通心絡(luò)對心肌梗死模型大鼠心肌損傷保護作用及機制的研究

王思穎　李紹旦　劉　毅　馮　宇　張俊修　霍　旺　高　路　楊明會

通心絡(luò)對心肌梗死模型大鼠心肌損傷保護作用及機制的研究

王思穎李紹旦劉毅馮宇張俊修霍旺高路楊明會

目的 探索通心絡(luò)對心肌梗死模型大鼠心肌損傷的保護作用及機制。方法 采用結(jié)扎前降支方法制作30只心肌梗死大鼠模型，隨機分為模型組、通心絡(luò)組、培哚普利組，每組10只；假手術(shù)組9只僅穿線不結(jié)扎。藥物組大鼠分別以通心絡(luò)、培哚普利灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等量羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。2周后測量TUNEL凋亡指數(shù)，以及血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）水平。結(jié)果 藥物組大鼠的一般情況均有所改善。通心絡(luò)組、培哚普利組的凋亡指數(shù)和MDA、ET-1水平較模型組均明顯降低，SOD、NO水平較模型組均明顯升高（P<0.05）。結(jié)論 通心絡(luò)可抑制心肌細胞凋亡，并通過升高SOD、NO水平，降低MDA、ET-1水平，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)和內(nèi)皮功能，保護心肌組織。

通心絡(luò)； 心肌梗死； 模型大鼠； 凋亡； 氧化應(yīng)激； 內(nèi)皮功能

心肌梗死是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上，冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使心肌發(fā)生嚴重而持久的缺血導(dǎo)致心肌壞死的一系列病理改變［1］，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率等特點，是嚴重威脅人類健康的難治性疾病，屬于中醫(yī)學“胸痹”“心痛”范疇。

通心絡(luò)是一種中藥復(fù)方制劑，以中醫(yī)絡(luò)病學理論為基礎(chǔ)，具有益氣通絡(luò)止痛、活血化瘀的功效，研究證明其對急性心肌梗死具有較好的療效。本研究從模型大鼠心肌的凋亡程度、氧化應(yīng)激狀態(tài)、內(nèi)皮功能方面探討通心絡(luò)對心肌損傷的保護作用及機制。

1　材料與方法

1.1動物

SPF級雄性SD大鼠60只（購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心），體質(zhì)量（240±20）g，每籠5只飼養(yǎng)于獨立通氣籠具系統(tǒng)內(nèi)。溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，每天明暗交替12小時。實驗期間造模、取材等操作均在超凈工作臺內(nèi)進行，添加飼料、換水、灌藥等由專人負責管理。

1.2藥物及試劑

通心絡(luò)超微粉（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號：20121215）；培哚普利片［施維雅（天津）制藥有限公司，批號：20120218］；烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，批號：T2011110）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：F3047216）；鹽酸利多卡因注射液（北京益民藥業(yè)有限公司，批號：20140609）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（Roche公司，貨號：11684817910）、總超氧化物歧化酶測試盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A001-1）、丙二醛測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A003-1）、一氧化氮測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A012）、內(nèi)皮素-1測試盒（南京建成生物工程研究所，貨號：H093），均購于北京百傲厚德生物科技有限公司。

1.3儀器

電子秤（長沙湘平科技發(fā)展有限公司，EPS-2001）；小動物心電圖機（北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司，F(xiàn)X-211）；動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V9）；高速離心機（Perkin Elmer VICTOR X5）；超凈工作臺（北京長城空氣凈化工程公司）。

1.4動物造模及分組

選取心電圖正常大鼠60只，隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組9只和造模組51只，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，造模組采用結(jié)扎前降支方法制作急性心肌梗死模型。模型參照文獻［2］，以20%烏拉坦按5 mL/kg腹腔注射麻醉后，使用面罩罩于鼻部連接呼吸機，仔細檢查防止漏氣，設(shè)定呼吸頻率80次/分、潮氣量15 mL/kg、呼吸比1∶1。剃毛及碘伏消毒，于大鼠左側(cè)胸壁3～4肋間橫向開胸，鈍性分離肌肉，暴露心臟，撕開心包膜，在冠狀動脈左側(cè)主干處，左心耳下方約2～3 mm處以左心耳與肺動脈圓錐間左冠狀靜脈主干為標志結(jié)扎（假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎），進針深度約1.5 mm，寬約2.0 mm，結(jié)扎后在心臟表面滴加1滴鹽酸利多卡因注射液防止心律失常。心臟搏動穩(wěn)定后立即逐層關(guān)閉胸腔，待大鼠自主呼吸恢復(fù)后，移除呼吸機。以室壁運動減弱，結(jié)扎下部心肌組織顏色變白或紫紺，心電圖可見胸前各個導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高、T波高聳為造模成功標志，造模后每只大鼠一次性肌肉注射青霉素鈉40萬單位預(yù)防感染。

