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    苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)的作用研究

    2016-09-08 08:02:59
    環(huán)球中醫(yī)藥 2016年6期
    關(guān)鍵詞:總皂苷苦瓜尿蛋白

    陳 偉 田 魯 李 易 王 港 高 珊

    苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)的作用研究

    陳偉田魯李易王港高珊

    目的 評價苦瓜總皂苷治療2型糖尿病腎病大鼠的療效。方法 雄性SD大鼠隨機分為正常組、2型糖尿病腎病組(模型組)以及苦瓜總皂苷組(治療組),每組16只,比較治療4周后、8周后HIF-1α和VEGF表達(dá)特點。結(jié)果 與模型組相比,治療組尿蛋白和血清肌酐明顯減少,血糖明顯升高(P<0.05);HE染色可見苦瓜總皂苷對糖尿病腎病帶來的腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生有一定改善;RT-PCR和Western Blot可見:與模型組相比,治療組大鼠腎臟組織HIF-1α、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 苦瓜總皂苷可抑制HIF-1α及VEGF的表達(dá),改善糖尿病大鼠腎功能及腎臟損害,進而延緩2型糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

    苦瓜總皂苷; 缺氧誘導(dǎo)因子-1α; 血管內(nèi)皮生長因子; 2型糖尿??; 腎功能

    隨著人們生活水平的提高,糖尿病特別是2型糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的一大疾病,其與腫瘤、心血管疾病并稱為威脅人類健康的三大慢性非傳染性疾病[1]。糖尿病患者的危害不光是血糖的升高,由血糖升高帶來的心腦血管病、腎病等也嚴(yán)重危害著人們的健康,有研究顯示在所有需要血透治療的疾病中糖尿病腎病處于第二位,糖尿病腎病已經(jīng)成為威脅糖尿病患者的一大疾?。?]。關(guān)于糖尿病腎病的發(fā)生機制研究較多,目前認(rèn)為血脂失調(diào)、血壓異常、氧化應(yīng)激以及血糖毒害等均參與了本病的進展,而上述的幾條毒害都與腎組織缺氧密不可分[3]。腎臟組織缺氧可以直接誘導(dǎo)腎臟組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá)升高,HIF-1α表達(dá)的升高可以激活血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá),最終造成一系列腎臟病理反應(yīng)[4]。本研究以高糖高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型,分析格列齊特治療后,其腎臟組織中HIF-1α、VEGF表達(dá)特點,以期為苦瓜總皂苷的藥物開發(fā)和本病的治療提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1動物和試劑盒及儀器

    清潔級雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量180~200 g,購自華中科技大學(xué)動物實驗中心,合格證號:SCXK(鄂)2010-0009,均在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后行相應(yīng)實驗。

    血糖、血肌酐和血白蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)、總RNA提取試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)、瓊脂糖(上海仁凱生物科技有限公司)、引物(上海生工生物股份有限公司),多克隆抗體HIF-1α、單克隆抗體β-actin以及及ECL發(fā)光試劑盒(美國 Santa Cruz公司)、單克隆抗體VEGF(Abcam公司)、二抗(金斯瑞生物科技有限公司)。

    TDZ5-WS型低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器公司)、UV1100型紫外分光光度儀(Techcomp公司)、7900HTPCR儀(ABI公司)、中晶2500型掃描儀(上海中晶科技有限公司)、Mini-Protean Tetra蛋白電泳儀(美國Bio-rad公司)。

    1.2動物分組及造模方法

    大鼠隨機分成正常對照組、2型糖尿病腎病模型組(模型組)以及苦瓜總皂苷干預(yù)組(治療組),每組16只,其中糖尿病腎病組和模型組施行單側(cè)腎切除手術(shù),手術(shù)具體操作方法為:(1)1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉,固定;(2)切開大腹部找到左腎;(3)將左腎蒂部位結(jié)扎并摘除,之后給青霉素注射、縫合;(4)正常組大鼠采用同樣方法處理,但腎臟不摘除;(5)手術(shù)后每天給予大鼠肌注青霉素1周。

