乳酸菌胞外多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)解析

王榮平,圖布興吉雅,郝　娜,李相沂,烏云達(dá)來(lái)

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

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乳酸菌胞外多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)解析

王榮平,圖布興吉雅,郝娜,李相沂,烏云達(dá)來(lái)*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

乳酸菌胞外多糖具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性,對(duì)其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究并闡明結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要的意義。本文介紹了乳酸菌胞外多糖的分類及組成,針對(duì)目前胞外多糖的分離純化方法、理化性質(zhì)測(cè)定方法、結(jié)構(gòu)鑒定方法進(jìn)行了詳細(xì)描述,并對(duì)今后胞外多糖的研究?jī)?nèi)容和研究方向進(jìn)行了展望。

乳酸菌,胞外多糖,分離純化,理化性質(zhì),結(jié)構(gòu)鑒定

許多乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中向細(xì)胞外分泌長(zhǎng)鏈多糖聚合物,稱為胞外多糖(Exopolysaccharides,EPSs)。根據(jù)多糖和菌體的依附關(guān)系,EPSs可分為黏液多糖(slim polysaccharides)和莢膜多糖(Capsular polysaccharides,CPSs)[1],黏液多糖是指形成黏液層松散的附著于菌體表面或分泌到菌體所處環(huán)境中的多糖,莢膜多糖與黏液多糖結(jié)構(gòu)類似,但形成莢膜長(zhǎng)久緊密地結(jié)合在菌體表面[2-3]。乳酸菌作為益生菌,具有免疫調(diào)節(jié)、抑制胃腸道病原菌等多種生物活性[4],其所產(chǎn)EPSs因來(lái)源安全、類型多樣、性能優(yōu)異等特點(diǎn)受到人們的廣泛關(guān)注。乳酸菌EPSs可作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、膠凝劑等應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)[5]。此外,研究發(fā)現(xiàn)EPSs還具有改善腸道微生態(tài)[6]、抗腫瘤[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、降低血液膽固醇[9]等生物活性。因此,對(duì)乳酸菌EPSs進(jìn)行分離純化,明確其理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu),為解析EPSs結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)EPSs產(chǎn)品奠定基礎(chǔ),具有重要的意義。本文從乳酸菌EPSs的分類及組成,當(dāng)前乳酸菌EPSs的分離純化方法、理化性質(zhì)測(cè)定方法、初級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定方法等幾個(gè)方面進(jìn)行闡述,并簡(jiǎn)單介紹了計(jì)算機(jī)程序(CASPER)在乳酸菌EPSs結(jié)構(gòu)鑒定方面的應(yīng)用,最后對(duì)今后乳酸菌EPSs的研究?jī)?nèi)容和研究方向進(jìn)行了展望。

1　乳酸菌胞外多糖的分類及組成

乳酸菌分泌的EPSs在組成、結(jié)構(gòu)、分子量和空間構(gòu)象等方面都不相同[10]。但根據(jù)單糖組成和生物合成途徑分為兩類[11]:同多糖(Homopolysaccharides,HoPS)和雜多糖(Heteropolysaccharides,HePS)。HoPS由同一種類型的單糖組成的重復(fù)單元構(gòu)成,有四種類型[12]:α-D-葡聚糖(α-D-glucans),如腸膜明串珠菌亞種(L.mesenteroidessubsp.Mesenteroides,L.mesenteroidessubsp.dextranicum)等合成的右旋糖酐(dextrans),主鏈由α-1,6糖苷鍵連接,在2,3,4位有不同程度的分支[13]。β-D-葡聚糖(β-D-glucans),由β-1,3鍵連接的葡萄糖主鏈和β-1,2鍵連接的側(cè)鏈構(gòu)成,如可得然膠(curdlan)為直線型的中性葡聚糖,僅含β-1,3糖苷鍵,無(wú)分支或取代基[14]。果聚糖(fructans),鏈球菌屬(S.salivarius,S.mutans)、明串珠菌屬(L.mesenteroides),乳桿菌屬(L.sanfranciscensis,L.reuteri)等可產(chǎn)生果聚糖(Levan),主鏈由β-2,6糖苷鍵連接,側(cè)鏈由β-2,1糖苷鍵連接[15]。其它,如半乳聚糖(polygalactan),由結(jié)構(gòu)相同的重復(fù)單元(不同糖苷鍵連接)構(gòu)成,有時(shí)有分支,單糖為α-D-半乳糖或β-D-半乳糖[12]。同多糖的分子量很大,可達(dá)107u[12]。

