)胞密度層(1010～5×1011),隨后細(xì)胞釋放在培養(yǎng)液中,并維持高細(xì)胞活力。研究發(fā)現(xiàn)[20],細(xì)胞固定化發(fā)酵過程中,乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)游離細(xì)胞發(fā)酵,同時(shí),可防止長(zhǎng)期連續(xù)發(fā)酵時(shí)沖洗現(xiàn)象,減少污染敏感性和噬菌體攻擊,增強(qiáng)質(zhì)粒穩(wěn)定性,防止細(xì)胞受到磁力攪拌剪切力影響。因此,Cinquin等[11]利用固定化的糞便微生物模擬腸道發(fā)酵,固定化復(fù)合糞便微生物模型能快速達(dá)到系統(tǒng)平衡,維持高細(xì)胞密度,并能利用預(yù)固定化基質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)實(shí)驗(yàn),同時(shí)可通過修飾細(xì)菌生理參數(shù)改善腸道模型。

1.3自動(dòng)化發(fā)酵模型

隨著科技的快速發(fā)展,計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)推動(dòng)了發(fā)酵模型的進(jìn)一步發(fā)展。Minekus等[21]開發(fā)出一項(xiàng)新型電腦控制的腸道發(fā)酵模型——TIM-2模型，如圖3所示。發(fā)酵裝置主要由四部分相互連接的玻璃腔室(a)組成,每個(gè)腔室內(nèi)部均有一個(gè)彈性薄膜。在玻璃夾套和彈性膜之間泵入37 ℃水維持恒溫環(huán)境,通過改變泵入水壓造成彈性膜壓縮或舒張來模擬腸道蠕動(dòng),同時(shí)形成蠕動(dòng)波推動(dòng)食糜內(nèi)容物在環(huán)形體系中移動(dòng)。TIM-2模型系統(tǒng)pH由pH電極(b)在線監(jiān)測(cè),并通過添加1 mol/L NaOH(c)中和微生物產(chǎn)生的酸性物質(zhì)控制pH恒定在5.8左右。為防止代謝產(chǎn)物累積造成微生物菌群生長(zhǎng)抑制或死亡,系統(tǒng)配備一個(gè)由中空纖維膜構(gòu)成的透析系統(tǒng)(d),它能夠截留50000 u的分子,穩(wěn)定模型中微生物代謝產(chǎn)物的生理濃度,如短鏈脂肪酸生理濃度為80～120 mmol/L,從而維持系統(tǒng)3周的微生物活力。隨著透析液和食物的攝入和增加,系統(tǒng)體積不斷增加,當(dāng)達(dá)到一定體積后,水平檢測(cè)器(e)激活排出閥,維持內(nèi)容物體積在120 mL左右的水平。此外,系統(tǒng)持續(xù)吹入氮?dú)?f)保證厭氧環(huán)境,加之微生物活力,使得系統(tǒng)氧化還原電位穩(wěn)定在300 mV左右。實(shí)驗(yàn)過程中,可通過取樣口(g)或回收透析液(d)進(jìn)行取樣。該模型的優(yōu)點(diǎn)是存在蠕動(dòng)和透析系統(tǒng)以維持代謝產(chǎn)物的生理濃度和正常濃度下的高微生物活性,同時(shí),可改變單參數(shù)研究對(duì)微生物代謝活力的影響。但TIM-2模型僅動(dòng)態(tài)模擬了大腸發(fā)酵的環(huán)境,為了達(dá)到更好的模擬效果,該模型可與TIM-1模型連用,模擬整個(gè)人體消化道生理環(huán)境。

圖3　TIM-2示意圖Fig.3 Schematic diagram of TIM-2 注:(a)蠕動(dòng)室；(b)pH電極；(c)堿液泵；(d)含有中空纖維膜的透析液回路；(e)水平檢測(cè)器；(f)N2入口；(g)取樣口；(h)氣體出口；(i)回腸流出液集中室；(j)溫度檢測(cè)器。