    將大鼠再飼養(yǎng)3周后,糖尿病腎病組以及模型組給予鏈脲佐菌素60 mg/kg一次性腹腔注射,注射3天后尾靜脈取血,血糖儀測定,空腹血糖>16.7 mmol/L時判定造模成功。

    模型建立成功后,正常組和模型組給予生理鹽水灌胃,苦瓜總皂苷治療組給予苦瓜總皂苷灌胃,于實驗2、4、6、8周末分別測大鼠血糖水平;實驗第4周、8周處死大鼠各半,測24小時尿蛋白定量;腎組織HE染色、RT-PCR以及Western Blot檢測腎組織HIF-1α和VEGF表達(dá)。

    1.3標(biāo)本收集

    1.3.1尿液標(biāo)本收集 大鼠置于代謝籠收集24小時尿液并計算總尿量。24小時尿蛋白量采用公式為:24h尿蛋白量(mg)=尿蛋白濃度(g/L)×24h尿量(mL)。

    1.3.2血液和腎臟收集 第2周和第6周采用斷尾法收集大鼠血液,分別于第4周、第8周后禁食12小時后,10%水合氯醛(2.0 mL/kg)麻醉,麻醉完成后沿大鼠腹中線切開暴露心臟,拿注射器心尖取血,取血后摘除右腎。全自動生化分析儀測定血清白蛋白及血清肌酐值。

    1.4HE染色

    腎臟取出后,統(tǒng)一切腎尖端處四分之一置于4%的中性多聚甲醛溶液中保存,之后交由黃石市中心醫(yī)院病理科完成,得到切片后,光鏡觀察照相。

    1.5半定量PCR

    從超低溫冰箱中取出腎臟組織用手術(shù)刀小心稱取30 mg,碾磨棒將組織碾磨勻漿,然后提取總RNA并定量,定量后調(diào)平,之后參照文獻[5]進行PCR擴增mRNA和凝膠電泳,引物序列如下。

    HIF-1α引物設(shè)計為:Primer A:5′AATGGGATCGTGAAACGCCG3′,Primer B:5′AGGGGAGCATGTTCCTGATG3′;

    VEGF引物設(shè)計為:Primer A:5′AGTCACCATGGGAAGAGACT3′,Primer B:5′CTGTTCCGTCGACCACCATT3′;

    β-actin引物設(shè)計為:Primer A:5′GTGACGGAGCGCCAAGCAAGAG-3′,Primer B:5′ACGCACTGTAACTTGGGAAGTGTGG-3′。

    1.6Western Blot檢測

    取腎臟組織小心稱取100 mg電子勻漿機磨碎,勻漿后低溫高速離心機離心(4000 rpm),離心后每組各取樣本80 μg進行SDS-PAGE蛋白電泳,電泳方法按照文獻進行[5]。

    1.7統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊,則采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD,方差不齊則采用秩和檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    圖1 大鼠腎臟切片HE染色

    2 結(jié)果

    2.1實驗大鼠一般情況

    從造模成功后開始記錄大鼠一般情況,發(fā)現(xiàn)正常組大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)以及平?;顒泳#瑫r毛發(fā)光滑,呈明顯的白色;模型組大鼠均呈現(xiàn)出明顯的多尿、多飲、多食等癥狀,其精神明顯不佳,此外毛發(fā)可見其明顯雜亂,同時表現(xiàn)有淡黃色(可能沾有尿液);治療組大鼠則不同,治療組大鼠在治療4周后相較于正常組飲食也呈增加的趨勢,但沒有模型組增加量大,治療8周后與治療4周后情況基本一致。

