三株益生菌對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的影響

陳澤慧，白潔霞，簡　平，王躍麟，倪學(xué)勤，，曾東，*（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 6504；.四川省動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 6504）

三株益生菌對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的影響

陳澤慧1，白潔霞1，簡平1，王躍麟1，倪學(xué)勤1，2，曾東1，2*
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 625014；
2.四川省動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014）

通過體外產(chǎn)氣法研究三株益生菌（植物乳酸桿菌、枯草芽孢菌、啤酒酵母）對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的影響。試驗(yàn)設(shè)乳酸桿菌組、酵母菌組、芽孢桿菌組和對(duì)照組，分別在4h、6h、9h、12h、18h、24h、36h、48h測定產(chǎn)氣量，發(fā)酵48h后檢測乳酸桿菌、芽孢菌和酵母菌數(shù)量。結(jié)果表明：植物乳酸桿菌、啤酒酵母能明顯促進(jìn)瘤胃體外發(fā)酵，植物乳酸桿菌發(fā)揮作用較快，而啤酒酵母較慢但增殖能力更強(qiáng)。

益生菌；體外；瘤胃發(fā)酵；產(chǎn)氣

體外產(chǎn)氣法能模擬瘤胃發(fā)酵過程［1］，并預(yù)測瘤胃對(duì)飼料、飼草的消化率［2］。根據(jù)體外發(fā)酵后的總產(chǎn)氣量和氨產(chǎn)生量可以估測蛋白質(zhì)降解率［3］，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，主要有乳酸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌、放線菌、酵母菌等。益生菌可提高瘤胃發(fā)酵效率，目前已成為研究的熱點(diǎn)［4-5］。本試驗(yàn)選取三株常見益生菌（植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母），旨在研究它們對(duì)瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響，快速評(píng)估其發(fā)酵效率。

1　試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌種三株益生菌：植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)研究中心保存和提供。

1.2 主要試劑

1.2.1 培養(yǎng)基MRS、NA、PDA。

1.2.2 瘤胃緩沖液配方A液：微量元素溶液，13.2g CaC12·2H2O、10.0 g MnC12·4H2O、1.0 g CoC12·6H2O、8.0g FeC12·6H2O定容到100mL；B液：緩沖溶液，4.0g NH4HCO3、35.0g NaHCO3定容到1000mL；C液：常量元素溶液，5.7 g NaH2PO4、6.2 g無水KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O定容到1000mL；D液：0.1%刃天青溶液；E液：336.0mg Na2S·9H2O、2mL 1moL·L-1NaOH。取0.12mL A液、237mL B液、237 mL C液、1.22mL D液混合，通入CO2至飽和，保存在39℃恒溫培養(yǎng)箱中，使用時(shí)先加入49.5mL E液，并繼續(xù)通入CO2致溶液由藍(lán)色變?yōu)闊o色，待用。

1.2.3 瘤胃液試驗(yàn)當(dāng)天抽取瘤胃液，4層紗布過濾至預(yù)熱處理后的收集瓶中，39℃水浴保溫，靜置半小時(shí)。

1.2.4 發(fā)酵底物玉米面精料和苜蓿粉粗料，按照7∶3比例混合。

1.3 主要儀器空氣浴恒溫振蕩器；自動(dòng)高壓滅菌鍋；電子天平；智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱；恒溫水浴鍋；光學(xué)顯微鏡；微量移液器；100mL注射器。

2　方法

2.1 菌株活化與菌液制備將植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母37℃水浴預(yù)熱5min，分別在MRS、PDA、NA平板上劃線，并于37℃厭氧或有氧培養(yǎng)24h。參照《微生物檢測技術(shù)》手冊，挑取單菌落革蘭氏染色，鏡檢，再次劃線，進(jìn)行菌種純化培養(yǎng)；然后接種于MRS、PDA、NA肉湯，37℃厭氧或有氧培養(yǎng)24h，采用平板計(jì)數(shù)法測定細(xì)菌數(shù)量，并調(diào)整數(shù)量級(jí)為106，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 體外發(fā)酵以及產(chǎn)氣量測定采用Menke［6］的方法制備瘤胃緩沖液，按照1.0g發(fā)酵底物、10mL瘤胃緩沖液與20mL瘤胃液的比例混合均勻，加入100mL注射器中，并分別加入2.1步驟中制備的植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌液和生理鹽水各500μL，即為乳酸桿菌組、芽孢桿菌組、酵母菌組和對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)6個(gè)重復(fù)。此過程中始終向注射器充入CO2，以火焰法檢查，保持厭氧環(huán)境，并維持環(huán)境溫度在37℃。于50r/min 37℃恒溫下振蕩，并在發(fā)酵4 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h后分別記錄產(chǎn)氣量。

