離子色譜脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定原桃膠中的多糖含量

沈　潔,周光明,于　璐

(發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400715)

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沈潔,周光明*,于璐

(發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400715)

建立離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法檢測(cè)桃膠中的糖類(鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖)含量的方法,采用METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)分離柱,以10 mmol/L NaOH溶液在1.0 mL/min下洗脫樣品溶液,總分析時(shí)間為22 min。鼠李糖、甘露糖線性范圍為5.0～100.0 μg/mL,阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖線性范圍為2.0～60.0 μg/mL,鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖檢出限分別為(進(jìn)樣量20 μL,S/N=3)0.34、0.18、0.17、0.08、0.39 μg/mL,樣品加標(biāo)回收率為92.0%～98.3%,使用樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得5種糖RSD為2.25%～4.23%。此方法無(wú)需衍生、操作方便、方法快捷、檢測(cè)靈敏度高,適用于桃膠類糖含量的檢測(cè)。

離子色譜,脈沖安培檢測(cè)器,桃膠,多糖

桃膠(又名桃樹(shù)膠)系薔薇科植物,如桃樹(shù)、李樹(shù)、杏樹(shù)等樹(shù)木樹(shù)干受到機(jī)械損傷(如蟲咬、切傷等)或致病后分泌出來(lái)的膠質(zhì)半透明物質(zhì),經(jīng)研究表明其主要成分是多糖及其衍生物、少量蛋白質(zhì)以及雜質(zhì)等。其中多糖的主要成分為半乳糖、阿拉伯糖,另外還有少量的鼠李糖、甘露糖及葡萄糖[1]?！侗静菥V目》中有記載桃膠味苦、性平、益氣、和血、止渴,具有治療消渴的作用。近年來(lái)的研究表明,桃膠還具有清除結(jié)石,保護(hù)人體造血功能,改善免疫功能及強(qiáng)身健體等功效,將其運(yùn)用到血淋、石淋、痢疾、腹瀉等治療中,均有良好的效果[2-4]。

目前有關(guān)于桃膠的研究多在于其理化性質(zhì),收集、加工及提取工藝上,提取工藝重在研究桃膠的主要成分:多糖,而在研究提取桃膠多糖的文章中,比較常見(jiàn)的檢測(cè)方法是氣相色譜、液相色譜技術(shù),毛細(xì)管電泳法[5-8]。但是由于糖類多為中性、極性和親水性化合物,進(jìn)行HPLC分離或GC分離之前必須先進(jìn)行衍生,生成疏水性或揮發(fā)性的化合物,而后再使用光度法或示差折光進(jìn)行檢測(cè)。在衍生過(guò)程中,對(duì)于基體組成復(fù)雜的樣品,往往會(huì)由于受到各種因素的影響造成衍生反應(yīng)進(jìn)行不徹底或生成多種衍生物,造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差。此外,折光和低波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器對(duì)淋洗液和樣品基體非常敏感,這也限制了梯度洗脫方法的使用。本文采用離子色譜脈沖安培檢測(cè)器,利用糖類在強(qiáng)堿條件下呈離子狀態(tài),可以在陰離子色譜柱上被分離出來(lái)的特性進(jìn)行檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多糖含量的測(cè)定。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品桃膠A、B、C分別從網(wǎng)上購(gòu)自于云南麗江、浙江金華、福建寧德;實(shí)驗(yàn)用水 ≥ 18.2 MΩ·cm的去離子水;葡萄糖、D(-)-阿拉伯糖、三氯乙酸成都科龍化工試劑廠;鼠李糖、D-半乳糖、D-甘露糖、陰離子交換樹(shù)脂上海晶純生化科技股份有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、正丁醇、三氯甲烷、氯化鈉川東化工集團(tuán)有限公司,以上試劑均為分析純;0.45 μm微孔過(guò)濾膜天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠。