SIMGI(SIMulator Gastro-Intestinal)也是一個(gè)體外自動(dòng)化發(fā)酵模型,通過內(nèi)置編程軟件的操作板控制動(dòng)態(tài)模擬從胃、小腸消化到大腸發(fā)酵、生物代謝轉(zhuǎn)換等完整生理過程[22]。其中,升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸pH分別為5.6±0.2、6.3±0.2和6.8±0.2,體積分別為250、400和300 mL。發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液包含阿拉伯半乳聚糖(1 g/L)、蘋果果膠(2 g/L)、木聚糖(1 g/L)、土豆淀粉(3 g/L)、葡萄糖(0.4 g/L)、酵母提取物(3 g/L)、蛋白胨(1 g/L)、黏蛋白(4 g/L)、L-半胱氨酸(0.5 g/L)。該模型的主要優(yōu)點(diǎn)是靈活性的組件和自控化控制參數(shù)模擬生理?xiàng)l件,同時(shí)具有胃和小腸排空功能,但模型需14 d的穩(wěn)定周期后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。同樣,模型缺少腸道菌群與宿主間的相互作用,可嘗試將上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模擬腸道生理環(huán)境。

圖4　SIMGI模型示意圖Fig.4　Schematic diagram of the SIMGI

2　體外消化模型在食品中的應(yīng)用

2.1食品組分對(duì)腸道微生物菌群變化的研究

人體腸道菌群種類復(fù)雜、數(shù)量豐富,高達(dá)1013～1014,超過人體細(xì)胞總數(shù)10倍,所編碼的基因是人類基因組的150倍以上[1-2]。腸道微生物與其代謝產(chǎn)物在人體能量代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、先天和獲得性免疫、胃腸道功能等方面發(fā)揮主要作用[23]。此外,腸道微生物菌群的組成易受年齡、體重、性別、飲食[24]等因素影響,因而不同人群的腸道菌群表現(xiàn)出個(gè)體差異性。Kemperman等[25]利用SHIME模型研究了紅茶和葡萄酒中酚類物質(zhì)對(duì)腸道微生物的影響,研究發(fā)現(xiàn),兩種酚類提取物均可選擇性抑制腸道致病菌,且能夠使厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)比例發(fā)生變化。紅茶酚類提取物刺激克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸球菌(Enterococci)和Akkermansia生長(zhǎng),抑制雙歧桿菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、食物谷菌屬的生長(zhǎng);葡萄酒中酚類物質(zhì)能夠促進(jìn)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、Alistipes、Cloacibacillus和Victivallis的生長(zhǎng),減少雙歧桿菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、Subdoligranulum和擬桿菌門(Bacteroidetes)的數(shù)量。但Parker等[26]則認(rèn)為對(duì)腸道微生物起調(diào)節(jié)作用的是酚類物質(zhì)的代謝物,而非多酚本身。Abbeele等[27]利用SHIME模型和TIM-2模型研究長(zhǎng)鏈阿拉伯木聚糖和菊粉的發(fā)酵方式的區(qū)別,實(shí)驗(yàn)證明,長(zhǎng)鏈阿拉伯木聚糖和菊粉能夠分別增加丙酸和丁酸代謝產(chǎn)物的含量,阿拉伯木聚糖促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)生長(zhǎng),而菊粉選擇性促進(jìn)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)。此外,Kortman等[28]研究了利用體外模型鐵補(bǔ)充劑對(duì)腸道微生物代謝的影響,研究表明,鐵離子的補(bǔ)充會(huì)造成雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)和乳酸菌科(Lactobacillaceae)水平降低,羅斯氏菌屬(Roseburia)和普雷沃菌屬(Prevotella)水平升高,代謝產(chǎn)生的支鏈脂肪酸和氨的含量顯著增加,同時(shí),在富含鐵條件下,其代謝液對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性增加。

2.2腸道微生物對(duì)功能因子代謝酵解研究

膳食中的功能多糖和多酚類物質(zhì)等在進(jìn)入腸道后,易受到腸道微生物作用而發(fā)生一定的代謝降解,進(jìn)而發(fā)揮生理功能。Hu等[29]利用體外發(fā)酵模型研究車前子多糖在大腸酵解中的變化,結(jié)果表明,以乙酸、丙酸和正丁酸為主要組成成分的短鏈脂肪酸總量隨酵解時(shí)間的增加而增加,其中,乙酸和正丁酸的增加主要是由于車前子多糖中葡萄糖醛酸和木糖的酵解,而丙酸的增加主要是由于多糖中阿拉伯糖和木糖的酵解。同樣,Min等[30]發(fā)現(xiàn)青錢柳葉多糖在體外模型酵解過程中短鏈脂肪酸含量增加,多糖被部分酵解,與半乳糖醛酸相連的糖苷鍵更容易被腸道微生物攻擊。Gonthier等[31]利用批量發(fā)酵模型研究綠原酸的降解路徑,綠原酸的酯鍵在腸道微生物作用下發(fā)生水解,并通過脫羧反應(yīng)、雙鍵還原反應(yīng)或去羥基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為乙基兒茶素或3-羥基苯甲酸,后經(jīng)β-氧化形成苯甲酸。

