擠壓大米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

張煥麗，肖志剛，2，*，馬慧，聶文文（.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽0034；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱50030）

擠壓大米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

張煥麗1，肖志剛1，2，*，馬慧1，聶文文1
（1.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽110034；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為了研究擠壓和糖接枝改性的方法對大米蛋白功能性及結(jié)構(gòu)的變化的影響，本文研究了不同擠壓條件下擠壓的大米蛋白與葡聚糖的糖接枝反應(yīng)，分析了不同擠壓改性的大米蛋白對糖接枝反應(yīng)接枝度的影響，根據(jù)單因素試驗優(yōu)化反應(yīng)條件，在擠壓溫度90℃、大米蛋白水分含量35%，螺桿轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝得到的復(fù)合物，接枝度最大為（17.6±0.3）%，試驗測定接枝度為（17.6±0.3）%共聚物的溶解性和乳化性及表面疏水性。結(jié)果表明，與天然大米蛋白相比，擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的溶解性在較寬的范圍內(nèi)顯著增加，增加了8.4%～76.6%，乳化性和乳化穩(wěn)定性分別增加了62.2%和73.9%，表面疏水性降低了69.5%。同時，試驗通過傅里葉紅外光譜、SDS-PAGE電泳、掃描電鏡等方法和手段分析了大米蛋白亞基結(jié)構(gòu)及表面結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，擠壓糖接枝反應(yīng)顯著改變了蛋白亞基結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量分別增加了24.4%、26.0%和19.9%，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少了15.0%，SDS電泳分析結(jié)果顯示擠壓后大米蛋白與葡聚糖接枝反應(yīng)物的條帶51.0 ku和80 ku～82 ku亞基帶變得模糊，并且在分離膠和濃縮膠分理處出現(xiàn)大分子量分子，說明有共價連接大分量聚集物生成，掃描電鏡分析了表觀結(jié)構(gòu)變化，表明擠壓和糖接枝對蛋白結(jié)構(gòu)改變顯著。

大米蛋白；葡聚糖；糖接枝反應(yīng)；擠壓；功能性質(zhì)；結(jié)構(gòu)表征

大米蛋白是一種具有低致敏性和高生物效價等特性的優(yōu)質(zhì)蛋白，但由于大米蛋白含有75%～90%的疏水性谷蛋白，使大米蛋白的應(yīng)用受到限制［1-4］，因此，如何改變以谷蛋白為主的大米蛋白的溶解性和乳化性，已成為提高其在食品工業(yè)應(yīng)用生產(chǎn)價值的關(guān)鍵。

目前有研究報導(dǎo)，經(jīng)過脫氨基、美拉德反應(yīng)及磷酸化反應(yīng)改性可顯著降低大米蛋白的疏水性并改善其溶解性與乳化性［5-11］，其中美拉德反應(yīng)改性法因其天然無污染等優(yōu)點受到研究者青睞。但濕法糖接枝反應(yīng)只適用于單糖，而干熱法反應(yīng)時間長、反應(yīng)慢、工作效率低，因此為了改善美拉德反應(yīng)進程，管軍軍［12］等利用微波法促進大豆蛋白與糖的接枝反應(yīng)，提高了大豆蛋白的溶解性和乳化性，王中江等［13］借助超聲法加速綠豆蛋白與糖接枝反應(yīng)，提高產(chǎn)物的功能性，趙新淮［14］等研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶促進酪蛋白與氨基葡萄糖化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)改善其功能性質(zhì)，但是以上方法不易于控制，且不適用于工業(yè)連續(xù)化生產(chǎn)，因此，尋求一種快速便捷適用于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)的方法至關(guān)重要。

擠壓技術(shù)因其具有高效率、用時短、操作簡單且經(jīng)濟環(huán)保的特點，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。同時，擠壓也被應(yīng)用于蛋白的物理改性方面，蛋白在擠壓機內(nèi)的高溫、高壓、高剪切力及高能量水分子的協(xié)同作用下，其高級結(jié)構(gòu)去折疊、線性化和再交聯(lián)，蛋白空間構(gòu)象改變，并且適度的擠壓能夠改善蛋白的吸水性、乳化性等物理性質(zhì)［15-17］，但擠壓后蛋白分子聚集溶解性嚴重降低，因此本文旨在研究擠壓法與糖接枝復(fù)合改性條件對大米蛋白功能性和結(jié)構(gòu)的影響，并采用傅里葉紅外光譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳及掃描電子顯微鏡等技術(shù)手段對擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特性進行研究，同時從分子水平了解結(jié)構(gòu)變化與功能性質(zhì)間的關(guān)系，為改善大米蛋白的功能性質(zhì)及擴大大米蛋白的應(yīng)用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大米蛋白（蛋白含量82.5%）：江西金農(nóng)生物科技有限公司；OPA：Sigma公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS-NH4）；葡聚糖2萬、賴氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、硼砂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純。

