中藥混合液對麻黃素致孕鼠肝損傷及抗氧化功能的影響

俞詩源,彭　靜,劉婷婷,安晶晶

(1．西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州　730070； 2．西北師范大學(xué)學(xué)報編輯部，甘肅蘭州　730070)

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中藥混合液對麻黃素致孕鼠肝損傷及抗氧化功能的影響

俞詩源1,2,彭靜1,劉婷婷1,安晶晶1

(1．西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070； 2．西北師范大學(xué)學(xué)報編輯部，甘肅蘭州730070)

為探討中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織的保護作用，將72例受孕小鼠隨機分為對照組、麻黃素組和中藥組，麻黃素組和中藥組連續(xù)腹腔注射0.043 g·kg-1劑量的麻黃素溶液，中藥組在注射麻黃素溶液1 h后灌胃0.2 mL中藥混合液，記錄孕鼠行為的變化，比色法測定肝組織T-AOC、GST活性及MDA含量，生物顯微技術(shù)觀察孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)的變化.結(jié)果顯示麻黃素組孕鼠飲食、飲水量減少，跳動次數(shù)增多，肝組織T-AOC、GST活性顯著降低，MDA含量明顯升高，肝組織出現(xiàn)不同程度的損傷，肝血竇擴張，內(nèi)皮細胞脫落，肝小葉界限紊亂，肝細胞空泡化；中藥組孕鼠飲食、飲水量增多，跳動次數(shù)減少，肝組織T-AOC、GST活性顯著升高，MDA含量顯著降低，肝組織結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，肝小葉界限清晰，內(nèi)皮細胞脫落減少，肝細胞結(jié)構(gòu)基本正常.表明麻黃素抑制細胞的抗氧化酶活性，對肝組織結(jié)構(gòu)有明顯的損傷作用，而中藥混合液可顯著提高組織細胞的抗氧化能力，改善細胞活力，對麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織有一定的保護作用.

中藥混合液；麻黃素；孕鼠；肝；組織結(jié)構(gòu)；抗氧化酶

麻黃素可治療習(xí)慣性支氣管哮喘、蕁麻疹、鼻粘膜充血、感冒及肥胖等疾病，但作為制造冰毒的前體，還能激活或增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性，產(chǎn)生吸食后的欣快感，長期或大量使用，可產(chǎn)生藥物依賴，損傷機體的臟器組織[1-4].由于精神壓力、迷信、健美等問題，女性濫用麻黃素的人數(shù)越來越多.如果妊娠期女性濫用麻黃素，會嚴重影響妊娠期女性的健康，進而影響胎兒的發(fā)育與健康[2]，但有關(guān)麻黃素致妊娠機體損傷的研究和中藥對麻黃素致?lián)p傷保護作用的研發(fā)較少.有研究表明中藥在治療藥物依賴或抗興奮劑方面具有重要作用[5]，中藥鉤藤有降壓、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用[6]，人參皂苷可平衡大腦皮質(zhì)的興奮和抑制過程[7]，白術(shù)多糖能增強機體免疫力，有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等作用[8]，甘草有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗癌等作用[9]，當歸多糖對麻黃素致?lián)p傷小鼠有一定的保護作用[10].本實驗在給孕鼠注射麻黃素的同時，灌胃鉤藤、生曬參、白術(shù)、甘草和當歸中藥混合液，通過記錄孕鼠的行為變化，檢測肝組織抗氧化能力的變化，觀察肝組織結(jié)構(gòu)的變化，探討中藥混合液對麻黃素致孕鼠肝組織損傷的保護作用.

1　材料和方法

1.1試劑與制備

鹽酸麻黃素(甘肅省公安廳提供)，用蒸餾水配制成麻黃素水溶液.總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所).中藥鉤藤(Uncaria rhynchophylla)(四川產(chǎn))、生曬參(Panax ginseng)(吉林產(chǎn))、白術(shù)(Atractylodes macrocephala)(浙江產(chǎn))、當歸(Angelica sinensis)和甘草(Glycyrrhiza uralensis)(甘肅產(chǎn))生藥各100 g(蘭州安寧醫(yī)藥公司)，按文獻[11]方法各置砂鍋內(nèi)加5倍量蒸餾水浸泡2 h，文火煎煮40 min，濾出藥液備用，藥渣再加水煎煮30 min，合并兩次藥液、濃縮制成1 g·mL-1的生藥水煎液，在4～6 ℃條件下保存?zhèn)溆?，使用時按照2.5∶2.5∶2∶2∶1合并5種中藥水煎液.

1.2實驗動物與給藥

選取體重25～30 g的昆明小鼠108只(蘭州大學(xué)實驗動物中心)，按2∶1雌雄比合籠交配，次日早晨檢查雌鼠陰道，出現(xiàn)陰栓者為妊娠第1 d，再將72例孕鼠(從受孕第3 d開始)隨機分為對照組、麻黃素組和麻黃素+中藥組(簡稱中藥組).按文獻[11]方法麻黃素組和中藥組分別連續(xù)腹腔注射0.043 g·kg-1劑量的麻黃素溶液，每天2次(9:00，16:00)，對照組注射等量的生理鹽水，中藥組在注射麻黃素溶液1 h 后灌胃中藥混合液0.2 mL，用等量的生理鹽水給對照組和麻黃素組灌胃.

1.3孕鼠行為觀察

從注射麻黃素開始，每天同一時間觀察記錄孕鼠飲食、飲水量和跳動次數(shù)，每次1 h.

