茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

賴小燕,姜澤東,2,倪　輝,2,彭文君,孫　浩,杜希萍,2,肖安風,2,楊遠帆,2，*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建廈門 361021；3.中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所,北京 100093)

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茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

賴小燕1,姜澤東1,2,倪輝1,2,彭文君3,孫浩1,杜希萍1,2,肖安風1,2,楊遠帆1,2，*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建廈門 361021；3.中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所,北京 100093)

為研究茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用,以茶花粉為原料,將提取、萃取及大孔吸附樹脂處理得到的10個組分分別進行黃酮含量及α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定。結果表明,茶花粉粗提物經萃取后黃酮類物質主要在乙酸乙酯中富集,乙酸乙酯萃取相經大孔樹脂層析后50%乙醇洗脫相中的黃酮含量最高(180.17 mg RE/g),當該樣品濃度為5 mg/mL時,對α-葡萄糖苷酶的抑制率達82.67%,顯著高于其它樣品(p<0.05);相關性分析表明,茶花粉黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性呈極顯著正相關關系(0.867,p<0.01);酶動力學分析顯示蜂花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度為1.27 mg/mL,抑制類型為可逆非競爭型抑制,抑制常數(shù)為1.17 mg/mL。該研究結果為蜂花粉黃酮及α-葡萄糖苷酶天然抑制劑的制備提供理論依據。

茶花粉,黃酮,α-葡萄糖苷酶,相關性,抑制類型

茶花粉是指蜜蜂從茶樹花藥內采集的花粉球,它含有豐富的不飽和脂肪酸、黃酮、多酚、多糖等活性成分[1]。研究表明茶花粉具有多種生理功能,如Zhang[2]等的研究表明茶花粉乙醇提取物對酪氨酸酶單酚酶及酪氨酸酶雙酚酶均有明顯的抑制效果,能有效防止黑色素的形成,何曉紅[3]等的研究表明茶花粉中具有抗衰老作用的超氧化物歧化酶,董亞婷[4]等發(fā)現(xiàn)茶花粉具有較強的抗氧化活性,且抗氧化活性與其多酚含量密切相關。劉偉[5]等發(fā)現(xiàn)茶花粉多糖能夠顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平。雖然有關蜂花粉的生物活性研究已經取得了長足的進步,但相關研究還不夠深入。

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類新型的口服降血糖藥物,可有效抑制小腸體內的α-葡萄糖苷酶活性,使攝取的多糖、寡糖和雙糖消化變成葡萄糖、果糖等單糖的過程受阻,從而降低血糖水平[6-7],然而,目前用于臨床的α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖、伏格列波糖等)都存在一定的胃腸道副作用,因此,更安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑有待研究開發(fā)。

研究表明天然黃酮類物質具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性,如Kim[8]等發(fā)現(xiàn)漆樹黃酮提取物濃度50 μg/mL時,對α-葡萄糖苷酶的抑制作用高達98%,Li[9]等的研究發(fā)現(xiàn)山楂葉黃酮提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性極強(IC50=7.1 μg/mL),Yao[10]等發(fā)現(xiàn)毛菊苣黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性與阿卡波糖相當,然而,目前有關茶花粉黃酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究還未見報道。因此,本文選用茶花粉為原料,研究茶花粉黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關關系,并進一步分析茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學特征。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

茶花粉由北京市華林蜂業(yè)有限公司提供,經粉碎后過100目篩,烘干備用。

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、對硝基苯酚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇國藥集團,以上試劑均為分析純;蘆丁、pNPG、α-葡萄糖苷酶美國Sigma公司。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司;LA120S電子分析天平賽多利斯科學儀器廠;FE-20臺式酸度測定儀梅特勒-托利多儀器有限公司;WCJ-802磁力加熱攪拌器國華電器有限公司;Water Aspirator旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;WFJ7200紫外可見分光光度計尤尼柯儀器有限公司;Fluosear熒光酶標儀德國BMG LABTECH公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的制備茶花粉粗提物及萃取相的制備:取干燥粉碎的茶花粉1 kg,按料液比1∶10(m∶v)的比例添加無水乙醇,于50 ℃水浴條件下浸提6 h,提取3次,合并提取液,離心取上清,40 ℃減壓濃縮成浸膏,得茶花粉乙醇提取物;按1∶5比例加入蒸餾水復溶茶花粉提取物浸膏,然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,每相萃取4次,將各相于50 ℃下減壓濃縮干燥,得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和殘余水相,均置于4 ℃冷藏備用。

茶花粉黃酮的分離富集:取上述黃酮含量最高的乙酸乙酯相,按1∶5的比例加蒸餾水溶解,加入AB-8型大孔吸附樹脂,置于30 ℃ 180 r/min搖床中吸附24 h,將吸附后的樹脂裝柱,依次用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫,均洗脫5個柱體積,收集各洗脫組分,50 ℃減壓濃縮至干,得大孔樹脂10%、30%、50%、70%及90%乙醇洗脫相,放置于4 ℃冷藏備用。