1.2儀器設(shè)備

DS56-Ⅲ型雙螺桿擠壓膨化機（螺桿直徑為25mm，長徑比為16∶1機筒加溫區(qū)段為三段，圓形摸頭內(nèi)徑為4 mm）：濟南賽信膨化機械有限公司；F-4500熒光分光光度計：日本HITACHI公司；SDS-PAGE電泳儀：美國Bio-rad公司；Hitachi S-3400掃描電子顯微鏡：日立高新技術(shù)公司；MAGNA-IR560傅立葉變換紅外光譜系統(tǒng)：美國尼高力公司；FD5-3型冷凍干燥機：美國SIM公司等。

1.3方法

1.3.1擠壓大米蛋白制備

根據(jù)試驗要求將原料進行調(diào)質(zhì)過夜，固定喂料速度為10 kg/h，進行不同條件的擠壓試驗。擠壓溫度試驗：將擠壓機螺桿轉(zhuǎn)速調(diào)到200 r/min，將調(diào)質(zhì)成水分含量為35%大米蛋白送入喂料器，分別在擠壓機滾筒溫度為80、90、100、110、120℃條件下擠壓制備擠壓大米蛋白；擠壓物料水分含量試驗：將擠壓機螺桿轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min，擠壓機中間區(qū)域的滾筒溫度90℃，在此條件下將調(diào)質(zhì)成水分含量為15%、25%、35%、45%、55%的樣品送入喂料器進行擠壓制備擠壓大米蛋白；擠壓螺桿轉(zhuǎn)速試驗：將調(diào)質(zhì)成水分含量為35%大米蛋白送入喂料器在機螺桿轉(zhuǎn)速為160、200、240、280、320 r/min條件下擠壓制備擠壓大米蛋白。擠壓后的樣品：對擠壓處理的樣品，常溫干燥后，用粉碎機粉粹后過篩100目，備用。

1.3.2大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的制備

通過前期試驗及參考文獻，確定配制蛋白質(zhì)濃度為10 g/L的大米蛋白與葡聚糖溶液，用0.2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10.5，葡聚糖按照與蛋白配比為1∶1（質(zhì)量比）添加，反應(yīng)體系充分混勻后，100℃水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后立即冰浴終止反應(yīng)，將反應(yīng)液調(diào)到中性，透析24 h，冷凍干燥得到產(chǎn)物。

1.3.3接枝度的測定

采用Church等（1983）的鄰苯二甲醛（OPA）法測定游離氨基含量［18］。測定時，量取OPA試劑4 mL于試管中，注入200 μL樣品液，混勻后于35℃反應(yīng)2 min，在340 nm下測其吸光值A(chǔ)340。以賴氨酸作標準曲線，根據(jù)ΔA計算樣品中自由氨基含量，接枝度（DG）計算公式：

式中：C0為接枝反應(yīng)前溶液中自由氨基含量，mol/L；Ct為接枝反應(yīng)后溶液中自由氨基的含量，mol/L。

1.3.4溶解性的測定

按照Bradford法［19］測定，利用牛血清蛋白（BSA）做標準曲線，測定595 nm處吸光值，根據(jù)樣品中蛋白含量和溶液中蛋白含量計算溶解性，以氮溶解指數(shù)表示（NSI%）。

1.3.5乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參考Pearce濁度法［20］，并略有改動：配制0.1%的樣品溶液25 mL于pH 7.0，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中。取25 mL樣品溶液加入8 mL大豆油，室溫下于高速勻漿機中10 000 r/min均質(zhì)1 min，形成乳濁液。均質(zhì)結(jié)束后，分別在0 min與10 min從底部吸取100μL樣品，加入10mL0.1%SDS稀釋，于500nm處測定吸光度值（測定3次），乳化活性指數(shù)（Emulsification Activity Index，EAI）按下式計算：式中：EAI為乳化活性指數(shù)，m2/g；N為稀釋倍數(shù)；φ為體系中油相所占分數(shù)；C為蛋白濃度，g/mL；L為是比色池光徑（1 cm）。

