海藻酸鈉凝膠黏膜下注射黏膜隆起效果的實(shí)驗(yàn)研究*

溫春虹，閔培，邱曉莉，李佩，劉妍，劉將，唐慶林，蘇軍凱，張鳴青［中國人民解放軍第一七五醫(yī)院 消化內(nèi)科（南京軍區(qū)消化內(nèi)鏡診療中心），福建 漳州 363000］

論 著

海藻酸鈉凝膠黏膜下注射黏膜隆起效果的實(shí)驗(yàn)研究*

溫春虹，閔培，邱曉莉，李佩，劉妍，劉將，唐慶林，蘇軍凱，張鳴青
［中國人民解放軍第一七五醫(yī)院 消化內(nèi)科（南京軍區(qū)消化內(nèi)鏡診療中心），福建 漳州 363000］

目的 以生理鹽水（NS）為對(duì)照，評(píng)估不同濃度的海藻酸鈉（SA）溶液作為黏膜下注射液，用于內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（ESD）的可行性及優(yōu)越性。方法 ①在新鮮離體豬食管及豬胃的黏膜下，注入不同濃度的SA溶液及NS溶液，觀察并測量各注射液所致黏膜隆起高度，及此高度隨時(shí)間的變化情況；②在活體小豬的胃黏膜下注射SA溶液后，模擬進(jìn)行ESD手術(shù)，觀察SA溶液對(duì)ESD術(shù)的輔助作用。結(jié)果 離體豬食管、胃實(shí)驗(yàn)中，注射相同體積SA溶液的實(shí)驗(yàn)組所致黏膜隆起高度明顯高于注射NS的對(duì)照組。其中，食管黏膜下注射1% SA溶液與注射NS相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；胃黏膜下注射3% SA溶液維持黏膜隆起高度與注射NS相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001）。活體小豬胃模擬ESD術(shù)的實(shí)驗(yàn)中，注射SA溶液可以明顯地分離組織、隆起黏膜，且形成穩(wěn)定的凝膠墊，促進(jìn)術(shù)中快速剝離黏膜的同時(shí)保護(hù)下層組織。結(jié)論 黏膜下注射SA溶液可以持久地維持黏膜隆起高度，有利于黏膜組織的剝離切除，且由于其黏性，可較好地在黏膜下形成保護(hù)屏障，并對(duì)創(chuàng)面起到一定的壓迫止血作用，可減少ESD術(shù)中穿孔、出血等并發(fā)癥的出現(xiàn)。因此，SA是可用于臨床的較為理想的黏膜下注射液。

內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)；黏膜下注射液；海藻酸鈉

海藻酸鈉（sodium alginate，SA）是從海帶、巨藻等褐藻中提取的一種天然高分子多糖類化合物，因具有良好的增稠性、成膜性、穩(wěn)定性和生物相容性，且無毒性，而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)［1］。它是由β-D甘露糖醛酸（M單元）和α-L古洛糖醛酸（G單元）按照（1→4）糖苷鍵以不同順序、單元共價(jià)連接的線型聚合物。不同比例的n（M）/n（G）的SA，其黏度、凝膠化性能等有較大的差異。

內(nèi)鏡 黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosal dissection，ESD）可整塊切除黏膜及黏膜下病變，提供完整的病理標(biāo)本，是消化道早期癌和腫瘤的首選治療方法。ESD切除病變范圍較大，操作時(shí)間較長，出血和穿孔是術(shù)中常見并發(fā)癥［2-3］。通過合適的黏膜下注射液，使黏膜充分隆起并形成黏膜下液墊，保護(hù)肌層組織，可減少ESD術(shù)中并發(fā)癥的發(fā)生。本研究以生理鹽水（normal saline，NS）為對(duì)照，初步探討SA溶液是否能在ESD術(shù)中維持黏膜隆起，減少出血、穿孔等并發(fā)癥，成為有效的ESD術(shù)黏膜下注射液。

1　材料及方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料新鮮離體豬食管與豬胃各6個(gè)，購自超市，待用時(shí)于4℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)間距離豬屠宰時(shí)間不超過12 h。實(shí)驗(yàn)豬一只（由中國人民解放軍第一七五醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重15 kg，術(shù)前禁食12 h以上。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用藥SA粉劑（湖北葛店人福藥用輔料有限責(zé)任公司），用無菌注射用水配制成濃度分別為1%、2%和3%的SA溶液100 ml，存于4℃冰箱備用。