3　展望

3.1體外腸道發(fā)酵模型的接種和重現(xiàn)性

盡管存在多種體外發(fā)酵模型的組合設(shè)計(jì),但仍然存在許多挑戰(zhàn)和局限制約著這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。體外模型中腸道微生物的重現(xiàn)性和功能穩(wěn)定性頻受質(zhì)疑,模型穩(wěn)定性主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)微生物組分和代謝活力的影響,而并非腸道微生物對(duì)模擬腸道環(huán)境的適應(yīng)能力。在環(huán)境因素和初始菌種多樣性等條件下,系統(tǒng)在接種和增殖后腸道微生物會(huì)形成新的平衡。近幾年研究發(fā)現(xiàn),利用腸芯片技術(shù)檢測(cè)TIM-2和SHIME模型中微生物分布,細(xì)菌比例會(huì)產(chǎn)生明顯差異[8,32]。嚴(yán)格、可重復(fù)性的糞便收集過程在發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用,其能夠保證接種液新鮮度,并決定其在腸道中的增殖速率。模型中菌種還受到連續(xù)取樣等因素影響而發(fā)生不斷變化,也易造成生物重現(xiàn)性差等現(xiàn)象。因此,開發(fā)出在線可控腸道微生物模型,嚴(yán)格準(zhǔn)確監(jiān)控模型參數(shù)至關(guān)重要。

3.2功能穩(wěn)定的體外腸道發(fā)酵模型的“組學(xué)”分析

蛋白質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)已成功發(fā)掘了腸道菌群發(fā)酵過程(體內(nèi)及原位)中復(fù)雜的交互作用及其代謝的主要途徑,但是對(duì)體外菌群的發(fā)酵機(jī)制的研究仍不清楚[33-35]。目前,“組學(xué)”技術(shù)在體外發(fā)酵模型中的應(yīng)用僅局限于利用微陣列技術(shù)或SIP技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析[8,32,36]。SIP技術(shù)應(yīng)用于微生物代謝中,用13C標(biāo)記底物追蹤菌群代謝中某一物質(zhì)的路徑[37-38]。宏基因組學(xué)研究技術(shù)在各種實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)特定的人體腸道菌群潛在的基因進(jìn)行分類,表明組學(xué)技術(shù)可用于研究人體腸道菌群[39-40]。盡管宏基因組分析技術(shù)能夠提供菌群潛在的基因,但并不代表具有此類基因的菌群具有相應(yīng)的功能。環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)方面的研究進(jìn)展提高了識(shí)別基因表達(dá)所引起功能變化的能力[34,41]。然而,由于翻譯后調(diào)控等機(jī)制的存在,環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)所研究出來的結(jié)果并不能明確的說明mRNA豐度與其轉(zhuǎn)錄出的蛋白活性有直接的關(guān)系。從復(fù)雜的生物樣品中提取、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)等方法上的缺陷仍阻礙著人類腸道菌群功能相關(guān)的蛋白組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展[42]。代謝和細(xì)胞內(nèi)的生化過程產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物,并被分配給腸道內(nèi)特定菌群供其發(fā)揮功能,這可能由代謝組學(xué)技術(shù)來闡明此類研究[43-44]。人體腸道微生物作用下的酚類代謝研究就是利用蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)識(shí)別菌群和代謝間交互作用的重要例子。同時(shí),鑒于薈萃分析技術(shù)的研究進(jìn)展,生物信息學(xué)領(lǐng)域面臨的最大挑戰(zhàn)可能在于建立完善的基因數(shù)據(jù)庫,發(fā)明更快、更簡(jiǎn)單的分析方法用以分析來自于高通量測(cè)序和代謝組學(xué)分析腸道微生物相關(guān)信息所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)。