乳化穩(wěn)定性（Emulsification Stability Index，ESI）按下式計算：

式中：ESI為乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min；A0為0 min時的吸光度值；ΔT為測定乳化性的兩次時間間隔，本試驗取10 min；A10為10 min時的吸光度值。

1.3.6表面疏水性的測定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）熒光探針法進行測定［21］，激發(fā)波長和吸收波長分別是390 nm和470 nm，以蛋白質(zhì)濃度對熒光強度作圖，以線性回歸斜率作為表面疏水性指標（H0）。

1.3.7傅里葉紅外光譜儀

用P2O5充分干燥凍干后的樣品，稱取樣品1 mg與100 mg KBr研磨、再混勻、最后進行壓片，進行傅里葉變換紅外光譜（FTIR）測定。檢測波數(shù)范圍4 000 cm-1～400 cm-1吸收光譜，分辨率為4 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，環(huán)境溫度25℃，掃描次數(shù)64次。

1.3.8聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳

采用SDS-PAGE非連續(xù)凝膠電泳對樣品進行分析，濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分數(shù)分別為4.0%和12%，考馬斯亮藍R-250染色蛋白質(zhì)Laemml的方法［22］。

1.3.9掃描電鏡（微觀結(jié)構(gòu)分析）

用導(dǎo)電雙面膠將樣品固定在樣品臺上，將少許樣品撒在雙面膠上，吹去多余的粉末，在真空下噴金后置于掃描電子顯微鏡中觀察并拍攝樣品形貌照片。

1.4數(shù)據(jù)處理分析

本研究中采用IBM SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進行處理，用OriginPro.8.5軟件繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1擠壓溫度對大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度的影響

在擠壓溫度80℃～120℃，大米蛋白水分含量35%，螺桿轉(zhuǎn)速200 r/min條件下擠壓大米蛋白，然后將擠壓大米蛋白與葡聚糖按比例為1∶1（質(zhì)量比），pH 10.5，水浴溫度90℃條件下反應(yīng)60 min，制備的擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝物，擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝物的接枝度測定結(jié)果見表1。

由表1可見，隨著擠壓溫度的升高，擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝物的接枝度先增加后減小，在擠壓溫度為90℃條件下擠壓的大米蛋白與葡聚糖的接枝物，接枝度有最大值（17.5±0.3）%，這可能是由于大米蛋白在擠壓機內(nèi)，受到擠壓、剪切、高壓等作用，蛋白變性，蛋白分子部分聚集和展開，使游離氨基部分暴露，在與葡聚糖接枝反應(yīng)時，利于糖接枝反應(yīng)進行，而當擠壓溫度過高時，蛋白變性程度變大，蛋白聚集程度變大，蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，因此與葡聚糖接枝反應(yīng)時，不利于接枝反應(yīng)的進行［16-17］，所以選擇最適宜的擠壓溫度為90℃。

表1　擠壓溫度對大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度的影響Table 1　Effect of barrel temperature on the degree of substitution of extruded rice protein-dextran conjugates

2.1.2擠壓大米蛋白水分含量對大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度的影響

不同水分含量擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度測定結(jié)果見表2。

表2　擠壓物料水分含量對大米蛋白和葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度的影響Table 2　Effect of moisture on the degree of substitution of extruded rice protein-dextran conjugates

由表2結(jié)果可知，隨著大米蛋白水分含量的升高，擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝物接枝度先增加后減小，在大米蛋白水分含量為35%時，擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝物接枝度有最大值（17.0±0.3）%，可能是因為水分較低時，大米蛋白的粘滯性較大，在擠壓機中停留時間長，受高溫高壓作用變性程度大，蛋白發(fā)生部分分解，內(nèi)部的基團暴露，利于與葡聚糖接觸反應(yīng)，而當水分過大，水分子潤滑作用使物料粘度下降，流動阻力減少，使物料在擠壓機內(nèi)部停留時間較少，變性程度?。?1］，不利于與糖接枝反應(yīng)，因此擠壓蛋白水分含量對蛋白變性程度影響很大，因此選擇擠壓蛋白水分含量為35%的擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝反應(yīng)。