861 Advanced Compact IC離子色譜儀瑞士萬(wàn)通公司(Metrohm),817 Bioscan脈沖安培檢測(cè)器,METROSEP CARB 1分離柱(150 mm×4.0 mm),Metrohm IC-Net 2.3色譜工作站。恒溫油浴鍋鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;超聲波清洗儀上海必能信超聲波有限公司;80-1臺(tái)式低速離心機(jī)金壇市科技儀器有限公司;隔膜真空泵天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠;島津UV-2450紫外分光光度計(jì)江蘇省科學(xué)器材有限公司;恒溫干燥箱上海東星建材有限公司。

1.2色譜檢測(cè)條件

分離柱:METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱,淋洗液:10.0 mmol/L NaOH溶液,流速:1.0 mL/min,進(jìn)樣量:20 μL,柱溫:32 ℃,再生液:200.0 mmol/L NaOH,安培檢測(cè)器采用四電位脈沖安培法檢測(cè),峰面積定量。

1.3桃膠多糖的分離純化

1.3.1桃膠的預(yù)處理將桃膠樣品進(jìn)行干燥、碾磨成細(xì)小顆粒后,準(zhǔn)確稱量1.0000 g的樣品,加入一定量的去離子水90 ℃水浴加熱、溶解,待充分溶解180 min后,使用60目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾收集濾液[9-10]。將濾液加入三氯乙酸溶液至pH=3,靜置10 h進(jìn)行脫蛋白處理后,于4000 r/min的離心機(jī)下離心10 min,收集離心后的上清液,調(diào)節(jié)pH至中性[11-12]。加入4倍的乙醇進(jìn)行醇沉處理,靜置24 h后于4000 r/min的離心機(jī)下離心20 min,將得到的沉淀收集干燥后,溶解,將乙醇溶液濃縮、干燥后用去離子水溶解,合并兩溶液。用陰離子樹(shù)脂脫色處理60 min,過(guò)濾定容至100 mL后使用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾待測(cè)。

1.3.2桃膠水解時(shí)間選擇桃膠B樣品分別水解30、60、120、180、240 min后,按照上述方法檢測(cè)多糖含量,做峰面積柱狀圖。

1.3.3脫蛋白法使用三氯甲烷與丁醇4∶1的混合溶劑將樣品溶液置于250 mL的分液漏斗中混合搖勻、靜置5 min后,分離去變性蛋白,重復(fù)此項(xiàng)至溶劑與水層間不再有變性蛋白。

使用三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH=3,靜置10 h左右后離心,取上層清液,將收集的上層清液調(diào)節(jié)pH至中性。

將savage法對(duì)樣品B的多糖峰面積與三氯乙酸法(TCA)得到的峰面積做柱狀圖比較。

1.3.4桃膠多糖水溶液脫色陰離子樹(shù)脂預(yù)處理:將陰離子樹(shù)脂浸泡在5%的乙醇中24 h,去離子水清洗后用5%的氫氧化鈉浸泡4 h,使用去離子水將其沖洗至pH=7后在60 ℃進(jìn)行烘干[13]。

脫色率的測(cè)定及計(jì)算:桃膠多糖溶液使用陰離子樹(shù)脂脫色后,測(cè)定在420 nm處有最大紫外吸收,根據(jù)脫色前與脫色后的紫外吸光度,計(jì)算脫色率。

脫色率(%)=(脫色前吸光度-脫色后吸光度)/脫色前吸光度×100

脫色劑用量:較為常用的多糖的脫色方法一般為雙氧水法,活性炭法以及樹(shù)脂法[14-16]。但是雙氧水法具有較強(qiáng)的氧化性,破壞多糖結(jié)構(gòu),不利于實(shí)驗(yàn)分析,活性炭對(duì)于粘性較強(qiáng)的桃膠來(lái)說(shuō),會(huì)增加過(guò)濾步驟的困難,故選擇陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行脫色。分別向8份20 mL的待脫色溶液中加入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的樹(shù)脂,設(shè)定脫色時(shí)間相同均為30 min后,檢測(cè)吸光度,計(jì)算脫色率。

