響應(yīng)面法優(yōu)化水提地瓜藤中總黃酮工藝

徐君飛，彭太兵，符秋霞，郭姝瓊，劉喜情（民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化418008）

響應(yīng)面法優(yōu)化水提地瓜藤中總黃酮工藝

徐君飛，彭太兵，符秋霞，郭姝瓊，劉喜情
（民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化418008）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化水提地瓜藤中總黃酮工藝條件，提高總黃酮得率。在單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法研究各因素及其交互作用對(duì)地瓜藤中總黃酮提取量的影響，優(yōu)選提取工藝。水提地瓜藤中總黃酮最佳工藝條件為：料液比1∶50（g/mL），浸提前浸泡50 min，60℃，浸提50 min，在此工藝條件下，地瓜藤中總黃酮的提取量為25.62mg/g。

地瓜藤；總黃酮；水提；響應(yīng)面法

地瓜藤（Ficus Tikoua Bur.）系桑科榕屬植物地瓜的全草，又稱霜坡虎、爬地牛奶、鉆地龍，味苦、性寒，主要分布于廣西、貴州、湖南等地，為苗族常用藥材，含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)、黃酮類化合物，具有清熱利濕、活血通絡(luò)、解毒消腫等作用［1］。

黃酮（flavonoids）是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)，是許多食品和中藥材的有效成分，有抗菌、抗病毒、降糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用［2-4］。

在傳統(tǒng)應(yīng)用過程中，熱水是地瓜藤中黃酮提取的最佳溶劑，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉的優(yōu)勢(shì)，作者首次采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合的方式，對(duì)水提地瓜藤中總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其試驗(yàn)研究和工業(yè)應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

地瓜藤：種植于懷化學(xué)院生物園，干燥至恒重，粉碎備用；蘆?。ㄉV純）：北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；其它藥品均為分析純。

FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.2方法

1.2.1地瓜藤中總黃酮提取［5］

精確稱取2.00 g地瓜藤粉于100 mL燒杯，加入60 mL蒸餾水，室溫?cái)嚢杞?0 min，升溫至70℃攪拌浸提30 min，冷卻，10 000 r/min離心3 min，收集濾液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋至刻度，得樣品液。

1.2.2單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)，依次優(yōu)化料液比、浸提前浸泡時(shí)間、浸提溫度、浸提時(shí)間等參數(shù)［6-7］。

1.2.3Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)［8］

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮提取量為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6［9］進(jìn)行二級(jí)水平（低水平“-1”，高水平“1”）PB試驗(yàn)［10］優(yōu)化料液比（A）、浸提前浸泡時(shí)間（B）、浸提溫度（C）、浸提時(shí)間（D）、浸提次數(shù)（E）5個(gè)因素，篩選出對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著的因素［11］。PB試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1　PB試驗(yàn)因素水平編碼Table 1　Range and factors of PB design

1.2.4最陡爬坡試驗(yàn)

PB試驗(yàn)通常只能分析各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，而不能確定最優(yōu)點(diǎn)所在的區(qū)域［12］，因此根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，采用最陡爬坡試驗(yàn)來尋找料液比（A），浸提前浸泡時(shí)間（B），浸提時(shí)間（D）的最優(yōu)點(diǎn)所在區(qū)域。

1.2.5中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）試驗(yàn)

CCD試驗(yàn)可用來評(píng)價(jià)試驗(yàn)指標(biāo)與各因素之間一階、二階或交互作用的非線性關(guān)系［13］。在單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比（A），浸提前浸泡時(shí)間（B），浸提時(shí)間（D）3個(gè)對(duì)地瓜藤中總黃酮提取量影響顯著的因素，采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行三因素五水平CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平編碼見表2。

表2　CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼Table 2　Range and factors of CCD

1.3分析檢測(cè)方法

采用分光光度法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蘆丁質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程，A=4.582 9c-0.012 5，R2= 0.999 1。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1浸提溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察不同浸提溫度對(duì)提取量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　浸提溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.1　Fffect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

由圖1可知，溫度由40℃升高至60℃，總黃酮提取量不斷增大，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，總黃酮提取量最大，達(dá)19.8 mg/g；繼續(xù)升溫，提取量不升反而快速下降，這可能是由于浸提溫度過高，影響黃酮的穩(wěn)定性，使其受熱分解，且隨著浸提溫度的升高，雜質(zhì)溶出量加大，增加后續(xù)目標(biāo)物質(zhì)純化的難度［14］。因此，選擇60℃作為后續(xù)試驗(yàn)的參考值。