2.1.3擠壓螺桿轉(zhuǎn)速對大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度的影響

不同螺桿轉(zhuǎn)速條件下擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度測定結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著擠壓螺桿轉(zhuǎn)速的升高，擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度先增加后減小，在擠壓螺桿轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度有最大值（17.3±0.3）%，可能是因為轉(zhuǎn)速低時，蛋白受到擠壓作用，能量聚集，蛋白分子部分聚集和降解程度小，而增大轉(zhuǎn)速，物料停留時間短，高螺桿轉(zhuǎn)速，蛋白擠壓受到更強的壓力，因此蛋白變性嚴重，蛋白分子聚集程度過大［15］，不利于后來與葡聚糖接枝反應(yīng)進行，所以選擇擠壓螺桿轉(zhuǎn)速為200 r/min的擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝反應(yīng)。

表3　擠壓螺桿轉(zhuǎn)速對大米蛋白和葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度的影響Table 3　Effect of screw speed on the degree of substitution of extruded rice protein-dextran conjugates

2.1.4擠壓改性的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的制備

根據(jù)上述研究，在擠壓溫度90℃，螺桿轉(zhuǎn)速200 r/ min，擠壓水分含量35%條件下制備擠壓大米蛋白，按照1.3.2的方法，擠壓大米蛋白與葡聚糖配比為1∶1（質(zhì)量比），pH為10.5，溫度為90℃，反應(yīng)時間60 min進行糖接枝反應(yīng)制備擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物，接枝度為（17.6±0.3）%，相同的反應(yīng)條件下比與天然大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度提高了50%，可能是由于擠壓的剪切、碰撞、高壓等作用力使大米蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集和部分降解，使一部分氨基暴露，因此在與葡聚糖接枝反應(yīng)，加速了蛋白與糖接枝反應(yīng)的進行［16-17］。通過對該條件制備的擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物與天然大米蛋白和擠壓大米蛋白進行對比，分析擠壓大米蛋白接枝復(fù)合物的功能特性及結(jié)構(gòu)變化。

2.2產(chǎn)物的功能性質(zhì)

2.2.1溶解性的測定結(jié)果

天然大米蛋白、擠壓大米蛋白、擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的溶解性見圖1。

由圖1可知，與天然大米蛋白相比，擠壓大米蛋白的溶解性在較寬pH值范圍內(nèi)顯著降低，而擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物在較寬pH范圍內(nèi)，溶解性顯著提高8.4%～76.6%?？赡苁怯捎诖竺椎鞍自跀D壓的高壓、高剪切力條件下使大米蛋白分子分子結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)分子部分地展開或聚集，使內(nèi)部部分疏水基團暴露，大米蛋白質(zhì)分子通過非共價相互作用形成大分子聚集體，蛋白溶解性表現(xiàn)降低趨勢［23］，但擠壓后的大米蛋白，由于蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露了利于與葡聚糖進行接枝反應(yīng)的氨基基團，使接枝反應(yīng)順利進行，多糖多羥基的引入，能夠使蛋白親水性增加，改變蛋白的溶解性［24］，因此適當?shù)臄D壓條件改性大米蛋白與葡聚糖接枝反應(yīng)，能夠一定程度改變原有大米蛋白蛋白的溶解性。

圖1　 不同處理樣品的溶解性Fig.1　Plots of solubility of samples obtained at different modified methods

2.2.2擠壓改性的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的乳化性

天然大米蛋白、擠壓大米蛋白、擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的乳化性及乳化穩(wěn)定性結(jié)果見圖2。

圖2　不同處理樣品的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.2　Plots of EAI and ESI of samples obtained at different modified methods