表1　一些常見(jiàn)乳酸菌產(chǎn)生的雜多糖Table 1　Heteropolysaccharides produced by some common strains of lactic acid bacteria

注:a:Glc:葡萄糖;Fru:果糖;Gal:半乳糖;Man:甘露糖;Rha:鼠李糖;ManNAc:N-乙酰基-D-甘露糖胺;b:p:吡喃糖;f:呋喃糖;c CASPER:常規(guī)多糖的計(jì)算機(jī)輔助光譜評(píng)估。

HePS由兩種或兩種以上不同類型的單糖組成的重復(fù)單元構(gòu)成,重復(fù)單元從三聚糖到八聚糖不等,單糖主要是D-葡萄糖、D-半乳糖及L-鼠李糖,在不同菌種產(chǎn)生的HePS中的比例不同,有的只含其中的一種或兩種[2-16]。有時(shí)重復(fù)單元中也會(huì)出現(xiàn)果糖、甘露糖、海藻糖、阿拉伯糖、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、糖醛酸、非糖取代基(如磷酸基、乙?；?、甘油等)等[3-17],Patten等[18]首次發(fā)現(xiàn)L.helveticussp. Rosyjski所產(chǎn)EPS含有N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)。不同乳酸菌產(chǎn)生的雜多糖在分子量、單糖組分、重復(fù)單元、取代基類型、連接鍵型、主鏈及支鏈的結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)型等方面均存在一定的差異。雜多糖的分子量在1.0×104～6.0×106u之間,小于同多糖,且其產(chǎn)量也小于同多糖[3-16]。結(jié)冷膠(gellan)、黃原膠(xanthan)、開(kāi)菲爾多糖(kefiran)是典型的雜多糖。其中,開(kāi)菲爾多糖是水溶性的雜多糖,包含大約相等比例的葡萄糖和半乳糖[19]。一些常見(jiàn)乳酸菌的HePS見(jiàn)表1。

2　乳酸菌胞外多糖的分離純化

乳酸菌EPSs分離純化操作的復(fù)雜程度取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的成分。通常操作包括離心除菌體、上清液脫除蛋白質(zhì)、沉淀分離EPSs、對(duì)EPSs進(jìn)行純化等操作。除蛋白質(zhì)時(shí),多用三氯乙酸(TCA)法、酶解法、Sevag法,或者結(jié)合使用,用TCA法除蛋白質(zhì)時(shí),應(yīng)注意pH和溫度,以減少TCA對(duì)多糖的降解;沉淀EPSs時(shí),常用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑;后期的純化包括透析、膜過(guò)濾等。多糖產(chǎn)量可用凍干得到的干粉的質(zhì)量表示或用苯酚-硫酸法[27]測(cè)定溶液中的總糖含量。此外,因有些乳酸菌能合成一種類型以上的EPSs,因此還需對(duì)EPSs進(jìn)行分級(jí)純化,常用方法有色譜法、透析法、電泳法、超濾法等[28]。色譜法中離子交換色譜法和凝膠色譜法使用最多,原理基于EPSs組分所帶電荷和分子量的不同:根據(jù)離子強(qiáng)度不同進(jìn)行初步分離,可得到電荷單一的組分,再通過(guò)分子量的不同進(jìn)行二次分離,最終得到電荷和分子量均單一的EPS。常用的離子交換劑多為纖維素陰離子交換劑,如二乙基氨基乙基(DEAE-cellulose、DEAE-Sephadex、DEAE-Sepharose)、羧甲基(CM)等,常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex G系列)、瓊脂糖凝膠(Sepharose 系列)、聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠(Sephacryl)等。Wang等[29]通過(guò)離心除菌體、終濃度4%(w/v)的TCA除蛋白、75%(v/v)乙醇4 ℃沉淀多糖、透析、凍干等操作從MRS培養(yǎng)基得到L.plantarum粗多糖r-EPS后,分別以不同濃度的NaCl溶液和去離子水為洗脫液,進(jìn)行DEAE-52和SephadexG-100層析柱洗脫,最終得到兩個(gè)組分r-EPS1和r-EPS2;Li等[30]采用類似的方法從乳清培養(yǎng)基中分離得到三種L.helveticus胞外多糖組分EPS-1、EPS-2和EPS-3;Gorska-Fraczek等[26]通過(guò)乙醇沉淀多糖,脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和蛋白酶除蛋白質(zhì)、核酸雜質(zhì)等操作從MRS培養(yǎng)基得到L.johnsonii粗EPSs,再分別以20 mmol/L Tris緩沖液和0.1 mmol/L乙酸銨緩沖液為洗脫液,進(jìn)行DEAE-Sephadex A-25和TSK HW-55S層析純化,得到一個(gè)EPS組分。但I(xiàn)barburu等[31]將半定義培養(yǎng)基發(fā)酵液離心去L.suebicus菌體后,利用乙醇對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀,得到F和P兩個(gè)EPS組分;Dilna等[32]先進(jìn)行離心去菌體、乙醇反復(fù)沉淀的操作從MRS得到L.plantarum粗EPSs,再使用苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇=25∶24∶1的溶液分級(jí)純化多糖。