1.5給藥及取材

將造模成功后存活的30只模型大鼠隨機分為模型組、通心絡(luò)組、培哚普利組，每組各10只，假手術(shù)組9只。通心絡(luò)組、培哚普利組分別以通心絡(luò)超微粉0.6 g/（kg·d）、培哚普利2 mg/（kg·d）劑量灌胃，藥物以等量羧甲基纖維素鈉溶液溶解，模型組和假手術(shù)組以等量羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。術(shù)后第二天開始，每天上午10：00灌胃，每5天重新測量體質(zhì)量計算灌胃量。連續(xù)給藥2周后，麻醉大鼠，腹主動脈取血5 mL；將導(dǎo)管沿主動脈根部逆行插入左心室，縫合線打結(jié)固定導(dǎo)管，剪開右心耳，先以生理鹽水150 mL灌注心臟，再以4%多聚甲醛300 mL灌注，直至右心耳切口流出液無色時完成灌注，置入4%多聚甲醛固定。

1.6觀察指標及檢測方法

將心臟用石蠟包埋，切成6 μm厚的切片。根據(jù)說明書使用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢驗凋亡陽性細胞分布情況，切片置于200倍熒光顯微鏡下，隨機選取3個視野，凋亡指數(shù)=凋亡細胞計數(shù)/（凋亡細胞計數(shù)+正常細胞計數(shù)）×100%，取平均值。使用總超氧化物歧化酶測試盒、丙二醛測定試劑盒、一氧化氮測定試劑盒、內(nèi)皮素-1測試盒，分別測量血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）水平。

1.7統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有結(jié)果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。各組樣本之間的均數(shù)比較采用方差分析，數(shù)據(jù)方差齊時釆用LSD法、Dunnett法進行兩兩比較；方差不齊時，進行Welch近似方差分析，采用Tamhane's T2法進行兩兩比較。若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則進行非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般情況

實驗前各組動物狀態(tài)良好，皮毛光澤，反應(yīng)靈敏，動作自如，目光有神，眼口鼻無分泌物。假手術(shù)組實驗前后無明顯變化，體質(zhì)量穩(wěn)定上升；其余組出現(xiàn)不同程度的皮毛干枯不光澤，眼口鼻不同程度紅色分泌物，倦怠，以模型組最為明顯，藥物治療組相對較輕。各組體質(zhì)量變化無顯著差異。

2.2凋亡指數(shù)

各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差不齊，Welch分析P<0.01，組間存在顯著差異。Tamhane兩兩比較：模型組較假手術(shù)組明顯升高（P<0.05）；通心絡(luò)組、培哚普利組較模型組明顯降低（P<0.05），藥物組與假手術(shù)組、藥物組之間均無顯著差異。

2.3氧化應(yīng)激狀態(tài)

2.3.1SOD 各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，ANOVA方差分析P<0.01，組間存在顯著差異。LSD兩兩比較：模型組較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01）；通心絡(luò)組、培哚普利組較模型組明顯升高（P<0.01），藥物組與假手術(shù)組、藥物組之間均無顯著差異。

2.3.2MDA 各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，ANOVA方差分析P<0.01，組間存在顯著差異。LSD兩兩比較：模型組較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）；通心絡(luò)組、培哚普利組較模型組明顯降低（P<0.05），藥物組與假手術(shù)組、藥物組之間均無顯著差異。

圖1　各組凋亡程度（TUNEL熒光染色，×200）

2.4血管內(nèi)皮功能

2.4.1NO 各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，ANOVA方差分析P<0.01，組間存在顯著差異。LSD兩兩比較：模型組較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01）；通心絡(luò)組、培哚普利組較模型組明顯升高（P<0.01），藥物組與假手術(shù)組、藥物組之間均無顯著差異。

2.4.2ET-1 各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差不齊，取對數(shù)后方差齊，ANOVA方差分析P<0.05，組間存在顯著差異。LSD兩兩比較：模型組較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）；通心絡(luò)組、培哚普利組、較模型組明顯降低（P<0.05），較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01），藥物組之間無顯著差異。