    2.2血糖、24小時尿蛋白定量以及血肌酐和血白蛋白的比較

    治療開始后,每2周測定一次大鼠血糖,由表1可以看出,相較于模型組,苦瓜總皂苷可以明顯降低2型糖尿病腎病大鼠血糖,同時其血糖隨著治療時間的增加,有逐漸降低的趨勢;由表2可以看出,經(jīng)苦瓜總皂苷治療后,治療組24小時尿蛋白量以及血漿肌酐較模型組明顯下降(P<0.05),血漿白蛋白明顯升高(P<0.05)。詳見表1、表2。

    表1 治療全程中大鼠血糖變化(mmol/L,x±s,n=16)

    表2 治療后大鼠24小時蛋白尿量、以及血肌酐和血白蛋白變化水平變化(x±s,n=16)

    2.3HE染色

    正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰,同時其腎小球以及腎小管形狀也較為致密和規(guī)則,模型組大鼠腎小管較大,腎小球受到了一定的擠壓,為輕微的炎癥反應(yīng),治療4周后,大鼠腎小管逐步縮小,細(xì)胞也趨于致密,治療8周后,大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰,腎小球、腎小管形狀較為規(guī)則,但仍有一定的炎癥反應(yīng)。詳見圖1。

    2.4大鼠HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)

    與模型組相比,治療4周后大鼠肝臟HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)有一定的降低,但改善不明顯,治療8周后則明顯低于模型組(P<0.05)。詳見圖2和表3。

    2.5大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)

    與模型組相比,治療4周后大鼠肝臟HIF-1α和VEGF蛋白有一定的降低,但無統(tǒng)計學(xué)意義,治療8周后則明顯低于模型組(P<0.05)。詳見圖3和表4。

    圖2 各組大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)

    表3 治療4周和治療8周后,大鼠HIF-1α和VEGF mRNA相對表達(dá)(n=16,x±s)

    圖3 各組大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的表達(dá)

    表4 治療4周和治療8周后,大鼠HIF-1α和VEGF蛋白相對表達(dá)(n=16,x±s)

    3 討論

    糖尿病是世界三大威脅人類健康的疾病之一,特別是2型糖尿病在整個世界范圍內(nèi)均呈高發(fā)的態(tài)勢。以美國為例,全美約有7%的人患有2型糖尿病,同時每年遞增200萬。中國有糖尿病患者超過9000萬,從患病人數(shù)上來說,已經(jīng)成為糖尿病第一大國,其危害不言而喻[5]。2型糖尿病的危害在于其糖脂代謝異常帶來的并發(fā)癥,其中糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,本病發(fā)生后,患者有異常尿蛋白排泄,同時隨著病程的進展,可累及腎小管、腎小球以及腎間質(zhì),進而可以引起患者腎功能逐漸減退,腎功能的減退可造成患者排泄發(fā)生障礙,這給患者的生活和經(jīng)濟、心理等帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[6]。目前臨床對本病的治療沒有特效藥,治療手段仍然以血糖控制和飲食控制為主,因此開發(fā)一種新型的藥物治療本病或者延緩本病的進展具有十分重要的意義。

    關(guān)于2型糖尿病腎病發(fā)病機制的研究目前有許多的學(xué)說[7-9],其中研究較多的有基因氧化應(yīng)激學(xué)說、遺傳學(xué)說、缺氧學(xué)說、炎癥學(xué)說、代謝障礙學(xué)說、血流動力學(xué)改變學(xué)說等,其中缺氧學(xué)說已經(jīng)得到研究證實,由于引起缺氧的原因眾多,因此阻斷由于缺氧造成的損害已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點[9]。腎臟缺氧危害之一是造成HIF-1α表達(dá)的異常增高,而HIF-1α又是體內(nèi)重要的缺氧誘導(dǎo)因子,其幾乎參與了哺乳動物所有的器官中的缺氧應(yīng)答[10-11]。當(dāng)腎臟組織發(fā)生缺血/缺氧表現(xiàn)時,會大量分泌HIF-1α,加強細(xì)胞糖酵解反應(yīng),以彌補缺氧引起的細(xì)胞供能不足[12];此外HIF-1α分泌的增加,也會促進腎臟組織中新生血管生成,以加強紅細(xì)胞攜氧的能力,從而改善細(xì)胞的物質(zhì)代謝,而這其中刺激VEGF分泌和合成起著關(guān)鍵的作用,HIF-1α可刺激VEGF的分泌,進而誘導(dǎo)新生血管形成,而分泌的VEGF又可以增加血管的通透性,進而改變腎小球濾過膜的通透性,最終導(dǎo)致患者發(fā)生蛋白尿[13-14]。

