川丹通脈片中丹參酮ⅡA含量測(cè)定研究

汪 濤，胡衛(wèi)東，李育芳，巴夏玲，程 波（.解放軍武漢療養(yǎng)院藥械科，湖北 武漢 430074；.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030）

川丹通脈片中丹參酮ⅡA含量測(cè)定研究

汪 濤1，胡衛(wèi)東1，李育芳1，巴夏玲1，程 波2
（1.解放軍武漢療養(yǎng)院藥械科，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030）

目的：建立川丹通脈片中有效成分丹參酮ⅡA含量測(cè)定HPLC方法。方法：選用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-水（75∶25）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃。結(jié)果：HPLC法測(cè)定丹參酮ⅡA不存在干擾，丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在1.486 ～ 44.570 μg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，線性關(guān)系良好；加樣回收率為100.1%，RSD為1.37%。結(jié)論：該質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠，可作為川丹通脈片中丹參酮ⅡA的含量測(cè)定方法。

川丹通脈片；丹參酮ⅡA；高效液相色譜法；含量測(cè)定

川丹通脈片為解放軍武漢療養(yǎng)院配制的純中藥制劑，軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑批準(zhǔn)文號(hào)：廣制字（2013）F03002。該制劑由中藥川芎、丹參、海風(fēng)藤、豬牙皂、地龍組成，采取中藥粉末與中藥提取浸膏混合后制粒，顆粒干燥后壓片的方法制備，屬于半浸膏素片。具有活血化瘀，祛痰開竅，擴(kuò)張血管，增進(jìn)心、腦動(dòng)脈血流量的功效。用于治療心絞痛，心肌梗死，腦血栓形成等癥。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)川丹通脈片中丹參所含丹參酮ⅡA進(jìn)行了含量測(cè)定，為該制劑建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供理論參考。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；色譜柱為welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；LC-350A型超聲波中藥處理機(jī)（濟(jì)寧市市中區(qū)魯超儀器廠）。

丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110766-200619）。川丹通脈片（規(guī)格：0.3 g，批號(hào)150212、150305、150317）由解放軍武漢療養(yǎng)院提供。水為純水機(jī)凈化水（純水機(jī)型號(hào)Millipore Milli-Q Biocel型純水器）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 丹參酮ⅡA含量測(cè)定［1］

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以甲醇-水（75∶25）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃。按丹參酮ⅡA色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)，應(yīng)不得低于2000。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 精密稱取丹參酮ⅡA 6.19 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.123 8 mg·mL-1）。再精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為14.86 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取本品粉末約0.5 g（批號(hào)150212），精密稱定，置具塞棕色錐形瓶內(nèi)，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）15 min，冷卻后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液 取除去丹參以外的其它藥材，按確定的制備工藝生產(chǎn)陰性供試品。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn)

將上述3種溶液各10 μL，分別進(jìn)樣分析，色譜圖中，丹參酮ⅡA色譜峰峰形對(duì)稱，達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照溶液無干擾，該方法專屬性良好，見圖1。

圖1　川丹通脈片中丹參酮ⅡA含量測(cè)定色譜圖A - 對(duì)照品，B - 供試品，C - 陰性對(duì)照；1 - 丹參酮ⅡAFig 1 The chromatograms of content determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tabletsA - reference substance， B - sample， C - negative reference substance；1 - tanshinoneⅡA

2.4線性關(guān)系的考察

分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.123 8 mg·mL-1）0.6、1.2、3、6、12、18 mL，置50 mL具塞棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的對(duì)照品溶液。按濃度由低到高的順序，依次精密吸取不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定丹參酮ⅡA峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱坐標(biāo)（Y）為色譜峰面積，橫坐標(biāo)（X）為質(zhì)量濃度；線性回歸方程為：Y = 0.974 0 X + 0.015 6，r = 1。結(jié)果表明：丹參酮ⅡA對(duì)照品在1.486 ～ 44.570 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好［2］。

2.5儀器精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)150212）10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為0.23%。結(jié)果表明儀器精密度良好［3］。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)150212）6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果供試品中丹參酮ⅡA的平均含量為0.754 8 mg·g-1，RSD為0.67%［4］。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)150212），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)定峰面積值的RSD為0.52%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.123 8 mg·mL-1）3、5、10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液（濃度分別為3.714 μg·mL-1、6.190 μg·mL-1、12.380 μg·mL-1）。再精密稱取已知準(zhǔn)確含量的同一批川丹通脈片（批號(hào)150212）共9份，分別精密加入上述不同濃度的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液25 mL，每個(gè)濃度制備3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示丹參酮ⅡA的平均回收率為100.1%，RSD 為1.37%［4-5］，詳見表1。