表1　各組TUNEL凋亡指數(shù)、SOD、MDA、NO、ET-1（x±s）

3　討論

隨著人類社會的發(fā)展和人口老齡化的加重，心肌梗死已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的急危重癥，中國心肌梗死的發(fā)病率和死亡率逐年上升［3］。心肌梗死是在冠脈不穩(wěn)定斑塊破裂、糜爛的基礎(chǔ)上形成血栓，導(dǎo)致冠狀動脈血管持續(xù)的完全的閉塞，引起心肌缺血缺氧、壞死、炎癥等一系列病理改變，可導(dǎo)致室壁瘤、心臟破裂、猝死等嚴重并發(fā)癥。

心肌梗死的缺血缺氧狀態(tài)可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，存活心肌數(shù)量逐漸減少而出現(xiàn)左心室擴張、收縮功能減退以及左室重構(gòu)［4］，加快心功能惡化進程，導(dǎo)致心力衰竭［5］。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能異常以及心力衰竭的重要因素，SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除超氧陰離子自由基，心肌缺血時，SOD的活性降低導(dǎo)致自由基堆積，氧自由基生成增加，又可導(dǎo)致SOD的消耗增加［6］；MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代表產(chǎn)物之一，能夠間接反映細胞氧化損傷的程度。NO作為內(nèi)皮細胞分泌的血管舒張因子，在神經(jīng)信息傳遞、舒張血管、抑制血小板聚集、免疫應(yīng)激等多方面發(fā)揮重要作用；ET-1主要源于血管內(nèi)皮，具有很強的血管收縮功能，維持血管基礎(chǔ)張力，在心腦血管疾病中發(fā)揮重要作用［7］，并可引起血小板聚集、促進血管平滑肌細胞增生［8］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，某些中藥復(fù)方可通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點影響疾病的進程，改善心肌梗死嚴重程度和預(yù)后。通心絡(luò)是一種復(fù)方制劑，由水蛭、全蝎、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、人參、赤芍、檀香、降香、制乳香、炒酸棗仁、冰片組成，具有益氣通絡(luò)止痛、活血化瘀的功效。研究證明，通心絡(luò)可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能［9］，減少缺血再灌注損傷［10］，改善心肌缺血，抑制左室重構(gòu)，緩解癥狀，改善左心功能［11］，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的防治。

本研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)可抑制心肌細胞凋亡，并通過升高SOD、NO水平，降低MDA、ET-1水平，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)和內(nèi)皮功能，保護心肌組織。

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（本文編輯：董歷華）

Protective effect and mechanism of Tongxinluo on myocardial injury in myocardial infarction modelrats

WANG Si-ying，LI Shao-dan，LIU Yi，et al. Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China

YANG Ming-hui，E-mail：ymh9651@sina.com

Objective To study the protective effect and mechanism of Tongxinluo on myocardial injury in myocardial infarction model rats.Methods The rat model of acute myocardial infarction was established by ligaturing the left anterior descending coronary artery.30 model rats were randomly divided into the model group，Tongxinluo group，Perindopril group，10 rats in each group.And 9 rats in sham group were punctured only without ligation.The rats in each medication group were intragastric administration respectively by Tongxinluo suspension and Perindopril suspension with corresponding dosage.And the model group and the sham group were intragastric administration by sodium carboxymethyl cellulose solution with corresponding dosage.All the rats were given continuously for 2 weeks.The apoptotic index and the level of SOD，MDA，NO and ET-1 were measured by corresponding methods. Results The general condition of rats in medication groups was better than model group.The level of SOD and NO in Tongxinluo group and Perindopril group was increased more significantly than that of the model group（P<0.01）.The level of MDA and ET-1 in Tongxinluo group and Perindopril group was decreased more significantly than model group（P<0.05）.Conclusions Tongxinluo can inhibit myocardial apoptosis，and protect the cardiac muscle tissue by increasing the level of SOD and NO，decreasing thelevel of MDA and ET-1，and it also can improve the oxidative stress and perform protective effect on myocardial tissue endothelial function.

Tongxinluo； Myocadial infarction； Model rat； Apoptosis； Oxidative stress；Endothelial function

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.002

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2012CB518601）

100700 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院［王思穎（博士研究生）］；中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科［王思穎、李紹旦、劉毅、馮宇、張俊修、霍旺、高路、楊明會］

王思穎（1986-），女，2013級在讀博士研究生。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療老年病。E-mail：lucky18603@163.com

楊明會（1962-），博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床。E-mail：ymh9651@sina.com

2016-02-28）