2.1.2料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察不同料液比對(duì)提取量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　料液比對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖2可知，總黃酮提取量隨料液比增大而增大，但當(dāng)料液比超過1∶35（g/mL），總黃酮的提取量增長(zhǎng)緩慢，這可能是由于地瓜藤在料液比為1∶35（g/mL）時(shí)，總黃酮的溶出量已趨于飽和，且過高的液相濃度會(huì)提高生產(chǎn)成本和后續(xù)濃縮難度［15］。因此，選用料液比1∶35（g/mL）作為后續(xù)試驗(yàn)的參考值。

2.1.3浸提前浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察浸提前浸泡不同時(shí)間對(duì)提取量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　浸提前浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of soak time before extract on extraction yield of total flavonoids

由圖3可知，總黃酮提取量隨浸提前浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但當(dāng)浸泡時(shí)間超過30 min，總黃酮的提取量增長(zhǎng)緩慢。這可能是由于地瓜藤在室溫浸泡30 min時(shí)，總黃酮的溶出量趨于飽和［16］，且延長(zhǎng)浸泡時(shí)間，影響提取的時(shí)效性，因此，選用浸提前浸泡30 min作為后續(xù)試驗(yàn)的參考值。

2.1.4浸提時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察不同浸提時(shí)間對(duì)提取量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　浸提時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.4　Fffect of extract time on extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，浸提時(shí)間由20 min延長(zhǎng)至40 min，總黃酮的提取量不斷增大，當(dāng)浸提時(shí)間為40 min時(shí)，總黃酮的提取量達(dá)到最大，為22.6 mg/g，繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，提取量不升反而快速減小，這可能是由于總黃酮在長(zhǎng)時(shí)間高溫條件下結(jié)構(gòu)破壞、分解，且長(zhǎng)時(shí)間高溫浸提耗能大，雜質(zhì)溶出量大［17］，因此，選用浸提40 min作為后續(xù)試驗(yàn)的參考值。

2.2PB試驗(yàn)

按照PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行12次試驗(yàn)，其中6個(gè)空白因素［18］，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)重復(fù)3次，取均值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3　PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 3　PB test design and result

用Minitab l7［19］對(duì)表3中結(jié)果進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，此次試驗(yàn)所得到的回歸擬合方程顯著（模型項(xiàng)P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R2=0.996，R2（調(diào)整）=0.993，說明變異可以用模型來解釋?；貧w方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表5。

表4　 回歸模型方差分析Table 4　Analysis of variance of regression equation

表5　偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)表Table 5　Partial regression coefficients and significance test

由表5可以看出，回歸得到多元一次方程為Y= 18.46+0.99A+3.76B-0.08C+0.64D+0.08E，且影響提取量的主要因素為料液比（A）、提取前浸泡時(shí)間（B）、提取時(shí)間（D）。

2.3最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)，對(duì)A、B、D三因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，以試驗(yàn)值的變化方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值與比例來確定變化步長(zhǎng)［20］。根據(jù)表5中因素估計(jì)系數(shù)，A、B、D三因素皆為正效應(yīng)，變化值依次增大。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表6。

表6　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6　Experimental design and results of steepest ascent path

從表6可知，隨著爬坡的進(jìn)行，Y值增加，在處理4處即達(dá)到最高點(diǎn)，之后又開始下降，說明在該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的條件值時(shí)，總黃酮提取量接近了最優(yōu)點(diǎn)，因此選擇這一點(diǎn)作為中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.4CCD試驗(yàn)

2.4.1CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選取A、B、D三因素，做三因素五水平響應(yīng)面分析，共設(shè)計(jì)20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中，6個(gè)中心點(diǎn)（以最陡爬坡試驗(yàn)的最優(yōu)值為中心點(diǎn)［21］），14個(gè)析因點(diǎn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表7。

表7　CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 7　Experiment design and result of CCD

2.4.2回歸模型方差分析

利用Design expert 8.0.6對(duì)表7數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程：Y=24.30+0.43A+1.05B+0.50D-0.075AB+0.075AD+0.075BD-0.11A2-0.29B2-0.29D2。該模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表8所示，模型的方差分析結(jié)果如表9所示。

表8　回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 8　Significance test table of regression coefficient