1.2器械

實(shí)驗(yàn)臺(tái)、動(dòng)物手術(shù)器械包，注射器，計(jì)時(shí)器，大頭針，絲線，照相機(jī)，直尺，白色泡沫板，以上器械均由第一七五醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。胃鏡采用

Olympus GIF-H260Z電子胃鏡，Olympus公司23G、25G（Gauge，后文亦簡稱G）注射針，Olympus KD-611L IT刀。

1.3方法

1.3.1離體組織黏膜下注射溶液實(shí)驗(yàn)用大頭針將豬食管、豬胃固定在方形泡沫板上（圖1），黏膜下注射1%、2%和3%的SA溶液及NS溶液4組液體各1 ml，豬食管、胃黏膜下立即形成隆起，用直尺聯(lián)合絲線測量各組隆起的高度（0 min），并用數(shù)碼相機(jī)垂直于食管、胃所在平面拍照，準(zhǔn)確記錄各組黏膜隆起的高度；5、15、30和60 min后分別再在同一位置測量隆起高度，同時(shí)用數(shù)碼相機(jī)拍照進(jìn)行記錄。獨(dú)立重復(fù)豬食管、豬胃黏膜下注射實(shí)驗(yàn)各6次。

圖1　離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

1.3.2活體小豬模擬ESD實(shí)驗(yàn)術(shù)前禁食12 h以上，用“速眠新”以0.2 ml/kg劑量肌肉注射，待小豬麻醉穩(wěn)定后，左側(cè)臥位固定。經(jīng)口插入法與普通胃鏡類似，模擬進(jìn)行ESD術(shù)。由于動(dòng)物口腔的特異性，采用特定的牙墊，既固定小豬嘴巴防止咬壞胃鏡而又保證胃鏡視野清晰。配制好不同濃度的SA溶液及NS溶液，用內(nèi)鏡注射針分別從胃鏡鉗道注入胃竇黏膜下。觀察注射SA溶液后胃黏膜隆起的高度及持續(xù)時(shí)間。隨后用IT刀進(jìn)行ESD術(shù)，觀察黏膜下注射SA溶液是否發(fā)生出血、穿孔等并發(fā)癥情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

黏膜隆起高度變化采用GraphPad Prism 6軟件的Two-way ANOVA Multiple comparisons進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1離體實(shí)驗(yàn)黏膜隆起高度變化

2.1.1食管在新鮮離體豬食管黏膜下注射不同濃度的SA及NS溶液后，黏膜隆起的形態(tài)及隆起高度隨著時(shí)間推移的變化情況如圖2和3所示。注射1 ml 1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液后黏膜的初始（0 min）隆起高度分別為（5.63±0.56）、（4.97±0.64）、（4.84±0.53）和（4.03±0.70）mm；60 min后，1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液所致黏膜隆起高度分別變化為（4.51±0.75）、（4.00±0.66）、（4.41±0.46）和（2.93±0.91）mm。如圖3所示，注射SA溶液后黏膜隆起明顯高于注射NS，且此隆起高度變化緩慢、穩(wěn)定，即與注射NS相比，注射SA溶液所維持的黏膜隆起更為持久。其中，1%SA溶液與NS相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。

圖2　不同注射液所致豬食管黏膜隆起形態(tài)隨時(shí)間推移的變化

圖3　不同注射液所致豬食管黏膜隆起高度隨時(shí)間推移的變化

2.1.2胃在新鮮豬胃黏膜下，注射不同濃度的SA 及NS溶液后，黏膜隆起的形態(tài)及隆起高度隨著時(shí)間推移的變化情況如圖4和5。注射1 ml 1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液后黏膜的初始（0 min）隆起高度分別為（4.64±0.94）、（4.38±0.32）、（4.86±0.49）和（4.28±0.32）mm；60 min后，1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液所致黏膜隆起高度分別變化為（4.10±0.63）、（3.92±0.31）、（4.51±0.58）和（2.83±0.42）mm。如圖5所示，注射SA溶液組所致胃黏膜隆起明顯高于注射NS組，且黏膜隆起高度變化趨勢(shì)平穩(wěn)。相比較而言，注射NS組所致黏膜隆起高度隨時(shí)間推移明顯降低，而SA溶液組直至60 mins尚保持在較高的水平。其中，3% SA溶液與NS相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001）。

2.2活體小豬模擬ESD術(shù)