獲得單一的EPS組分之后,還須鑒定其純度,因?yàn)槎嗵羌兤肥且欢ǚ肿恿糠秶木唤M分,只代表相似鏈長(zhǎng)的平均分布,其微觀也存在不均一性。常用的測(cè)定方法有超離心法、旋光測(cè)定法、電泳法、色譜法等。若多糖為純品,使用色譜法時(shí)出現(xiàn)單一的洗脫峰且峰形尖銳、對(duì)稱,電泳時(shí)得到單一斑點(diǎn)。

對(duì)EPSs進(jìn)行分級(jí)純化時(shí),色譜法分級(jí)效果要好于有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀,但EPSs的回收率低,耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣,如Wang等[29]得到的L.plantarum兩個(gè)EPS組分的回收率分別為45.2%和10.9%,Li等[30]得到的三種L.helveticusEPS組分的回收率分別為28.2%、39.5%和2.4%。在多糖純度鑒定方面,分子排阻高效液相色譜法的分辨率高于常壓凝膠過(guò)濾色譜法,可以避免常壓色譜由于分辨率低造成的高純度假象[33]。對(duì)EPSs進(jìn)行分離純化應(yīng)根據(jù)發(fā)酵液的性質(zhì)和實(shí)際情況進(jìn)行。

3　乳酸菌胞外多糖的理化性質(zhì)測(cè)定

乳酸菌EPSs的理化性質(zhì)與其生物活性密切相關(guān),因此對(duì)其理化性質(zhì)的研究也是必不可少的,EPSs的理化性質(zhì)包括純度,總糖含量,蛋白質(zhì)含量,糖醛酸含量,硫酸基含量,相對(duì)分子質(zhì)量,單糖組成,相對(duì)粘度,溶解性,對(duì)熱、酸、堿的穩(wěn)定性、電荷密度等。其中,蛋白質(zhì)含量測(cè)定主要使用考馬斯亮藍(lán)法、Folin-酚法、紫外吸收法等;糖醛酸含量測(cè)定有硫酸-咔唑法、間羥基聯(lián)苯法;硫酸基含量測(cè)定有氯化鋇-明膠比色法、鹽酸水解-硫酸鋇法等;相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定主要是色譜法,如高效液相色譜法、凝膠色譜法等;單糖組成測(cè)定主要為氣相色譜法,因單糖較難氣化,所以需將單糖衍生化,常用方法有糖腈乙酸酯衍生化法、三甲基硅醚衍生化法、糖醇乙酸酯衍生化法;乳酸菌EPSs對(duì)熱、酸、堿等的穩(wěn)定性有利于保持食品在加工過(guò)程中的穩(wěn)定性。