2.9耐用性實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)150212）的川丹通脈片粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，采用3種不同品牌的色譜柱，依法測(cè)定，結(jié)果如下：welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）：分離度 ＞ 5，理論塔板數(shù)15 715，含量為0.761 4 mg·g-1；Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）：分離度＞ 5，理論塔板數(shù)9019，含量為0.750 3 mg·g-1；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）：分離度＞ 5，理論塔板數(shù)15 094，含量為0.754 8 mg·g-1；RSD為0.74%，表明3種不同品牌色譜柱均能重現(xiàn)現(xiàn)有方法。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 The results of sample recovery rate test. n = 9

2.10供試品的含量測(cè)定

取本品3批，批號(hào)分別為150212、150305、150317，按正文“2.2”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2　供試品中丹參酮ⅡA的含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 The result of content determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tablets

3 討論

3.1含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇

川丹通脈片由5味中藥材組成，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明川芎、丹參能擴(kuò)張血管，增加心腦動(dòng)脈血流量［6-12］，起到活血化瘀，行氣開竅的作用，共為君藥；地龍，清熱定驚，為臣藥；豬牙皂、海風(fēng)藤有祛痰開竅功效，同為佐藥。在建立川丹通脈片中有效成分含量測(cè)定方法的過程中，根據(jù)川丹通脈片所含5味藥材所起作用及用量，分別對(duì)川芎、丹參中的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)。在對(duì)川芎的有效成分阿魏酸進(jìn)行含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)，HPLC色譜圖中色譜峰峰形不對(duì)稱，峰形不標(biāo)準(zhǔn)，表明在測(cè)定阿魏酸含量的實(shí)驗(yàn)過程中，存在較大干擾。因此，川丹通脈片不宜采用阿魏酸進(jìn)行含量測(cè)定。

丹參為方中君藥，丹參酮ⅡA為丹參的專屬性成分。在測(cè)定丹參酮ⅡA含量時(shí)，含量測(cè)定及加樣回收實(shí)驗(yàn)均不存在干擾，故選擇丹參酮ⅡA作為控制川丹通脈片質(zhì)量的指標(biāo)成分。

3.2流動(dòng)相的選擇

《中華人民共和國藥典》2015年版一部中丹參項(xiàng)下測(cè)定丹參酮類含量，是進(jìn)行HPLC梯度洗脫，由于設(shè)備條件有限，所以只采用高效液相色譜儀進(jìn)行丹參酮ⅡA的含量測(cè)定。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，選定以甲醇-水（75∶25）為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示供試品溶液峰形較好，丹參酮ⅡA能夠達(dá)到基線分離，故最終采用此作為流動(dòng)相。

3.3丹參酮ⅡA含量限度的確定

由于《中華人民共和國藥典》2015年版一部中對(duì)丹參中丹參酮類的含量有規(guī)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，選擇丹參酮ⅡA的含量為重點(diǎn)控制對(duì)象［13］。根據(jù)含量測(cè)定的結(jié)果及大量配制中的實(shí)際情況，建議川丹通脈片應(yīng)含丹參酮ⅡA≥0.20 mg·片-1。

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Determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tablets

WANG Tao1， HU Wei-dong1， LI Yu-fang1， BA Xia-ling1， CHENG Bo2
（1. The Drug and Equipment Section of Wuhan Sanatorium of People's Liberation Army， Wuhan 430074， China； 2. The Schools' Laboratory of Pharmacy in Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China）

Objective: To establish a determination method of active ingredient in Chuandan Tongmai tablets. Methods: The Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used， with the mobile phase consisted of methanol-water （75∶25）. The detection wavelength was set at 270 nm， velocity of flow was 1.0 mL·min-1， the column temperature wa 35 ℃. Results: The tanshinoneⅡA was not intervened with other impurities in this HPLC method. The calibration curve was linear when the concentrations of tanshinoneⅡA were within the range of 1.486 - 44.570 μg·mL-1. The average recovery was 100.1% （RSD = 1.37%）. Conclusion: The method is simple， stable， reliable， and can be adopted as the quality control method.

Chuandan Tongmai tablets； TanshinoneⅡA； HPLC； Content determination

R917

A

1672 - 8157（2016）04 - 0214 - 03

2015年軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃項(xiàng)目（14TG0199）

汪濤，男，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、中藥制劑。E-mail：taidi1127@126.com

2016-03-04

2016-05-23）