SA注射液呈較稀的凝膠狀，其黏度隨濃度增大而增高。操作中發(fā)現(xiàn)，1%、2%和3%的SA溶液均可通過23G、25G內(nèi)鏡注射針在活體豬胃黏膜下注射，但需較大的力氣。經(jīng)我科3名內(nèi)鏡室護(hù)士反復(fù)評(píng)估，應(yīng)用23G針注射1%SA溶液或25G針注射0.6%SA溶液為較易進(jìn)行的配合操作。

圖4　不同注射液所致豬胃黏膜隆起形態(tài)隨時(shí)間推移的變化

圖5　不同注射液所致豬胃黏膜隆起高度及其隨時(shí)間推移的變化

內(nèi)鏡注射針從胃鏡鉗道內(nèi)將各組溶液注入胃竇黏膜下，可以看到不同高度的黏膜隆起。由圖6A可見，注射SA溶液所致黏膜隆起邊界清晰，有效地分離了黏膜與黏膜下層組織，且其可持久維持黏膜隆起，為使用IT刀穩(wěn)定、準(zhǔn)確操作ESD手術(shù)提供便利。模擬ESD術(shù)剝離后，可見完整的SA覆蓋住黏膜下層（圖6B），取出SA可見光滑的黏膜下層（圖6C）。由此可見，注射SA溶液所形成的隆起，因其黏性形成較穩(wěn)定的黏膜下液墊，可降低ESD術(shù)中穿孔的發(fā)生率。同時(shí)，凝膠狀的SA溶液對(duì)切除創(chuàng)面具有一定的壓迫作用，也可降低術(shù)中出血的發(fā)生率（圖6B和C示ESD切除邊緣創(chuàng)面較為整齊、無出血）。

圖6　活體小豬的ESD手術(shù)

3　討論

ESD術(shù)因其“微創(chuàng)”且療效可靠而廣泛應(yīng)用于黏膜腫瘤組織的切除，尤其是較大病灶的切除。應(yīng)用有效的黏膜下注射液可減少ESD術(shù)中穿孔、出血等并發(fā)癥的發(fā)生。

普遍認(rèn)為，理想的黏膜下注射液具有以下特點(diǎn)：①能使病變部位充分隆起；②黏膜下隆起持續(xù)時(shí)間長；③價(jià)格合理；④對(duì)周圍組織無損傷；⑤易獲取、儲(chǔ)存及注射等。近年來，葡萄糖溶液、甘油果糖溶液、殼聚糖水凝膠［4］、自體血［5］、羥丙甲纖維素［6］和透明質(zhì)酸鈉溶液等［7］作為黏膜下注射液的可行性及安全性方面的研究報(bào)道及黏膜下注射液的Meta分析報(bào)道［8］時(shí)有更新。但這些注射劑大多存在價(jià)格昂貴、不易儲(chǔ)存、注射困難或副作用明顯等缺點(diǎn)。如溫敏凝膠PLGAPEG-PLGA，常溫下呈液態(tài)，人體體溫時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虪钅z，是作為黏膜下注射液的優(yōu)良選擇，研究報(bào)道也顯示它具有良好的黏膜隆起效果及很好的生物相容性［9］。但是，其制備方法較為復(fù)雜，直接購買原料價(jià)格又較高（SIGMA：5 087.16元/g），目前并未廣泛用于臨床。

目前，國內(nèi)臨床上常用的黏膜下注射液主要是NS溶液，但因它是等滲溶液，注射后液體向周圍組織擴(kuò)散快，易被吸收，黏膜隆起持續(xù)時(shí)間較短，需要多次注射維持隆起［10］，造成操作時(shí)間延長、穿孔等并發(fā)癥發(fā)生率較高。尋找其他輔助ESD效果佳、易推廣使用的黏膜下注射液，可進(jìn)一步促進(jìn)ESD在消化道疾病微創(chuàng)治療中的應(yīng)用。

AKAGI等［11］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中分析了SA作為黏膜下注射液的有效性，后進(jìn)行11例黏膜下注射SA的臨床試驗(yàn)，成功切除早期胃癌病灶，且無并發(fā)癥發(fā)生，隨訪結(jié)果顯示無再復(fù)發(fā)。KUSANO等［12］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SA溶液對(duì)組織無損害，0.6%的SA溶液在臨床使用中具有很好的黏膜隆起效果。