1.2.2黃酮含量的測定稱取蘆丁20.0 mg,用無水乙醇定容至50 mL,得0.4 mg/mL蘆丁母液,分別取0、1、2、3、4、5 mL蘆丁母液依次加入0～5號25 mL比色管中,蒸餾水稀釋體積至10 mL,搖勻,加入1 mL 5%的亞硝酸鈉,搖勻,靜置6 min;加入1 mL 10%的硝酸鋁,搖勻后靜置6 min,再加入5 mL 1 mol/mL的氫氧化鈉,用無水乙醇定容至25 mL,搖勻,于510 nm下測定吸光值。以蘆丁溶液濃度(μg/mL)為橫坐標x,吸光值為縱坐標y,繪制標準曲線,測定的標準曲線為:y=0.0102x-0.0019(R2=0.9997)。

1.2.3α-葡萄糖苷酶抑制活性測定取112 μL pH6.8的磷酸鹽緩沖液及20 μL 0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶液于96孔板中,分別加入8 μL不同濃度的待測樣品,37 ℃恒溫10 min后加入2.5 mmol/L對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)20 μL,37 ℃恒溫反應15 min。再加入0.2 mol/L的Na2CO3水溶液80 μL,于405 nm波長下測OD值。以阿卡波糖為陽性對照。茶花粉提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率為:抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100,式中,A1為酶液+樣品測得的吸光度值;A2為磷酸鹽緩沖液+樣品測得的吸光度值;A3為酶液+溶劑測得的吸光度值;A4為磷酸鹽緩沖液+溶劑測得的吸光度值,根據不同濃度下的抑制率計算半抑制劑量(IC50)[11]。

1.2.4茶花粉總黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關系數(shù)研究由方法1.2.1制備的茶花粉乙醇提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、殘余水相及大孔樹脂不同濃度乙醇(10%、30%、50%、70%、90%)洗脫相這10個組分的黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性之間的相關關系,采用SPSS 19.0分析軟件進行分析。

1.2.5茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制動力學特征研究固定底物pNPG濃度為2.5 mmol/L,在不添加和添加茶花粉黃酮提取物(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL)的情況下,測定不同α-葡萄糖苷酶濃度(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 U/mL)下的酶促反應初速度,以反應初速度對酶濃度作圖,判斷可逆或不可逆抑制類型。

如果上述抑制類型為可逆抑制,固定α-葡萄糖苷酶濃度為0.2 U/mL,在不添加和添加茶花粉黃酮提取物(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL)條件下,測定了不同pNPG濃度下(0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/mL)反應體系的反應速率,繪制Lineweaver-Burk曲線并判斷其具體抑制類型。

1.2.6數(shù)據分析與統(tǒng)計方法實驗數(shù)據通過SPSS 19.0(IBM公司,美國)分析軟件進行處理,數(shù)據均采用平均值±標準偏差表示,方差分析采用鄧肯法(p<0.05),相關性分析采用pearson法。

2　結果與討論

2.1茶花粉不同樣品黃酮含量及其對α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.1.1不同溶劑萃取相黃酮含量及其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性將茶花粉乙醇提取物、萃取相及殘余水相分別濃縮成浸膏后,測定各浸膏的黃酮含量,結果見表1。根據表1可知,茶花粉乙醇提取物經不同極性溶劑萃取后,各組分中的黃酮含量差異較大,其中乙酸乙酯相和正丁醇相中的黃酮含量分別為80.58 mg RE/g和57.57 mg RE/g,均顯著高于其它組分(p<0.05)。黃酮類化合物是在自然界中分布非常廣泛的一類天然產物[12],本文茶花粉中黃酮經萃取后主要在乙酸乙酯及正丁醇中富集,即茶花粉黃酮的極性主要與乙酸乙酯及正丁醇相似。孫巖等[13]用不同溶劑萃取油菜蜂花粉中的黃酮發(fā)現(xiàn),油菜蜂花粉黃酮同樣主要富集在正丁醇相和乙酸乙酯相中。

表1　茶花粉不同溶劑萃取相總黃酮含量及α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 1　Flavonoids content and α-glucosidase inhibitory of different solvent extracts of Camellia bee pollen

注:同一行中不同字母表示數(shù)值之間具有有顯著性差異(p<0.05),黃酮含量指的是各相提取物浸膏中的黃酮含量,表2同。

表2　AB-8型大孔吸附樹脂不同濃度乙醇洗脫相中的黃酮含量及α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2　Flavonoids content and α-glucosidase inhibitory of fractions eluted from columns packed with the AB-8 resins

