噴霧干燥法制備牡蠣肽粉的體內(nèi)抗氧化活性研究

許　旻,朱良松,熊何健,蘇　捷,劉淑集,劉智禹,*

(1.福建省水產(chǎn)研究所,國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門),福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建廈門 361013;2.集美大學(xué),福建廈門 361021;3.杭州丘比食品有限公司,浙江杭州 310018)

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噴霧干燥法制備牡蠣肽粉的體內(nèi)抗氧化活性研究

許旻1,朱良松2,3,熊何健2,蘇捷1,劉淑集1,劉智禹1,*

(1.福建省水產(chǎn)研究所,國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門),福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建廈門 361013;2.集美大學(xué),福建廈門 361021;3.杭州丘比食品有限公司,浙江杭州 310018)

研究噴霧干燥制備牡蠣肽粉對(duì)體內(nèi)抗氧化活性的影響。以新鮮葡萄牙牡蠣為原料,通過選擇性復(fù)合酶解后噴霧干燥制備牡蠣肽粉,分別測(cè)定小鼠丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量等指標(biāo)考察牡蠣肽粉對(duì)小鼠抗氧化活性的影響。結(jié)果顯示,與模型對(duì)照組相比,經(jīng)過噴霧干燥后的牡蠣肽粉不同劑量組均可極顯著地降低小鼠血清丙二醛含量和蛋白質(zhì)羰基含量(p<0.01),并顯著提高超氧化物歧化酶和還原型谷胱甘肽的含量(p<0.01)。結(jié)果表明噴霧干燥制備的牡蠣肽粉具有良好的體內(nèi)抗氧化作用。

牡蠣,多肽,噴霧干燥,抗氧化

氧化衰老一直以來都是人們關(guān)注的健康問題。機(jī)體在生命過程中時(shí)刻都在產(chǎn)生自由基,如果自由基產(chǎn)生過多或者清除過慢,不斷地積累,就會(huì)攻擊細(xì)胞器和生命大分子物質(zhì),加速機(jī)體損傷并引發(fā)各種疾病[1]。機(jī)體通過酶抗氧化劑或非酶抗氧化劑等防御系統(tǒng)可消化和清除自由基的產(chǎn)生。隨著科學(xué)的進(jìn)步,科學(xué)家越來越多的使用外源性抗氧化劑達(dá)到抗氧化目的。尤其是最近幾十年,從植物、動(dòng)物中提取具有顯著地抗氧化活性的多酚[2]、黃酮[3]、多肽[4]等天然產(chǎn)物,廣泛用于食品添加劑、藥品和保健食品的生產(chǎn)。

表1　牡蠣肽粉對(duì)小鼠體重的影響Table 1　The effects of Oyster peptide on body weight of mice

牡蠣是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的海洋貝類,含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及微量元素[5]。牡蠣中提取的生物活性肽在降壓、抗腫瘤、抗氧化等方面有顯著的活性[6-8]。但是目前國內(nèi)外研究主要集中在牡蠣酶解液的體內(nèi)抗氧化活性[6,8-15],而對(duì)加工條件及其抗氧化活性影響卻鮮有報(bào)道,由于多肽中的氨基酸組成復(fù)雜,這使得其在生產(chǎn)、應(yīng)用和儲(chǔ)存過程中發(fā)生氧化、降解等作用影響肽的穩(wěn)定性,甚至有可能導(dǎo)致活性完全喪失[16]。因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況,利用噴霧干燥制得牡蠣肽粉成品,但由于短時(shí)間高溫可能會(huì)造成蛋白活性發(fā)生變化,因此本文探討噴霧干燥粉末對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響,為開發(fā)具有抗氧化活性的保健產(chǎn)品提供依據(jù),為后續(xù)研究噴霧干燥制得牡蠣肽粉對(duì)其他活性機(jī)理的影響奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮葡萄牙牡蠣廈門第八市場(chǎng);胰蛋白酶(2.5×105U/g)，風(fēng)味蛋白酶(1.5×104U/g)南寧龐博生物工程有限公司；SPF級(jí)雄性ICR小鼠200只,18～22 g上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;小鼠飼料北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2009-0008京飼審(2009)06170。

丙二醛測(cè)定試劑盒、蛋白質(zhì)羰基測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)測(cè)定試劑盒南京建成科技有限公司。

S10組織勻漿機(jī)寧波新芝生物;HH-6型恒溫水浴鍋國華電器有限公司;陶瓷膜機(jī)組、超濾膜機(jī)組(截留分子量5 ku)、納濾膜機(jī)組(卷式納濾膜,最小截留分子量150)世達(dá)膜科技(廈門)有限公司;YS-ZS-420真空包裝機(jī)杭州永創(chuàng)智能設(shè)備股份有限公司;XF0.3-2型噴霧干燥器常州市新業(yè)制粒干燥設(shè)備有限公司;Cintra6型紫外可見分光光度計(jì)澳大利亞科學(xué)儀器設(shè)備有限公司;Centrifuge 5804 R型高速冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司;XH-D漩渦混勻器上海比朗儀器制造有限公司;BS4202S電子分析天平德國賽多利斯集團(tuán)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1牡蠣勻漿的制備將新鮮牡蠣清洗瀝干后打漿,烘干成粉末。