由圖2可知，與天然大米蛋白相比，擠壓大米蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性提高，而擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的乳化活性大幅提高，提高了62.2%，擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物乳化穩(wěn)定性增高了73.9%。大米蛋白分子中因含有大量的疏水性氨基酸，高含量的疏水性氨基酸之間通過疏水作用相互靠近，生成大量的二硫鍵，導(dǎo)致蛋白分子聚集沉淀，從而影響的大米蛋白乳化性，但是蛋白經(jīng)過擠壓機的碰撞及高壓作用可能使蛋白發(fā)生部分降解或二硫鍵斷裂，大米蛋白的結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，其間可能發(fā)生二硫鍵存在狀態(tài)的變化以及蛋白質(zhì)顆粒的聚集、解聚現(xiàn)象，其次級鍵被打開，使蛋白分子進一步伸展，極性，原先包埋在分子內(nèi)部的疏水性基團暴露，增強了親油性，從而增加了乳化性，糖接枝反應(yīng)，引入多羥基，分子表面形成水化層，增加了蛋白結(jié)構(gòu)中的親水性羥基基團數(shù)量，蛋白質(zhì)部分可有效地吸附在油/水界面上，從而增加了接枝物的乳化活性，而葡聚糖具有大分子的空間穩(wěn)定作用，使得蛋白分子受到阻礙，不易靠近而聚集沉淀［11］，降低界面的張力起到穩(wěn)定乳狀液的作用［24-25］，因此經(jīng)過擠壓改性后的大米蛋白進行糖接枝反應(yīng)能夠更好的改善疏水性大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性。

2.3接枝復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1擠壓改性的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的表面疏水性

利用熒光探針ANS法檢測擠壓的大米蛋白與葡聚糖的接枝復(fù)合物在pH 7.0時的表面疏水指數(shù)，如圖3所示。

圖3　 不同處理樣品的表面疏水性Fig.3　Plots of surface hydrophobicity（H0）of samples obtained at different modified methods

由圖3可知，與天然大米蛋白相比，擠壓大米蛋白的疏水性降低39.6%，而擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的疏水性降低69.5%；可能是因為原蛋白表面帶有較多的電荷，蛋白質(zhì)-水相互作用較大，而蛋白經(jīng)擠壓后，蛋白質(zhì)分子部分聚集和降解，使疏水基團向分子內(nèi)部引入，表面疏水性變小，而當葡聚糖接枝到擠壓大米蛋白上，多羥基的引入使親水性基團的數(shù)量增多，蛋白質(zhì)-水靜電相互作用降低而蛋白質(zhì)內(nèi)疏水相互作用占優(yōu)勢地位，表面疏水基團進一步向分子內(nèi)聚集，從而形成更加有序的蛋白結(jié)構(gòu)，致使蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)大幅降低［26-27］，從而影響了蛋白的溶解及乳化性能。

2.3.2擠壓改性的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的紅外分析

本試驗利用傅里葉紅外光譜法，對天然大米蛋白、擠壓大米蛋白和擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物FT-IR光譜進行分析，見圖4。

圖4　不同處理樣品的傅里葉紅外光譜分析圖譜Fig.4　Plots of Fourier transform infrared spectroscopy of samples obtained at different modified methods

由圖4可以看出，與葡聚糖接枝后的大米蛋白的紅外光譜既具有蛋白的酞胺化合物的吸收帶特征峰，又具有糖的特征吸收峰［25］，復(fù)合產(chǎn)物在在3 350 cm-1附近存在由O-H和N-H形成的較寬的吸收帶，這是由于新物質(zhì)共價交聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)了新的N-H鍵，在1651 cm-1（酰胺I）處有強烈的C=O的伸縮振動，說明此處基團發(fā)生了反應(yīng)，此振動可形成β-轉(zhuǎn)角，1 539（酰胺Ⅱ）N-H鍵伸縮振動增強存在N-H的變角振動，其屬于β-折疊，是由伸展的多肽鏈組成的，在1 153 cm-1（酰胺Ⅲ）處峰屬于N-H變角振動和C-N伸縮振動所形成的α-螺旋和無規(guī)則卷曲；同時在1020 cm-1出現(xiàn)了較強的吸收，這可能是由于羥基的接入而出現(xiàn)的O-H彎曲振動［28］，在2 926 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的通常為-CH2和-CH3的飽和C-H反射峰［29］，通過對產(chǎn)物紅外圖譜的分析，可以推斷出，擠壓的大米蛋白與葡聚糖發(fā)生了接枝反應(yīng)，通過共價結(jié)合生成共聚物。

為了進一步定量分析樣品的結(jié)構(gòu)變化，本試驗利用多峰分析peakfitv4.12軟件對蛋白質(zhì)的FT-IR光譜進行二階導(dǎo)數(shù)IR去卷積光譜擬合分析得到了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定性定量信息結(jié)果見表4。