4　乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

4.1一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定

解析乳酸菌EPSs結(jié)構(gòu)是研究其構(gòu)效關(guān)系和結(jié)構(gòu)修飾的基礎(chǔ),沿用蛋白質(zhì)的分類方法,EPSs的結(jié)構(gòu)也可分為一、二、三、四級(jí)。一級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定包括以下內(nèi)容:糖鏈分子量、單糖組成及分子摩爾比、單糖殘基的D-型/L-型、糖環(huán)形式(呋喃環(huán)/吡喃環(huán))、單糖殘基構(gòu)型(α-/β-)、連接位置、單糖殘基間的排列順序、糖鏈中側(cè)鏈的分支點(diǎn),糖鏈與非糖部分的連接方式等。研究方法可分為物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等多種。物理學(xué)方法有紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜、液/氣相色譜、質(zhì)譜、氣質(zhì)聯(lián)用等;化學(xué)方法有酸水解、甲基化、高碘酸氧化、Smith降解等;生物學(xué)方法有酶解、免疫反應(yīng)等。以下主要介紹紅外、核磁共振和甲基化在EPSs結(jié)構(gòu)解析中的原理和應(yīng)用。

紅外光譜(Infrared Spectrum IR)分析多采用KBr壓片法,結(jié)合傅立葉變換紅外光譜進(jìn)行4000～400 cm-1范圍掃描:根據(jù)紅外光譜的“指紋性”,多糖分子中O-H和分子內(nèi)或分子間氫鍵的伸縮振動(dòng)在3600～3200 cm-1處出現(xiàn)寬而強(qiáng)的吸收峰,C-H伸縮振動(dòng)在3200～2800 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰,這兩個(gè)吸收峰是多糖類物質(zhì)的特征峰[22-34]。1200～950 cm-1被認(rèn)為是EPS的指紋區(qū):若含吡喃糖環(huán),在1200～1000 cm-1應(yīng)存在三個(gè)吸收峰,若含呋喃糖環(huán),在相應(yīng)區(qū)域只出現(xiàn)兩個(gè)峰[32]。另一方面,糖的α-和β-端基差向異構(gòu)體是由端基的C-H變角振動(dòng)造成的,α-型的C-H在(844±8) cm-1處有吸收峰,β-型的C-H在(891±7) cm-1處有吸收峰。此外,亞甲基在2930～2850 cm-1處有弱吸收峰,羧基的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)在1700～1600 cm-1處有強(qiáng)吸收峰,硫酸基的S=O伸縮振動(dòng)在1240～1230 cm-1處有吸收峰等[35]。因此,紅外光譜可以鑒別EPSs中不同的單糖,識(shí)別呋喃糖和吡喃糖,確定糖苷鍵構(gòu)型,識(shí)別主要的取代基。

核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance NMR)在EPSs的結(jié)構(gòu)鑒定中起著非常重要的作用,可以測(cè)定糖鏈中糖基單元的種類和比例,確定糖苷鍵的構(gòu)型和連接方式等。常用的有1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR。在1H-NMR波譜中,通常糖異頭質(zhì)子H-1的化學(xué)位移(δ)約在4.5～5.3 ppm,該區(qū)域內(nèi)的質(zhì)子信號(hào)個(gè)數(shù)相當(dāng)于EPS單糖組分的異頭質(zhì)子個(gè)數(shù)[32],同時(shí)α-型吡喃糖H-1的質(zhì)子δ>4.95 ppm,β-型吡喃糖H-1的質(zhì)子δ<4.95 ppm,另外,異頭質(zhì)子與其鄰位質(zhì)子的耦合常數(shù)(J)也能推斷糖環(huán)構(gòu)型,如Polak-Berecka等[25]在1H-NMR譜中結(jié)合δH4.655和J1,2=7.6 Hz等推斷L.rhamnosusE/N EPS含β-D-吡喃葡萄糖;呋喃糖H-1的質(zhì)子δ在5.4 ppm左右、J<2 Hz,可區(qū)別呋喃糖環(huán)和吡喃糖環(huán)[34,36-37]。13C-NMR的分辨率遠(yuǎn)高于1H-NMR,可表現(xiàn)出EPS分子結(jié)構(gòu)上的精細(xì)變化,主要用來(lái)確定多糖中各殘基的種類和比例、糖環(huán)上異頭碳的構(gòu)型、多糖殘基中取代位置和分支點(diǎn)。一般糖環(huán)的異頭碳δ位于95～110 ppm,不同糖殘基異頭碳的化學(xué)位移不同,因此信號(hào)峰的數(shù)量代表了單糖種類個(gè)數(shù),另外,根據(jù)13C-NMR譜圖中峰相對(duì)高度正比于碳的數(shù)目可計(jì)算出不同糖殘基的相對(duì)比例;通常吡喃糖異頭碳,α-型δ為97～102 ppm,β-型δ為103～106 ppm[34-37],但此規(guī)律不適用于甘露糖和鼠李糖,如Dilna等[32]判斷L.plantarumRJF4 EPS的13C-NMR譜圖中69.46和73.22 ppm的強(qiáng)信號(hào)是α-D-甘露糖的C4和C5信號(hào),而依靠異頭碳與異頭質(zhì)子間的裂分常數(shù)(JC-H)可判斷它們,α-構(gòu)型的JC-H在170 Hz左右,β-構(gòu)型的JC-H在160 Hz左右,此規(guī)律僅適用于吡喃糖;多糖殘基中羥基發(fā)生取代會(huì)使異頭碳的δ發(fā)生移動(dòng),據(jù)此判斷多糖殘基中的取代位置和分支點(diǎn)。