表9　 回歸方程方差分析Table 9　Analysis of variance of regression equation

由表8可知，在一次項(xiàng)、二次項(xiàng)中，料液比（A）、浸提前浸泡時(shí)間（B）、浸提時(shí)間（D）對(duì)總黃酮的提取量的影響都達(dá)到了顯著水平。

從表9中回歸方程的方差分析可知，F(xiàn)=134.76＞F0.01（9，5），相應(yīng)的概率值P＜0.000 1，該方程模型達(dá)到極其顯著。失擬性檢驗(yàn)分析得失擬不顯著，表明該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合。通過對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚欧治?，得到相關(guān)系數(shù)R2為0.935 0，說明模型可以解釋93.5%試驗(yàn)所得總黃酮含量的變化，表明方程擬合較好。校正后R2為0.984 5，表明總黃酮提取量98.45%的變異分布在方程中，其總變異中僅有1.55%不能由該模型解釋?？傸S酮提取量（Y）的變異系數(shù)較低（0.58），表示試驗(yàn)的精確度高，試驗(yàn)可靠性強(qiáng)，試驗(yàn)操作可信。綜上所述，回歸方程給總黃酮的提取提供了一個(gè)合適的模型。

2.4.3響應(yīng)曲面的擬合以及最優(yōu)條件的確定

圖5～圖7是由多元二次回歸方程所作的各因素之間兩兩相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響所得到的響應(yīng)面圖及等高線圖。

圖6　Y=f（A，D）的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6　Response surface and contours of Y=f（A，D）

圖7　Y=f（B，D）的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7　Response surface and contours of Y=f（B，D）

由此可見，響應(yīng)值隨料液比（A）、浸提前浸泡時(shí)間（B）、浸提時(shí)間（D）的增大呈先增后降的趨勢(shì)，說明3個(gè)因素在所選范圍內(nèi)能產(chǎn)生較佳的響應(yīng)值。

2.5最佳工藝參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design expert 8.0.6優(yōu)化的工藝條件為：料液比為1∶50（g/mL），浸提前浸泡時(shí)間50 min，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間50 min，浸提次數(shù)1次，此時(shí)總黃酮的理論提取量為25.66 mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件提取地瓜藤中總黃酮，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，在此條件下，地瓜藤中總黃酮的平均提取量為25.62 mg/g，與預(yù)測(cè)值相符，說明此方程與實(shí)際情況擬合良好，因此基于響應(yīng)面法分析所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際參考價(jià)值。

3　結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、CCD試驗(yàn)對(duì)水提地瓜藤中總黃酮工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為：料液比為1∶50（g/mL），浸提前浸泡50 min，浸提溫度60℃，浸提50 min，浸提1次，在此工藝條件下，總黃酮提取量為25.62 mg/g。

地瓜藤的開發(fā)進(jìn)度緩慢，已經(jīng)造成了大量資源浪費(fèi)，對(duì)于其中活性成分的深入研究，必定為地瓜藤的開發(fā)研究提取基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。地瓜藤的廣泛開發(fā)應(yīng)用，前景廣闊，可大大推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展，產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。

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Optimization of Water Extraction of Total Flavonoids from Ficus Tikoua Bur.by Response Surface Methodology

XU Jun-fei，PENG Tai-bin，F(xiàn)U Qiu-xia，GUO Shu-qiong，LIU Xi-qing
（Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources，College of Biological and Food Engineering，Huaihua University，Huaihua 418008，Hunan，China）

Optimization of water extraction total flavonoids from Ficus Tikoua Bur.by response surface methodology was studied.Based on the single-factor test analysis，the Plackett-Burman experimental design and steepest ascent design，while take extracted amount of total flavonoids as the response value，response surface method was applied to analyze the influence of various factors and their interaction on the extraction of total flavonoids，select an optimized progress to extract total flavonoids from Ficus Tikoua Bur..The optimal water extraction of total flavonoids from Ficus Tikoua Bur.progress conditions were solid-liquid ratio 1∶50（g/mL）；soak time 50 min，extraction temperature 60℃；extraction time 50 min.Under these conditions，extracted amount of total flavonoids from Ficus Tikoua Bur.can reach 25.62 mg/g.

FicusTikouaBur.；totalflavonoids；waterextraction；responsesurfacemethodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.018

湖南省重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科經(jīng)費(fèi)資助（2011-42）

徐君飛（1981—），女（漢），講師，博士，從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

2015-08-13