3.3體外模型的應(yīng)用展望

闡明人類腸道菌群在體外模型中的調(diào)控機(jī)制和代謝概況需要“組學(xué)”為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。多學(xué)科系統(tǒng)研究法結(jié)合“組學(xué)”技術(shù)將促成新的研究系統(tǒng)去推動(dòng)復(fù)雜微生物和宿主因素對(duì)人類腸道微生物功能性相關(guān)研究。體外腸道發(fā)酵模型無法有效模擬宿主響應(yīng)是目前面臨的主要技術(shù)難題,但宿主應(yīng)答可通過體外酵解模型和體外小腸細(xì)胞模型結(jié)合來實(shí)現(xiàn),如Caco-2細(xì)胞[45]。未來體外發(fā)酵模型系統(tǒng)還應(yīng)涉及“患病者”微生物群的建立和穩(wěn)態(tài),使其便于進(jìn)行炎性腸疾病中腸道微生物功能性的研究,如克羅恩疾病和潰瘍性結(jié)腸炎,且目前這些疾病病理學(xué)研究主要集中在復(fù)雜的免疫系統(tǒng)功能[46]。基于體外模型的不斷發(fā)展,也可促進(jìn)免疫系統(tǒng)之外疾病的相關(guān)研究,同時(shí)關(guān)于腸道微生物的研究為“人體腸道系統(tǒng)生物學(xué)”方法提供了新的契機(jī)。

4　結(jié)論

體外發(fā)酵模型是一種創(chuàng)新技術(shù)平臺(tái),其最大優(yōu)點(diǎn)能夠表現(xiàn)出優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)性能,同時(shí)不受人類道德約束。但大量體外發(fā)酵模型僅模擬了宿主部分腸功能,且微生物菌群平衡仍然是面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。然而,在實(shí)驗(yàn)中宿主機(jī)能不能被完全忽略,因此可結(jié)合人體腸道細(xì)胞提供宿主應(yīng)答等信息,為體外研究提供更加準(zhǔn)確的結(jié)果。鑒于更準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)體內(nèi)研究結(jié)果,必須結(jié)合體外和體內(nèi)模型進(jìn)行結(jié)果互補(bǔ),這樣不僅能加強(qiáng)體外模型的整體有效性,同時(shí)可區(qū)分腸道微生物與人體間的功能關(guān)系。目前,我國學(xué)者在體外腸道模擬研究腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能領(lǐng)域的研究相對(duì)較少,歸根到底是模型建立存在一定問題,因此,進(jìn)一步完善和開發(fā)體外腸道模型,在線精確控制進(jìn)程參數(shù)等工作亟需加強(qiáng)。此外,利用體外模型相關(guān)實(shí)驗(yàn),不能僅停留在表觀微生物改變和代謝產(chǎn)物的變化,梳理酵解過程中食品成分結(jié)構(gòu)變化及相關(guān)機(jī)理才是未來發(fā)現(xiàn)的新方向。

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Advances ininvitrofermentation model of gut microbiota and its applications in food

ZHI Zi-jian,YU Qiu-hao,CHENG Huan,CHEN Jian-le,YE Xing-qian,CHEN Shi-guo*

(College of Biosystems Engineering and Food Science,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang Key Laboratory for Agro-food Processing,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

With the rapid development of molecular microbial ecology,especially high-throughput sequencing technology,people have a better understanding of gut microbial communities. Intestinal is more than a place of digestion and absorption of food component,and the gut microbiota inside is even regarded as a highly specialized organ whose metabolic activity has a direct impact on human health. However,direct sampling from human or animal model is complex and contrary to ethics. Thus,invitrogut fermentation model presents a novel system for relevant research. This paper summarized the advances ininvitrofermentation models and their applications in functional food research,and proposes the forecast combined with the high-throughput sequencing technology,aiming to provide valuable references for in-depth study on gut microorganism and the metabolism of food.

gut microbiota;invitrogut fermentation model;high-throughput sequencing technology

2016-01-06

支梓鑒(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：zhizijian8866@163.com。

陳士國(1982-)，男，副教授，研究方向：糖化學(xué)和糖生物學(xué)，E-mail：chenshiguo210@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31301417)；浙江省公益項(xiàng)目(2014C32G2010026)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0353-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.062