2.3 活菌計(jì)數(shù)采用平板稀釋法計(jì)數(shù)，將發(fā)酵48h后的樣品經(jīng)10倍梯度稀釋，各梯度分別取10μL稀釋菌液滴種在MRS、PDA、NA平板上，于37℃下厭氧或有氧培養(yǎng)24h。鏡檢，確定目標(biāo)菌落，計(jì)算相應(yīng)細(xì)菌的含菌量。

2.4 數(shù)據(jù)處理用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，多重比較不同益生菌在各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量差異，用Graphpad prism6分析各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣變化趨勢。

3　結(jié)果與分析

3.1 不同益生菌對(duì)瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響三株益生菌發(fā)酵48h，產(chǎn)氣變化趨勢如圖1所示?？傮w上看，產(chǎn)氣量在前6h增加緩慢，隨后產(chǎn)氣變化明顯；6～24h期間，產(chǎn)氣量迅速增加；24～48h期間，產(chǎn)氣量逐漸趨于平緩，增加緩慢。各組產(chǎn)氣總量的變化情況如圖2所示。相比對(duì)照組，乳酸桿菌組產(chǎn)氣總量增加了26.9%，酵母菌組增加了10.2%，芽孢桿菌組減少了0.5%。

對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量進(jìn)行方差分析（表1），結(jié)果表明：乳酸桿菌組相對(duì)其他3組在各時(shí)間點(diǎn)上的產(chǎn)氣量增加極顯著（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，酵母菌組在18～24h期間產(chǎn)氣變化不顯著（P＞0.05），其他時(shí)間點(diǎn)上產(chǎn)氣均增加顯著（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，芽孢桿菌組在9～12h期間產(chǎn)氣增加顯著（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)上產(chǎn)氣變化不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)組中，酵母菌組和芽孢桿菌組在發(fā)酵初期組間差異不顯著（P＞0.05），在18h后酵母菌組的產(chǎn)氣量極顯著高于芽孢桿菌組（P＜0.01）。

圖1 不同益生菌組的產(chǎn)氣變化趨勢

圖2 不同益生菌組的產(chǎn)氣總量變化情況

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的差異分析

3.2 不同益生菌在瘤胃體外發(fā)酵中的數(shù)量差異利用平板計(jì)數(shù)法檢測加入發(fā)酵體系的益生菌數(shù)量變化情況（表2），結(jié)果顯示：乳酸桿菌與芽孢桿菌組相比對(duì)照組而言，數(shù)量變化不明顯，而酵母菌組與對(duì)照組相比，數(shù)量顯著增加了10倍以上，說明啤酒酵母在發(fā)酵液體系中存活較好，而植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌的生長情況明顯比啤酒酵母差。

表2　益生菌數(shù)量對(duì)比分析

4　分析

本研究以植物乳酸桿菌、枯草芽孢菌、啤酒酵母三株益生菌為研究對(duì)象，比較其對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的影響。48h后添加植物乳酸桿菌的產(chǎn)氣量最高，啤酒酵母次之，枯草芽孢菌最低，表明植物乳酸桿菌可促進(jìn)體外發(fā)酵，效果優(yōu)于啤酒酵母、枯草芽孢菌。Dutta等［7］比較分析了幾株酵母與乳酸菌的發(fā)酵效率，發(fā)現(xiàn)酵母的發(fā)酵效率強(qiáng)于乳酸，這與本試驗(yàn)的結(jié)論相悖，分析原因可能是菌株不同，其作用效果存在差異所致。此外，有研究表明從瘤胃內(nèi)部分離的假丁酸弧菌對(duì)體外發(fā)酵有促進(jìn)作用［8］，并且這種內(nèi)源性益生菌的安全性較為可靠。對(duì)比分析3組發(fā)酵速率，發(fā)現(xiàn)添加植物乳酸菌可促使發(fā)酵迅速趨于平臺(tái)期，而啤酒酵母與枯草芽孢桿菌的發(fā)酵速率較為緩慢（在乳酸桿菌組達(dá)到平臺(tái)期后還處于上升期）。除了檢測產(chǎn)氣量以評(píng)估三株益生菌的發(fā)酵效率外，本試驗(yàn)還采用相應(yīng)的培養(yǎng)基檢測了益生菌數(shù)量，對(duì)比分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)啤酒酵母相對(duì)其他兩組菌，能較好地在瘤胃液中存活，表明其在瘤胃液中的增殖能力強(qiáng)于其他兩株菌。