脫色時(shí)間:向8份20 mL的待脫色溶液中均加入5%的樹(shù)脂,分別進(jìn)行10、20、30、40、50、60、70、80 min脫色處理后檢測(cè)吸光度,計(jì)算脫色率。

1.4淋洗液的濃度及流速

分別配制5.0、8.0、10.0、20.0、40.0、60.0 mmol/L的NaOH溶液作為淋洗液,選擇最佳濃度。分別使用0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min的流速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品,選擇最佳流速。

1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱量半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖各0.1000 g,加水溶解后分別放入100 mL容量瓶中,定容至刻度配成1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別從1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0.2、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0 mL半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖溶液,取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL的甘露糖、鼠李糖溶液于100 mL容量瓶中定容配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別得到2.0、6.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/mL的半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖溶液與5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100.0 μg/mL的甘露糖、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

2　結(jié)果與分析

2.1淋洗液濃度及流速的選擇

淋洗液濃度:實(shí)驗(yàn)表明在脈沖安培檢測(cè)器使用堿性流動(dòng)相洗脫樣品,保留時(shí)間洗脫順序依次為酸性糖、中性糖和氨基酸糖,即出峰順序依次為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖[17]。淋洗液濃度低于10.0 mmol/L時(shí)除鼠李糖外,另外4種糖可以較好地分離;而高于20.0 mmol/L時(shí),半乳糖、葡萄糖、甘露糖這些差向異構(gòu)體和位置異構(gòu)體,無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離;當(dāng)淋洗液濃度為10.0 mmol/L時(shí),五種糖的分離效果是相對(duì)較為理想的,且保留時(shí)間適中。因此本實(shí)驗(yàn)選擇淋洗液濃度為10.0 mmol/L。

淋洗液流速:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改變流速的大小對(duì)出峰時(shí)間以及靈敏度均有影響,當(dāng)流速降低時(shí),保留時(shí)間明顯延長(zhǎng),而增大流速,對(duì)糖的分離影響較大。為提高實(shí)驗(yàn)效率,綜合考慮,本文選擇淋洗液流速為1.0 mL/min,此時(shí)各組分分離度、靈敏度均較好。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.1　Chromatograms of standards注:1:鼠李糖,2:阿拉伯糖,3:半乳糖, 4:葡萄糖,5:甘露糖，流速1.0 mL/min。

2.2水解時(shí)間的優(yōu)化選擇

隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,測(cè)得桃膠樣品各組分含量隨之增加,尤其是阿拉伯糖、甘露糖效果明顯。雖然在240 min得到的阿拉伯糖含量最高,但是葡萄糖、甘露糖的含量較之前的180 min增長(zhǎng)不明顯。故綜合考慮反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)收率,本文選擇180 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖2　樣品B在不同反應(yīng)時(shí)間所測(cè)得的各組分含量Fig.2　The content of each component at different reaction time for sample B

2.3脫蛋白試劑的優(yōu)化選擇

由圖3可見(jiàn)樣品B在經(jīng)savage法處理后得到的阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖含量明顯少于三氯乙酸法,說(shuō)明savage法對(duì)于多糖的損失影響比較大。故本實(shí)驗(yàn)采用三氯乙酸脫蛋白法。

2.4脫色劑用量及脫色時(shí)間的優(yōu)化選擇

由圖4可以看出脫色劑的用量在5%內(nèi)呈現(xiàn)明顯增長(zhǎng)趨勢(shì),說(shuō)明脫色劑用量對(duì)脫色率的影響較為明顯,但是5%后呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)的狀態(tài),故本文選擇脫色劑用量為5%。

由圖5可以明顯看到脫色時(shí)間越長(zhǎng),脫色效果越明顯,但是在60 min后,脫色率的變化呈現(xiàn)一個(gè)平緩的趨勢(shì),故綜合考慮本文選擇脫色時(shí)間為60 min。

圖3　樣品B在savage法 與三氯乙酸(TCA)法脫蛋白后的糖含量Fig.3　The content of monosaccharides after taking off the protein by savage and TCA