    苦瓜其本身屬于葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜Momordica charantia L.的未成熟果實的一種,但對于其藥用機理人們了解甚少??喙嫌兄凭玫娜胨幨?,近年來許多學(xué)者對苦瓜進行了研究,研究均提示苦瓜具有明顯的抗氧化、提高免疫力、降血糖、降低膽固醇,甚至可以抗艾滋病病毒的作用[15-16]。本研究用苦瓜總皂苷治療2型糖尿病腎病大鼠,結(jié)果顯示:正常組大鼠腎組織切片層次分明,無炎癥反應(yīng),模型組有明顯的炎癥反應(yīng),治療4周后腎組織病理形態(tài)學(xué)明顯改善,治療8周后進一步改善,但仍然有一定的炎癥反應(yīng),這提示苦瓜總皂苷雖然不能治療2型糖尿病腎病,但可以延緩其發(fā)病進展;苦瓜總皂苷不僅有降低血糖的作用,同時也可以明顯地改善2型糖尿病大鼠24小時尿量、尿蛋白以及血清肌酐,抑制大鼠腎臟HIF-1α和VEGF蛋白和mRNA的表達(dá),具有很好的藥用價值。

    綜上所述,苦瓜總皂苷可通過抑制HIF-1α及ET-1的表達(dá),改善糖尿病大鼠腎臟損害,延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

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    (本文編輯:董歷華)

    Effects of Momordica total saponins to HIF-1α and VEGF expression in kidney tissue of type 2diabetic nephropathy rats

    C HEN Wei,TIAN Lu,LI Yi,et al. Department of Nephrology,Huangshi Central Hospital of Hubei Province,Huangshi 435000,China

    GAO Shan,E-mail:hsyiyuantougao@163.com

    Objective To investigate the efficacy in type 2 diabetic nephropathy rats after treated with Mcomordica total saponins.Methods Male SD rats were randomly divided into control group,diabetic nephropathy model group and Momordica total saponins treatment group.After treatment for 4 and 8 weeks,HIF-1α and VEGF expressions were detected respectively.Results Compared with the model group,there were significantly decreased in urine protein and serum creatinine,and increased in blood glucose in the treatment group(P<0.05).The pathological tissue after HE staining showed that Momordica total saponins could relieve incrassation of glomerular basement membrane,and mesangial cell proliferation.RT-PCR and Wester Blot results showed that HIF-1α and VEGF level in the treatment group were significantly lower than that in the model group(P<0.05).Conclusion Momordica total saponins could inhibit the expression of HIF-1 and VEGF,improve renal function,mitigate renal damage in diabetic rats,and delay the development of diabetic nephropathy.

    Momordica total saponins; Hypoxia inducible factor-1; Vascular endothelial growth factor; Type 2 diabetes mellitus; Renal function

    R692.39

    A

    10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.004

    湖北省自然科學(xué)基金(2012FFA016)

    435000 湖北省黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科(陳偉、田魯、李易、王港);黃石市第二醫(yī)院腎內(nèi)科(高珊)

    陳偉(1981-),碩士,主治醫(yī)師。研究方向:慢性腎臟病。E-mail:506727553@qq.com

    高珊(1979-),女,本科,講師,主治醫(yī)師。研究方向:腎病和腎臟透析等綜合治療。E-mail:hsyiyuantougao@163.com

    2015-10-15)

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