用無水乙醇將上述樣品均復溶為5 mg/mL的溶液,分別測定各溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性(表1)。結果顯示,各樣品的活性大小順序為:乙酸乙酯萃取相>正丁醇萃取相=乙醇提取物>水相>石油醚相(p<0.05),即茶花粉乙醇提取物經萃取后,乙酸乙酯相的活性提高顯著,但正丁醇相的活性與乙醇提取物相比沒有顯著性差異,而殘余水相及石油醚相的活性顯著低于乙醇提取物(p<0.05)。由于乙酸乙酯相的黃酮含量及α-葡萄糖苷酶抑制活性均高于其他組分,本文進一步對乙酸乙酯相進行大孔吸附樹脂層析,并研究大孔樹脂分離組分的黃酮含量及α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.1.2大孔吸附樹脂分離組分的黃酮含量及其α-葡萄糖苷酶抑制活性乙酸乙酯萃取相經AB-8型大孔吸附樹脂吸附后,依次用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液進行洗脫,將各洗脫組分濃縮成浸膏,分別測定各浸膏的黃酮含量,結果表明(表2),隨著乙醇濃度的提高,各洗脫相中的黃酮含量先增加后降低,且各洗脫相中的黃酮含量差異顯著,其中10%和90%乙醇洗脫相中的黃酮含量最低,而50%乙醇洗脫相中的黃酮含量最高(180.17 mg RE/g),這說明極性較高的低濃度乙醇(10%)和極性相對較低的高濃度乙醇(90%)對茶花粉黃酮的吸附效果均較弱,而極性介于這兩者之間的50%乙醇對茶花粉黃酮的吸附效果較佳。

用無水乙醇將各洗脫組分的浸膏均復溶至濃度為5 mg/mL的溶液,測定各溶液的α-葡萄糖苷酶抑制活性。結果表明(表2),50%乙醇洗脫相的α-葡萄糖苷酶抑制活性最大,10%和90%乙醇洗脫相的活性最小(p<0.05)。比較發(fā)現(xiàn),這5個組分的黃酮含量大小與α-葡萄糖苷酶抑制活性大小順序一致。且表1顯示,黃酮含量較高的乙酸乙酯相、正丁醇相的α-葡萄糖苷酶抑制活性也較高,這說明茶花粉黃酮與其α-葡萄糖苷酶抑制活性關系密切。為進一步明確茶花粉黃酮與α-葡萄糖苷酶抑制活性之間的相關關系,將前文研究的茶花粉組分的黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性做相關性研究。

2.2茶花粉黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關系數(shù)

將前文研究的10種茶花粉組分(茶花粉乙醇提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、殘余水相及大孔樹脂10%,30%,50%,70%,90%乙醇洗脫相)的黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性做相關性研究,結果顯示(表3),各樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性與黃酮含量呈極顯著正相關,相關系數(shù)為0.867(p<0.01),有研究表明[14],蘆丁對α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨著蘆丁濃度的增加而增加,孫巖等[13]研究發(fā)現(xiàn),當油菜蜂花粉提取物中總黃酮含量達到一定程度后,油菜蜂花粉黃酮含量與油菜蜂花粉的α-葡萄糖苷酶抑制作用呈明顯正相關關系。本研究結果顯示,茶花粉各樣品的黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性呈極顯著正相關關系,因此可推測茶花粉中對α-葡萄糖苷酶活性起抑制作用的主要活性因子為黃酮類物質。

2.3茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果

為研究茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果,本文以黃酮含量最高的大孔樹脂50%乙醇洗脫相為進一步研究對象(將其命名為茶花粉黃酮提取物),測定不同濃度的茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性,結果(圖1)表明:在實驗質量濃度0.25～2.5 mg/mL,茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用,且其抑制效果與質量濃度之間具有量效關系。經非線性擬合,得茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的回歸方程為:y=-0.3775x2+27.122x+13.218(R2=0.9933,式中:y為α-葡萄糖苷酶抑制率,x為茶花粉提取物濃度),根據此方程計算得到茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度為1.27 mg/mL,略低于阿卡波糖(IC50=0.97 mg/mL)。

表3　茶花粉總黃酮含量 與α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關性Table 3　Correlations between the α-glucosidase inhibitory and flavonoids content of Camellia bee pollen

注:**表示極顯著(p<0.01)。

圖1　茶花粉黃酮提取物 對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig.1　Inhibition curve of flavonoid extract of Camellia bee pollen towards α-glucosidase

2.4茶花粉黃酮提取物抑制α-葡萄糖苷酶的動力學特征

2.4.1抑制類型(可逆或不可逆)的研究茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線(圖2)表明,在反應體系中加入不同濃度的茶花粉黃酮提取物(0.5,1,1.5,2 mg/mL)后得到四條通過原點但斜率低于未加抑制劑組的直線,且黃酮提取物濃度越大直線的斜率越低,因而茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于可逆抑制類型[15]。