圖4　脫色劑用量對(duì)桃膠溶液脫色率的影響Fig.4　The effect of different amount of decolorant on peach gum decoloring rate

圖5　桃膠溶液在不同時(shí)間脫色率的變化圖Fig.5　The decoloring rate variation of peach gum in different time

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。逐漸稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,由S/N=3得到各檢出限如表1所示。

表1　五種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限Table 1　The results of regression equation and detection limits for five Monosaccharides

表2　樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 2　The content of monosaccharides of peach gum for A,B and C

表3　被測(cè)化合物加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3　The result of adding standard recovery

2.6色譜圖與檢測(cè)結(jié)果

樣品A、B、C色譜圖(圖6),組分含量見(jiàn)表2。樣品A中檢測(cè)到了阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖四種單糖成分,而沒(méi)有檢測(cè)到鼠李糖。樣品B、C均檢測(cè)到阿拉伯糖、葡萄糖以及甘露糖,樣品B的圖可以看出半乳糖的峰的趨勢(shì),但是低于檢測(cè)限。三種樣品均沒(méi)有檢測(cè)到鼠李糖可能是由于本身桃膠中鼠李糖含量較低,在經(jīng)過(guò)前處理后其樣品含量低于檢測(cè)限。

圖6　樣品A、B、C 3種桃膠樣品的色譜圖Fig.6　The chromatograms of peach gum for A,B and C

2.7加標(biāo)回收率與精密性實(shí)驗(yàn)

樣品B的加標(biāo)回收率與精密度見(jiàn)表3。樣品B桃膠樣品回收率為92.0%～98.3%。將每份加標(biāo)樣品分別進(jìn)樣6次,通過(guò)峰面積計(jì)算精密度為2.25%～4.23%。

3　結(jié)論

本研究采用熱水浸提法浸提、三氯乙酸脫蛋白、陰離子交換樹(shù)脂脫色對(duì)桃膠樣品進(jìn)行了前處理工作,使用離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法檢測(cè)桃膠中的多

糖成分。實(shí)驗(yàn)表明,此檢測(cè)方法不需要對(duì)其進(jìn)行柱前衍生,靈敏度高,準(zhǔn)確性好,操作簡(jiǎn)單,適用性強(qiáng),具有一定的實(shí)用價(jià)值?？梢宰鳛榭焖贆z測(cè)桃膠中多糖成分的一種方法。

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Determination of the polysaccharide content in origin peach gum by ion chromatography with pulsed ampere detector

SHEN Jie,ZHOU Guang-ming*,YU Lu

(Key Laboratory on Luminescence and Real-time Analysis(Southwest University),Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The ion chromatographic method with pulsed amperometric detectorhad was developed for the determination of peach gum polysaccharide content(rhamnose,arabinose,galactose,glucose,mannose). The analytes were separated on a METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)anion exchange column with 10 mmol/L NaOH as mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min,and the total analysis time of 22 min. The linear range of rhamnose and mannose was 5.0 to 100.0 μg/mL,the linear range of arabinose,galactose,glucose line arrange was 2.0 to 60.0 μg/mL. The detection limits of rhamnose,arabinose,galactose,glucose and mannose(20 μL injection,S/N=3)were 0.34,0.18,0.17,0.08,0.39 μg/mL,respectively. The recovery rates ranged from 92.0% to 98.3%,and RSDs of 5 polysaccharide contents ranged from 2.25% to 4.23% after 6 consecutive injections. Therefore,the proposed determination method was derivative-free,simple,fast,effective and sensitive,which facilitates the rapid detection and effective quality control of polysaccharide contents in peach gum.

Ion chromatography;pulsed ampere detector;peach gum;polysaccharide

2015-07-15

沈潔(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：離子色譜，E-mail：shenjiefamily@sina.com。

周光明(1964-)，男，博士，教授，研究方向：拉曼光譜學(xué)、離子色譜、分子光譜與色譜聯(lián)用技術(shù)，E-mail：gmzhou@swu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21277110)資助。

TS207.3

A

1002-0306(2016)05-0298-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.051