甲基化分析的基本原理是將多糖糖基上的游離羥基全部甲基化后,進(jìn)行酸水解,對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行還原、衍生化、GC-MS方法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜圖分析來(lái)確定各種單糖殘基的種類和相對(duì)含量,以測(cè)定多糖鏈中各種單糖殘基的連接方式[38-39]。可用于分析EPSs中糖苷鍵連接方式及分支情況,根據(jù)不同甲基化單糖的比例還可以推測(cè)出該種連接鍵型在EPSs重復(fù)結(jié)構(gòu)中的比例。單糖衍生物的結(jié)構(gòu)可通過(guò)其在EI離子源作用下的裂解規(guī)律來(lái)推斷。需要注意:多糖必須完全甲基化,可用紅外光譜檢測(cè)甲基化產(chǎn)物在3400 cm-1附近羥基峰吸收情況,如果仍有羥基峰存在,則表示甲基化不完全,需重復(fù)進(jìn)行甲基化或?qū)⒁鸭谆亩嗵禽腿〕鰜?lái)做后續(xù)處理分析;對(duì)于含有糖醛酸、氨基己糖以及某些取代基團(tuán)的多糖,需要考慮甲基化和酸水解是否會(huì)引發(fā)副反應(yīng)[40]。

與化學(xué)分析法相比,物理分析法快速、準(zhǔn)確、操作方便、靈敏度高、對(duì)EPSs樣品破壞性小,但是兩種方法都有自身的局限性,如GC法分析EPSs時(shí)受到樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理,核磁共振結(jié)果與甲基化結(jié)果相結(jié)合,可彌補(bǔ)各自的缺陷,更加準(zhǔn)確地反映多糖的真實(shí)結(jié)構(gòu)等。同時(shí)由于EPSs結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,決定了任何一種單一的方法都不可能確定其精細(xì)結(jié)構(gòu),因此需要物理化學(xué)等多種方法的結(jié)合分析。

4.2高級(jí)結(jié)構(gòu)研究

由于EPSs分子量大,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,鑒定儀器信號(hào)復(fù)雜疊加的影響,要得到其二級(jí)以上高級(jí)結(jié)構(gòu)的清晰圖譜是比較困難的。目前EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定方法有二維核磁共振(2D-NMR)、剛果紅實(shí)驗(yàn)、X射線衍射(XRD)、原子力顯微鏡(AFM)、圓二色譜(CD)、差示掃描量熱法(DSC)、基于高分子稀溶液理論的解析法(動(dòng)/靜態(tài)光散射法、黏度法)等。