圖2　茶花粉黃酮提取物 對α-葡萄糖苷酶抑制動力學曲線Fig.2　Inhibition kinetics curve of flavonoid extract of Camellia bee pollen towards α-glucosidase

2.4.2茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的可逆抑制類型利用Lineweaver-Burk作圖法研究茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制,由圖3可知,在反應體系中加入不同濃度抑制劑(0.5,1,1.5,2 mg/mL)后得到的四條直線與未加抑制劑組的直線相交于橫軸,和無抑制劑時相比,當茶花粉黃酮存在時,α-葡萄糖苷酶催化的酶促反應的Vmax變小,但Km(0.294 mmol/L)基本不變,因此推測茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶為非競爭性抑制類型[16]。根據相關公式可以推出茶花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)為1.17 mg/mL。

自然界中,黃酮類化合物廣泛存在,但不同來源的黃酮對α-葡萄糖苷酶具有不同的抑制類型,如Phan等[17]的研究表明人參須黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制類型均為混合型,Hlila等[18]的研究表明黃酮類物質為南非山蘿卜屬植物提取物的主要活性成分,其對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為非競爭型。目前國內外尚無茶花粉提取物對α-葡萄糖苷酶抑制類型的研究報道,本實驗結果表明茶花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為可逆非競爭型。

圖3　花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶 抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.3　Lineweaver-Burk plot for inhibition of flavonoid extract of Camellia bee pollen on α-glucosidase

3　結論

通過比較茶花粉提取物、萃取物及大孔吸附樹脂洗脫相中的黃酮含量及其α-葡萄糖苷酶抑制活性發(fā)現(xiàn),茶花粉乙醇提取物經不同溶劑萃取后黃酮類物質主要在乙酸乙酯中富集,乙酸乙酯萃取相進一步經大孔樹脂層析后,50%乙醇洗脫相中的黃酮含量最高(180.17 mg RE/g),當該樣品濃度為5 mg/mL時,對α-葡萄糖苷酶的抑制率達82.67%,顯著高于其它樣品(p<0.05);相關性分析表明,茶花粉各樣品中的黃酮含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性呈極顯著正相關關系(0.867,p<0.01),酶動力學分析顯示,蜂花粉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶半抑制濃度為1.27 mg/mL,抑制類型為可逆非競爭型抑制,抑制常數(shù)為1.17 mg/mL。本實驗結果說明蜂花粉產品在降血糖等保健產品具有良好的應用前景,同時為開發(fā)天然α-葡萄糖苷酶抑制產品提供理論依據。

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Study onα-glucosidase inhibitory activity of the flavonoids extract fromCamelliabee pollen

LAI Xiao-yan1,JIANG Ze-dong1,2,NI Hui1,2,PENG Wen-jun3,SUN Hao1,DU Xi-ping1,2,XIAO An-feng1,2,YANG Yuan-fan1,2,*

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering,Xiamen 361021,China;3.Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093,China)

In order to investigate theα-glucosidase inhibitory activity ofCamelliabee pollen flavonoids,10 kinds of flavonoid extracts ofCamelliabee pollen prepared by different methods were chosen for flavonoids content andα-glucosidase inhibitory activity tset. The flavonoids content was increased markedly after dispose by AB-8 macroporous resins,the flavonoids content(180.17 mg RE/g)andα-glucosidase inhibitory(82.67%,5 mg/mL)of fractions eluted by 50% ethanol from AB-8 resin were all higher than other fractions. The results of correlation study showed that the correlation between total flavonoids content andα-glucosidase inhibitory activity inCamelliabee pollen was significantly positive(p<0.01)and the correlation coefficient was 0.867. Enzyme dynamic analysis showed that the half-inhibitory concentration(IC50)of flavonoid extract ofCamelliabee pollen onα-glucosidase was determined to be 1.27 mg/mL. The inhibition was detected to belong to noncompetitive reversible inhibition with a inhibition constant(Ki)of 1.17 mg/mL.These results provided a theoretical reference for further comprehensive utilization of flavonoids andα-glucosidase inhibitors from bee pollen.

Camelliabee pollen;flavonoid;α-glucosidase;correlation;inhibition type

2015-08-27

賴小燕(1989-)，女，碩士研究生在讀，研究方向：食品科學，E-mail:lxy792719953@sina.cn。

楊遠帆(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學，E-mail：yuanfan@jmu.edu.cn。

國家蜂產業(yè)技術體系科研基金項目(30771636)；集美大學科研創(chuàng)新團隊基金(2010A006)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)05-0353-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.063