目前，國內(nèi)尚未有SA作為黏膜下注射液的相關(guān)報(bào)道，本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)，探討廉價(jià)易得、制備方便的SA溶液作為ESD黏膜下注射液的可行性及有效性，為推廣其臨床使用提供數(shù)據(jù)支撐。在本研究中，通過與注射NS對(duì)比，注射SA溶液所致黏膜隆起呈現(xiàn)更高更持久的趨勢(shì)。注射SA組隆起組織的界限清晰，這可加快ESD整塊切除的術(shù)程。SA的凝膠狀形態(tài)產(chǎn)生局部壓迫作用，可減少術(shù)中出血的發(fā)生率。另因其凝膠特性形成的黏膜下液墊對(duì)下層組織有很好的保護(hù)作用，可減少穿孔的發(fā)生率。本研究不足之處在于：①離體實(shí)驗(yàn)中，在豬食管注射3% SA溶液后有細(xì)微滲出，導(dǎo)致黏膜隆起高度有所影響；同樣，在豬胃離體實(shí)驗(yàn)中，注射2% SA溶液也有細(xì)微滲出，因而黏膜隆起高度也有所打折；②活體實(shí)驗(yàn)中，黏膜下注射SA溶液輔助進(jìn)行ESD術(shù)，術(shù)程順利，但未記錄黏膜持續(xù)隆起的時(shí)間，并未與NS組比較分析；對(duì)上文提到的隆起邊界清晰的優(yōu)勢(shì)，降低穿孔和出血率等優(yōu)勢(shì)，沒有記錄明確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)加以說明。

離體實(shí)驗(yàn)中的滲出可能與實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)，也可能由于隨著濃度的增加，SA凝膠溶液的張力增強(qiáng)，從而易從注射針眼中溢出。因此，下一步實(shí)驗(yàn)將選取合適的SA濃度，在活體小豬中，分析它的黏膜隆起效果，對(duì)ESD操作時(shí)間的影響，并評(píng)估可它的止血性能、組織相容性及在黏膜下存留時(shí)間等。

致謝：本研究得到四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室錢志勇教授的指導(dǎo)，以及惠贈(zèng)PEG-PCL-PEG納米溫敏凝膠用于本課題黏膜下注射液試劑篩選。

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（吳靜 編輯）

Experimental study on the elevation effect of sodium alginate as a submucosal injection solution*

Chun-hong Wen， Pei Min， Xiao-li Qiu， Pei Li， Yan Liu， Jiang Liu，Qing-lin Tang， Jun-kai Su， Ming-qing Zhang
（Department of Gastroenterology， The 175th Hospital of PLA， Digestive Endoscopy Center of Nanjing Military Command， Zhangzhou， Fujian 363000， China）

Objective To evaluate the feasibilities and advantages of different concentrations of sodium alginate （SA） solutions as a submucosal injection solution for endoscopic submucosal dissection （ESD）. Methods In vitro study， different concentrations of sodium alginate solutions and normal saline were injected into submucosal of resected porcine esophagus and stomach respectively， then observe and measure the heights of each injection induced mucosal elevations， and their changes over time. In vivo study， the mimic ESD were conducted in healthy pigs to evaluate the mucosal elevation effect and other assistant effects of sodium alginate as a submucosal injection solution. Results The elevation heights of the experiment groups injected with SA solutions were much higher than the control group injected with normal saline. Specially， the elevation created by 1 % SA in porcine esophagus was signifi cantly higher than that of normal saline （P ＜ 0.01） and the elevation created by 3 % SA was signifi cantly higher than that of normal saline in porcine stomach （P ＜ 0.001）. In the mimic ESD experiment， mucosal elevation with clear marginoccurred immediately after injection with SA solution. And the durable submucosal fluid cushion created by SA protected deeper tissues while facilitating ESD procedure. Conclusion The elevation heights created by SA solutions were greater and more durable than that created by normal saline， which were crucial for ESD. The viscosity property enabled SA to form a stable protective cushion and prevent bleeding by squeezing tissue around the wound， which may decrease perforation and bleeding rate during ESD procedure. Therefore， sodium alginate can be an ideal clinical submucosal injection solution.

endoscopic submucosal dissection； submucosal injection solution； sodium alginate

R-332

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2016.08.004

1007-1989（2016）08-0014-06

2016-04-01

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（No：15ZD026）；南京軍區(qū)創(chuàng)新資助項(xiàng)目（No：12MA066）；第一七五醫(yī)院科技計(jì)劃項(xiàng)目-青年苗圃（No：15Y005）

張鳴青，E-mail：zmqing8084@sina.com