由表4可知，與天然大米蛋白相比，擠壓的大米蛋白α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)分別增加了14.5%、14.6%、30.5%，β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少了14.6%，擠壓糖接枝α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量分別增加了24.4%、26.0%和19.9%，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少了15.0%，這可能是由于擠壓處理產(chǎn)生的剪切、碰撞等物理作用，使一部分蛋白分子發(fā)生聚集，造成二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化，這種變化與蛋白質(zhì)的重聚集有關(guān)，研究表明由于氫鍵作用，β-折疊結(jié)構(gòu)易存在于蛋白質(zhì)聚集體內(nèi)部，擠壓大米蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)含量的降低，也表明了蛋白發(fā)生了部分降解［15-16］，從而證實了這種變化，而糖接枝反應(yīng)增加了α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角等有序二級結(jié)構(gòu)，同時β-折疊向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化。

2.3.3擠壓改性的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的電泳分析

表4　不同處理樣品的二級結(jié)構(gòu)含量分析Table 4　The content of second research of samples obtained at different modified methods

為了進一步研究擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物亞基結(jié)構(gòu)的變化，對天然大米蛋白、擠壓大米蛋白、擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物樣品進行SDS-PAGE分析（圖5）。

圖5　不同處理樣品的電泳圖Fig.5　Plots of SDS-PAGE of samples obtained at different modified methods

由圖5可以看出，天然大米蛋白的SDS-PAGE電泳圖很清晰地顯示出大米蛋白（圖5，帶1）各亞基的條帶大概分布在22.0、37.0、51.0 ku和80 ku～82 ku，擠壓大米蛋白（圖5，帶2）則沒有表現(xiàn)出明顯不同，仍具有典型的條帶，擠壓后的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物（圖5，帶3）的條帶51.0 ku和80 ku～82 ku亞基帶變得模糊，并且在分離膠和濃縮膠分理處出現(xiàn)大分子量分子，表明擠壓的大米蛋白與糖接枝反應(yīng)作用改變了蛋白的亞基結(jié)構(gòu)［30］，而大米蛋白疏水性的減弱，這表明擠壓造成的蛋白分子聚集可能由共價鍵連接，可能擠壓作用，蛋白分子聚集，使疏水性基團向分子內(nèi)部引入［31］，而糖接枝反應(yīng)則改變了蛋白的亞基結(jié)構(gòu)，大分子量接枝物出現(xiàn)，也從側(cè)面說明了擠壓后的大米蛋白，能夠促進接枝反應(yīng)的進行，蛋白結(jié)構(gòu)改變有利于蛋白分子和多糖的結(jié)合，從而改變了接枝產(chǎn)物的溶解性和乳化性能。

2.3.4擠壓改性的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物電鏡分析

通過SEM觀察蛋白表面結(jié)構(gòu)從而對其結(jié)構(gòu)進行分析，本試驗對天然大米蛋白、擠壓大米蛋白、擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物SEM觀察結(jié)果見圖6。

圖6　不同處理樣品的SEM圖Fig.6　Plots of Size exclusion chromatography of of samples obtained at different modified methods

圖6顯示：天然大米蛋白表面呈塊狀的顆粒狀（圖6，a），擠壓的大米蛋白會呈現(xiàn)出整片的片層結(jié)構(gòu)及多孔結(jié)構(gòu)（圖6，b），這可能是因為大米蛋白在溫度、轉(zhuǎn)速、剪切力的綜合作用下，內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化［32］，維持蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)的非共價鍵可能被破壞，蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生各種化學(xué)作用，形成聚合體結(jié)構(gòu)，同時也說明大米蛋白在擠壓過程中發(fā)生不同程度的降解及聚合，其天然有序結(jié)構(gòu)被打破，蛋白質(zhì)分子間相互降解及聚合，形成纖維片狀結(jié)構(gòu)［12］，而擠壓大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物（圖6，c）展現(xiàn)出更無序和不規(guī)則的的碎片結(jié)構(gòu)，擠壓糖接枝改變了大米蛋白的表面結(jié)構(gòu)，多糖分子的引入，使大米蛋白原有的剛性結(jié)構(gòu)消失，肽鏈伸展，分子擴散開來，改變結(jié)構(gòu)［14］，因此高疏水性的大米蛋白在經(jīng)過擠壓后，更有利于與葡聚糖接枝反應(yīng)，并且擠壓后進行糖接枝反應(yīng)的接枝復(fù)合物的功能性提高，也說明了擠壓對大米蛋白改性有一定的作用。因此擠壓糖接枝改善大米蛋白的溶解性和乳化性可能與擠壓后蛋白結(jié)構(gòu)變化有很大關(guān)系。