2D-NMR對(duì)復(fù)雜有機(jī)分子,特別是在溶液中的生物大分子的結(jié)構(gòu)研究中發(fā)揮著重要的作用,因其信號(hào)間重疊少,又可展示出自旋核間的相互作用,因此相比其它方法能提供更多的結(jié)構(gòu)信息,適合水溶性的乳酸菌EPSs的結(jié)構(gòu)研究。其中,COSY(1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy,化學(xué)位移相關(guān)譜)中每個(gè)交叉峰反映了相鄰氫核間的耦合關(guān)系,交叉峰的強(qiáng)度與其3J密切相關(guān),強(qiáng)度越大,3J值越大,反之亦然;由于異頭質(zhì)子易于辨認(rèn),所以一般從異頭質(zhì)子的對(duì)角線峰出發(fā),先找到H-1、H-2的交叉峰,通過(guò)劃線即可找出H-2的對(duì)角線峰,再?gòu)腍-2的對(duì)角線峰出發(fā),依次找到H3～H6的對(duì)角線峰和化學(xué)位移。TOCSY(Total Correlation Spectroscopy,全相關(guān)譜)給出的是同一自旋體系中所有氫核間的相關(guān)峰,包括長(zhǎng)程耦合和短程耦合,從譜圖中任一譜峰出發(fā),能找出許多相關(guān)峰,它們與該氫核處于同一自旋體系,如H-1和H-2,H-1和H-3,H-1和H-4等,因而可作為COSY譜的補(bǔ)充和驗(yàn)證。HSQC(Heteronuclear Single-qauntum Coherence,異核單量子相干)反映的是直接相連的1H和13C核間的偶合關(guān)系(1JCH),與其余2D譜圖結(jié)合可以找出與異頭碳相連的碳以及糖基上每個(gè)質(zhì)子所連碳的信號(hào)。HMBC(Heteronuclear Multiple-bond Correlation,異核多鍵相關(guān))能把1H核與長(zhǎng)程耦合的13C核關(guān)聯(lián)起來(lái),可解決糖殘基連接序列問(wèn)題,這正是2D-NMR的優(yōu)勢(shì)所在。NOE效應(yīng)(Nuclear Overhauser Effect,核歐沃豪斯效應(yīng))是指分子內(nèi)質(zhì)子與質(zhì)子在空間相互接近而產(chǎn)生的核交叉弛豫現(xiàn)象,在NOESY譜圖中出現(xiàn)NOE相關(guān)峰[41-42],可作為COSY的補(bǔ)充來(lái)識(shí)別譜峰,也可用來(lái)確定糖殘基間的連接方式。

用2D-NMR分析多糖結(jié)構(gòu)的一般思路為:由碳譜確定異頭碳的數(shù)目;由異頭碳的位移,在HSQC譜中找出異頭質(zhì)子;從異頭質(zhì)子出發(fā),在COSY譜中找出其它氫核的位移;由氫核的位移,在HSQC譜中找出碳的位移;完成氫和碳的歸屬后,在HMBC譜中找出與某一個(gè)糖單元的異頭質(zhì)子和異頭碳相關(guān)的另一個(gè)糖單元的碳和氫,以此推斷出糖單元的連接次序[42]。得到多糖的初步結(jié)構(gòu)后,可對(duì)照甲基化分析結(jié)果,以避免2D-NMR譜中一些噪音峰和雜質(zhì)峰的干擾。近年來(lái),HMQC-COSY、HMQC-TCOSY、HSQC-TOCSY、HMQC-NOESY等混合多量子譜的發(fā)展,用于解決不能用13C-1H COSY或HMQC進(jìn)行準(zhǔn)確歸屬的問(wèn)題[38]。計(jì)算機(jī)程序CASPER(Computer Assisted Spectrum Evaluation of Regular polysaccharides)可快速預(yù)測(cè)EPSs等類型的多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu),通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存的單糖到三糖的1H和13C化學(xué)位移來(lái)預(yù)測(cè)多糖的化學(xué)位移,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析未分配的1D1H和13C NMR及2D1H-1H和1H-13C NMR(如1H,1H-TOCSY,1H,13C-HSQC等),并預(yù)測(cè)出可能的結(jié)構(gòu)[21,36,43],如Patten等[18]將甲基化分析數(shù)據(jù)、同核和異核耦合常數(shù)、13C-NMR化學(xué)位移輸入CASPER以確定Lb.helveticussp. Rosyjski EPS中半乳糖殘基C5和C6的譜線歸屬。