1.2.2牡蠣肽粉的制備將新鮮牡蠣清洗瀝干后打漿→按1∶2的比例加水→加酶量胰蛋白酶7500 U/g、風(fēng)味蛋白酶450 U/g→溫度50 ℃、pH8.0、時(shí)間4 h→離心取上清→陶瓷膜除雜→超濾膜過濾獲得小于5 ku分子量的多肽→納濾膜濃縮至固形物含量達(dá)10%→噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃,出風(fēng)溫度80 ℃)→得到牡蠣活性肽粉→真空包裝低溫保存。

1.2.3動(dòng)物分組及給藥方法SPF級(jí)雄性ICR小鼠60只,18～22 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,隨機(jī)分為6組,每組10只。分別為:空白對(duì)照組(0.5 mL生理鹽水)、模型對(duì)照組(0.5 mL生理鹽水)、牡蠣勻漿組(2.0 g/kg·BW牡蠣勻漿)、牡蠣肽粉低劑量組(0.5 g/kg·BW牡蠣肽粉)、牡蠣肽粉中劑量組(1.0 g/kg·BW牡蠣肽粉)、牡蠣肽粉高劑量組(2.0 g/kg·BW牡蠣肽粉)。同時(shí)飼喂小鼠維持飼料,自由飲水,連續(xù)喂養(yǎng)30 d,末次灌胃后,模型對(duì)照組、牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組分別禁食過夜16 h,然后灌胃50%乙醇12 mL/kg·BW,6 h后拔眼球取血和肝臟。血液放置于4 ℃冰箱過夜沉降,4000 r/min離心分離后取血清;取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后濾紙吸干,加入生理鹽水在冰水浴下勻漿,離心取上清備用[17]。

1.2.4指標(biāo)測(cè)定按照試劑盒指定方法測(cè)定丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及還原性谷胱甘肽(GSH)含量。

2　結(jié)果與討論

2.1牡蠣肽粉對(duì)小鼠體重的影響

表1表明,各組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)前、后組間無顯著性差異(p>0.05),不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明牡蠣肽粉對(duì)小鼠的生長發(fā)育和一般健康情況無不良影響。

2.2牡蠣肽粉對(duì)小鼠丙二醛含量的影響

表2　牡蠣肽粉對(duì)小鼠血清丙二醛含量的影響Table 2　The effected of Oyster peptide on serum MDA in mice

注:“*”與空白對(duì)照組比,p<0.05;“**”與空白對(duì)照組比,p<0.01;“#”與模型對(duì)照組比,p<0.05;“##”與模型對(duì)照組比,p<0.01，表3～表5同。

表3　牡蠣肽粉對(duì)小鼠血清SOD活力的影響Table 3　The effects of Oyster peptide on serum SOD activity in mice

表4　牡蠣肽粉對(duì)小鼠蛋白質(zhì)羰基含量的影響Table 4　The effects of Oyster peptide on protein carbonyl in mice

表5　牡蠣肽粉對(duì)小鼠GSH含量的影響Table 5　The effects of Oyster peptide on GSH in mice

丙二醛是脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的活性羰基類物質(zhì),其含量高低可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平,在一定程度上間接反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。

表2可以看出,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠血清中的丙二醛含量極顯著增加(p<0.01),說明小鼠氧化衰老模型建立成功。與模型對(duì)照組相比,牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低、中、高三個(gè)劑量組的血清丙二醛含量都極顯著降低(p<0.01),說明牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉都能有效地降低小鼠血清丙二醛含量。隨著牡蠣肽粉劑量的增加,丙二醛的含量呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì),可以看出小鼠血清丙二醛含量與牡蠣肽粉劑量具有相關(guān)性。與空白對(duì)照組相比,牡蠣肽粉高劑量組顯著降低(p<0.01)。結(jié)果說明噴霧干燥后的牡蠣肽粉可以降低小鼠體內(nèi)丙二醛含量,具有突出的修復(fù)機(jī)體衰老損傷的治療效力。

2.3牡蠣肽粉對(duì)小鼠超氧化物歧化酶活力的影響

從表3可以看出,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠血清SOD活力極顯著降低(p<0.01),說明造模成功。與模型對(duì)照組相比,牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低、中、高三個(gè)劑量組均能極顯著提高小鼠SOD活力(p<0.01),并且SOD活力與牡蠣肽粉劑量具有相關(guān)性。但與正常組相比,還有明顯的差距(p<0.01)。結(jié)果說明噴霧干燥后的牡蠣肽粉對(duì)小鼠的急性氧化損傷具有良好的預(yù)防作用,但不具備修復(fù)SOD活力降低的作用。