3　結(jié)論

在擠壓溫度90℃、大米蛋白水分含量35%，螺桿轉(zhuǎn)速200 r/min條件下擠壓的的大米蛋白與葡聚糖接枝反應(yīng)得到的接枝復(fù)合物，接枝度最大為（17.6±0.3）%，同時，該接枝復(fù)合物與天然大米蛋白相比，在較寬pH范圍內(nèi)，溶解性顯著提高8.4%～76.6%，乳化性和乳化穩(wěn)定性分別增加了62.2%和73.9%，表面疏水性降低了69.5%，表明了，擠壓糖接枝反應(yīng)能夠提高大米蛋白的溶解性和乳化性。通過傅里葉紅外光譜結(jié)果分析表明，擠壓糖接枝反應(yīng)顯著的改變了蛋白亞基結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量分別增加了24.4%、26.0%和19.9%，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少了15.0%；SDS電泳結(jié)果分析顯示，擠壓的大米蛋白與葡聚糖接枝復(fù)合物的分子量為51.0 ku與80 ku～82 ku亞基帶變得模糊，并且在分離膠和濃縮膠分理處出現(xiàn)大分子量分子，說明大米蛋白與葡聚糖發(fā)生了共價結(jié)合；掃描電鏡分析了蛋白的表觀結(jié)構(gòu)變化，表明擠壓和糖接枝對蛋白結(jié)構(gòu)改性顯著。因此，適當?shù)臄D壓條件擠壓改性大米蛋白與葡聚糖進行接枝反應(yīng)得到的接枝產(chǎn)物具有良好的乳化性能，能夠為大米蛋白應(yīng)用與工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，因此擠壓糖接枝改性對提高大米蛋白的應(yīng)用價值有一定的意義。

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The Function Properties and Structural Characterization of Extruded Rice Protein-Dextran Conjugates

ZHANG Huan-li1，XIAO Zhi-gang1，2，*，MA Hui1，NIE Wen-wen1
（1.College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang 110034，Liaoning，China；2.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

molecular weight changes and apparent characterization of rice protein by the methods and means of Fourier infrared spectrum and SDS-PAEG electrophoresis and SEM，the results analysis showed that extrusion and grafting reaction changed the structure of protein subunits significantly，the content of α-helix and β-turn and random coil increased by 24.4%，26.0%and 19.9%，respectively，and β-sheet structure content decreased by 15.0%，significantly，SDS electrophoresis analysis results showed that the extruded rice protein and dextran conjugates the line of 51.0 ku and 80 ku-82 ku become blurred，a high molecular weight appeared in the region between acrylamide separating gel with acrylamide stacking gel，indicated molecular weight have happened a big weight aggregates of covalent connection，the SEM analysis of the apparent structure，indicated the graft reaction and s extrusion modified protein structure significantly.

riceprotein；dextran；graftingreaction；extrusion；functionalproperties；structuralcharacterization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.029Abstract：In order to prepare a high solubilizing and emulsibity rice protein，the method wet-heating grafting reaction of extruded rice protein and dextran was ultilized to study the influence of barrel temperature，the material moisture content and screw speed on the degree of substitution.The optimal process conditions were determined through single factor experiment analysis：barrel temperature 90℃，35%moisture content of material，screw speed 200 r/min，Under this condition，the degree of substitution reached at（17.6±0.3）%.The solubility and emulsification，surface hydrophobicity of extruded rice protein-dextran conjugates on the degree of substitution of（17.6±0.3）%was investigated，the results showed that compared with the native rice protein，the solubility of extruded rice protein and dextran conjugates increased significantly in a wide range，increased by 8.4%-76.6%，the emulsification activity and emulsification stability increased by 62.2%and 73.9%，respectively，the surface hydrophobicity decreased by 69.5%.Meanwile，experiment analyzed subunit structure and

國家星火重點項目（2015GA650007）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀科技人才支持計劃（第一層次）資助專項（LR2015062）；遼寧省組織部“百千萬人才工程”百層次人選資助專項（2013B028）

張煥麗（1992—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：生物化工。

2016-03-01