此外,剛果紅試劑可用來(lái)判斷EPSs是否具有三股螺旋結(jié)構(gòu),利用AFM可以觀察EPSs分子的微觀形態(tài)、凝膠網(wǎng)絡(luò),XRD可獲得EPSs鍵角、鍵長(zhǎng)、構(gòu)型角等多方面的分子結(jié)構(gòu)信息,CD可用于測(cè)定EPSs分子不對(duì)稱結(jié)構(gòu)。Shang等[22]利用剛果紅實(shí)驗(yàn)測(cè)定在NaOH濃度為0.05～0.4 mol/L溶液中剛果紅和B.animalisEPSb復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)EPSb中無(wú)螺旋-卷曲轉(zhuǎn)變;邵麗等[44]采用AFM對(duì)L.rhamnosusEPS S2在水溶液中的表觀形貌進(jìn)行觀察,得到了不同質(zhì)量濃度的EPS S2聚集行為圖像,進(jìn)一步驗(yàn)證了由高分子稀溶液理論推斷的無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象的結(jié)論。

5　結(jié)論與展望

目前世界范圍內(nèi)利用乳酸菌作為發(fā)酵菌株的食品有很多,如酸奶等發(fā)酵奶制品、發(fā)酵香腸等發(fā)酵肉制品、泡菜等發(fā)酵蔬菜制品等等。目前國(guó)內(nèi)外有許多產(chǎn)EPSs的乳酸菌被分離出來(lái),對(duì)EPSs也做了大量的研究,其許多生物活性也被發(fā)現(xiàn)。乳酸菌EPSs表現(xiàn)出的多樣生物活性是由其結(jié)構(gòu)決定的,因此對(duì)乳酸菌EPSs進(jìn)行分離純化是結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ),但EPSs分離純化方法滯后,提取率低,未來(lái)應(yīng)繼續(xù)改進(jìn)EPSs的分離純化方法,提高提取率和純度;同時(shí)由于乳酸菌EPSs類型多樣,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究還停留在初級(jí)結(jié)構(gòu)方面,有的EPSs因結(jié)構(gòu)不明晰,尚不能從分子水平對(duì)其生物活性進(jìn)行深入研究,也無(wú)法確立其構(gòu)效關(guān)系。因此,對(duì)乳酸菌EPSs結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,特別是對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的研究,闡明結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系是開(kāi)發(fā)和利用乳酸菌EPSs的關(guān)鍵。鑒于此,本文從以上幾個(gè)方面出發(fā),對(duì)近幾年乳酸菌EPSs的研究方法進(jìn)行總結(jié)闡述。此外,不同乳酸菌生產(chǎn)EPSs的能力不同,產(chǎn)量普遍較低等,這些都限制了EPSs的應(yīng)用,應(yīng)加大高產(chǎn)菌株篩選、基因調(diào)控等方面的工作以提高EPSs產(chǎn)量。相信以上這些必將大大促進(jìn)乳酸菌EPSs在食品、藥品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

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Isolation,purification and structure identification of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria

WANG Rong-ping,Tubuxingjiya,HAO Na,LI Xiang-yi,Wuyundalai*

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The exopolysaccharides(EPSs)of lactic acid bacteria(LAB)have unique physicochemical properties and biological activities,and it is of great significance to study the physicochemical properties and structure of the EPSs and to elucidate the relationships between structure and function. This review introduced the classification and composition of EPSs,as well as summarized the available information on procedures and methods used for research on this topic. The information provided deals with methods for isolation and purification of EPSs,the physicochemical properties and structure identification. The research contents and orientation in the future were also discussed.

lactic acid bacteria;exopolysaccharides;isolation and purification;physicochemical properties;structure identification

2016-01-04

王榮平(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：wangrongping1989@163.com。

烏云達(dá)來(lái)(1975-)，男，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：wydl@imau.edu.cn。

廣譜抗菌活性瑞士乳桿菌AJT所產(chǎn)抗菌物質(zhì)及發(fā)酵提取工藝的研究(20130438)；廣譜抗菌活性瑞士乳桿菌AJT產(chǎn)生細(xì)菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化研究(2014MS0358)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)14-0389-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.069