2.4牡蠣肽粉對(duì)小鼠蛋白質(zhì)羰基含量的影響

蛋白質(zhì)羰基化是指氨基酸殘基側(cè)鏈中的氨基或亞氨基受到氧自由基攻擊最后轉(zhuǎn)變成醛基,并釋放NH3+的過程。測(cè)定蛋白的羰基化水平是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)總氧化水平的常用方法。

表4蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組的小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量有極顯著的增加(p<0.01),說明造模成功。與模型對(duì)照組相比,牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低、中、高劑量組的蛋白質(zhì)羰基含量都極顯著降低(p<0.01),可以看出牡蠣勻漿和牡蠣肽粉都可以抑制蛋白質(zhì)氧化,降低蛋白質(zhì)羰基的含量。牡蠣肽粉的效果要明顯優(yōu)于牡蠣勻漿粉,并呈劑量依賴性。上述結(jié)果表明,噴霧干燥后的牡蠣肽粉能夠減少蛋白羰基化合物的形成,提高小鼠抗氧化損傷的能力。

2.5牡蠣肽粉對(duì)小鼠還原型谷胱甘肽含量的影響

谷胱甘肽是一種低分子清除劑,它可清除O2-、H2O2、LOOH,是GSH-PX和GST兩種酶類的底物,為這2種酶分解氫過氧化物所必需,它能穩(wěn)定含巰基的酶,和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷,GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。

表5表明,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠肝臟GSH含量極顯著降低(p<0.01)。與模型對(duì)照組相比,牡蠣肽粉高劑量組的GSH含量有極顯著的增加(p<0.01),但與空白對(duì)照組相比沒有顯著性差異。機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的過量自由基會(huì)損傷生物膜、侵襲生物大分子物質(zhì)、促進(jìn)機(jī)體衰老等一系列不良反應(yīng)的發(fā)生,GSH具有清除自由基的能力,表5中高劑量的牡蠣肽粉可以極顯著的提高小鼠GSH含量,可見高劑量組的牡蠣肽粉具有突出的修復(fù)機(jī)體衰老損傷的治療效力。

3　結(jié)論

本研究用復(fù)合酶解后噴霧干燥制備牡蠣肽粉,通過對(duì)小鼠生化指標(biāo)的測(cè)定噴霧干燥的牡蠣肽粉對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化的活性作用。結(jié)果表明,噴霧干燥制備的牡蠣肽粉對(duì)降低小鼠MDA和蛋白質(zhì)羰基含量、增加SOD活力和GSH含量等方面均具有顯著效果,具有很好的抗氧化效果?？赡苁菄婌F干燥過程中,提取液被霧化為體積極小的液滴,在熱氣流充分接觸的極短時(shí)間內(nèi)迅速蒸發(fā)水分,帶走了液滴中大量的熱量,肽粉實(shí)際受熱較低,受熱時(shí)間短,因此熱敏成分破壞少。

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Preparation andinvivoantioxidant activity of spray-dried peptides fromCrassostreaangulate

XU Min1,ZHU Liang-song2,3,XIONG He-jian2,SU Jie1,LIU Shu-ji1,LIU Zhi-yu1,*

(1. Fisheries Research Institute of Fujian,National Research and Development Center for Marine Fish Processing(Xiamen),Key Laboratory of Cutivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province,Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361013,China;2. Jimei University,Xiamen 361021,China;3. Hangzhou kewpie Corporation,Hangzhou 310018,China)

The preparation andinvivoantioxidant activity of peptides from the protein hydrolysate of oysters were investigated. FreshCrassostreaangulatawere hydrolyzed by a commercial mixture of proteases and spray-dried method to produce oyster peptides. The levels of malondialdehyde(MDA),protein carbonyls(PC)as well as the activities of superoxide dismutase(SOD)and glutathione(GSH)were evaluated for their antioxidant activity of oysters peptides. The results showed that MDA and PC levels in oyster peptides group were significantly decreased(p<0.01),while SOD and GSH level were significantly increased compared with control group(p<0.01). These results indicated that the antioxidant peptide fractions of spray-dried oyster product exhibited strong antioxidant activityinvivo.

oyster;peptides;spray drying;antioxidant

2015-08-04

許旻(1987-)，女，碩士，助理研究員，研究方向:海洋生物活性評(píng)價(jià)，E-mail:xumin1315@foxmail.com。

劉智禹(1971-)，男，博士，教授級(jí)高工，研究方向：水產(chǎn)品加工與綜合利用研究，E-mail:13906008638@163.com。

福建省科技重大專項(xiàng)(2014NZ0001-1)；廈門市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12CZP001SF02)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)；福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1003-10)；福建省水產(chǎn)研究所青年基金項(xiàng)目(2014fjscq01)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)05-0361-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.065