5　結(jié)論

植物乳酸桿菌、啤酒酵母能促進(jìn)瘤胃體外發(fā)酵，植物乳酸桿菌發(fā)揮作用較快，而啤酒酵母發(fā)揮作用較慢但其增殖能力更強(qiáng)；添加植物乳酸桿菌、啤酒酵母均可提高瘤胃體外發(fā)酵效率?！?/p>

［1］Si1eshi Z，Owen E，Dhanoa M S，et a1.Prediction ofinsiturumendrymatterdisappearanceof Ethiopian forages from an in vitro gas production techniqueusingapressuretransducer，chemica1 ana1ysis or in vitro digestibi1ity［J］.Anima1 Feed Science and Techno1ogy，1996，61（1）：73-87.

［2］Orskov E R.Comparison of in vitro gas production and ny1on bag degradabi1ity of roughages in predicting feed intake in catt1e［J］.Anima1 Feed Science and Techno1ogy，1993，40（2）：109-119.

［3］Raab L，Cafantaris B，Ji1g T，et a1.Rumen protein degradation and biosynthesis［J］.British Journa1 of Nutrition，1983，50（3）：569-582.

［4］Reina A，Tanaka A，Uehara A，et a1.Effects of protease-resistant antimicrobia1 substances produced by lactic acid bacteria on rumen methanogenesis［J］. Asian Austra1asian Journa1 of Anima1 Sciences，2010，23（6）：700-707.

［5］As1im B，Yuksekdag Z N，Sarikaya E，et a1.Determination of the bacteriocin-1ike substances produced by some lacticacid bacteria iso1ated from Turkish dairy products［J］.LWT-Food Science and Techno1ogy，2005，38（6）：691-694.

［6］Menke K H，Raab L，Sa1ewski A，et a1.The estimation of the digestibi1ity and metabo1izab1e energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen 1iquor in vitro［J］.The Journa1 of Agricu1tura1 Science，1979，93（1）：217-222.

［7］Dutta T K，Kundu S S.In vitro rumen fermentation and gas production as affected by probiotics addition［J］. IndianJourna1ofAnima1Sciences，2005，75（7）：817-822.

［8］Fraga M，Pere1muter K，Va1encia M J，et a1.Eva1-uation of native potentia1 probiotic bacteria using an in vitro rumina1 fermentation system［J］.Anna1s of Microbio1ogy，2014，64（3）：1149-1156.

The Effect of Three Probiotics on Rumen Gas Production in Vitro

CHEN Zehui1，NI Xueqin1，2，ZENG Dong1，2*，et a1. （1.Research Center of Anima1 Micro-eco1ogica1，Co11ege of Veterinary Medicine，Sichuan Agricu1ture University，
Sichuan Ya'an 625014；
2.Key Laboratory of Anima1 Disease and Human Hea1th of Sichuan Province，Sichuan Ya'an 625014，China）

This paper studied the effect of three probiotics（lactobacillus，bacillus subtilis，beer yeast）on the rumen fermentation in vitro by gas production.Four groups were set up：Lactobacillus group，yeast group，bacillus group and contro1 group，the gas production was measured at 4h，6h，9h，12h，18h，24h，36 h，48 h.After 48 h，the numbers of lactobacillus，bacillus subtilis，beer yeast were detected.The resu1t showed that lactobacillus and beer yeast cou1d promote rumen fermentation in vitro，lactobacillus's function was quicker，and beer yeast was s1ower but its pro1iferation abi1ity was stronger.

Probiotics；In vitro；Rumen fermentation；Gas production

S816.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

1001-8964（2016）08-0021-03

2016-05-16

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（121062610）。

陳澤慧（1992-），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，現(xiàn)從事動(dòng)物微生態(tài)研究。

曾東（1961-），男，四川丹棱人，教授，博士生導(dǎo)師，現(xiàn)從事動(dòng)物微生態(tài)研究。