1.4孕鼠體重和肝重測量

分別于給藥10,15,20 d時，稱量各孕鼠體重，經(jīng)眼眶靜脈取血至加入肝素的離心管中凍存?zhèn)溆?-20 ℃)，打開體腔取其肝組織，濾紙吸干并用電子天平(BL320H，島津)精確稱重后，切取部分肝組織凍存?zhèn)溆?-20 ℃)，其余肝組織入15%的甲醛溶液固定.

1.5孕鼠肝組織酶活性測定

取上述凍存的各組孕鼠肝組織，精確稱重后，加肝組織重量9倍的生理鹽水，冰浴勻漿.經(jīng)4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液按試劑盒操作要求，用全自動分光光度計(UV-VIS spectrophotometer，U-1800型，Tokyo Japan)分別在520,412和532 nm測定T-AOC、GST活性和MDA含量.

1.6孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)觀察

取上述固定的各組孕鼠肝組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(6 μm)，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡(Olympus，F(xiàn)X-35WA，Japan)觀察并拍照，每個樣本取5張切片，每張切片隨機觀察5個視野，Image-proplus 6.0圖像分析軟件測量肝血竇寬度.

1.7數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計，結(jié)果以平均值±標準差表示.

2　結(jié)果

2.1孕鼠行為的變化

中藥混合液影響麻黃素致?lián)p傷孕鼠的行為(表1).麻黃素組孕鼠的飲食量、飲水量低于對照組(P<0.05)，跳動次數(shù)高于對照組(P<0.05).中藥組孕鼠飲食量、飲水量高于麻黃素組，15,20 d差異顯著(P<0.05)，跳動次數(shù)低于麻黃素組，10,20 d差異顯著(P<0.05).

表1　中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠行為的影響

*P<0.05 Compared with control group；#P<0.05 Compared with ephedrine group．

2.2孕鼠體重、肝重的變化

中藥混合液影響麻黃素致?lián)p傷孕鼠的體重和肝重(表2).麻黃素組孕鼠體重和肝重均低于對照組，15，20 d時差異顯著(P<0.05)，中藥組孕鼠體重和肝重均高于麻黃素組，20 d時差異顯著.

表2　中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠體重和肝重的影響

*P<0.05 Compared with control group；#P<0.05 Compared with ephedrine group.

2.3孕鼠肝組織抗氧化功能的變化

2.3.1孕鼠肝組織T-AOC活性的變化中藥混合液影響麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織的T-AOC活性(圖1).麻黃素組孕鼠肝組織T-AOC活性低于對照組(P<0.05).灌胃中藥混合液后孕鼠肝組織T-AOC活性均升高，20 d時與麻黃素組差異顯著(P<0.05).

圖1　中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織T-AOC活性的影響

*P<0.05 Compared with control group；#P<0.05 Compared with ephedrine group．

2.3.2孕鼠肝組織GST活性的變化中藥混合液影響麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織的GST活性(圖2).麻黃素組孕鼠肝組織GST活性低于對照組，15,20 d時差異極顯著(P<0.01)；中藥組孕鼠肝組織GST活性均升高，15,20 d時差異顯著(P<0.05).

圖2　中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織GST活性的影響

**P<0.01 Compared with control group；#P<0.05 Compared with ephedrine group．

2.3.3孕鼠肝組織MDA含量的變化中藥混合液影響麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織的MDA含量(圖3).麻黃素組孕鼠肝組織MDA含量均高于對照組(P<0.05).中藥組孕鼠肝組織MDA含量均低于麻黃素組，15,20 d時差異顯著(P<0.05).

圖3　中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織MDA含量的影響

*P<0.05 Compared with control group；#P<0.05 Compared with ephedrine group．

2.4孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)的變化

中藥混合液影響麻黃素致?lián)p傷孕鼠的肝組織結(jié)構(gòu)(圖版I).對照組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細胞形態(tài)清晰可見(圖版I：A，B，C)；麻黃素組孕鼠肝血竇明顯增大，肝組織內(nèi)皮細胞脫落，肝細胞核固縮，肝細胞空泡化、變性、壞死(圖版I：D，E，F(xiàn))；中藥組孕鼠肝組織損傷明顯減輕，肝血竇明顯減小，肝細胞核固縮和肝細胞空泡化現(xiàn)象減少，肝細胞排列基本整齊(圖版I：G，H，I).

圖版Ⅰ　中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

A：Liver tissue structure of pregnant mice of control group at day 10，shows liver lobule structure normal，Bar=20 μm(The same below)．B：Liver tissue structure of pregnant mice of control group at day 15．C：Liver tissue structure of pregnant mice of control group at day 20．D：Liver tissue structure of pregnant mice of ephedrine group at day 10，shows hepatic sinusoid expansion(↑).E：Liver tissue structure of pregnant mice of ephedrine group at day 15，shows hepatic sinusoid expansion(↑)，endotheliocyte off and liver nuclear condensation.F：Liver tissue structure of pregnant mice of ephedrine group at day 20，shows hepatic sinusoid expansion(↑)，degradation of liver cell，endotheliocyte off and liver nuclear condensation．G：Liver tissue structure of pregnant mice of Chinese medicine group at day 10，shows liver cell degeneration reduced．H：Liver tissue structure of pregnant mice of Chinese medicine group at day 15，shows hepatic sinusoid expansion reduced and hepatic lobules arrangement clearly．I：Liver tissue structure of pregnant mice of Chinese medicine group at day 20，shows hepatic lobules boundaries clearly．

麻黃素組孕鼠肝血竇寬度均大于對照組(P<0.05)；中藥組孕鼠肝血竇寬度均小于麻黃素組，15,20 d時差異顯著(P<0.05)(表3).

表3　中藥混合液對麻黃素致?lián)p傷孕鼠肝血竇寬度的影響

*P<0.05 Compared with control group；#P<0.05 Compared with ephedrine group．

3　討論

3.1中藥混合液對麻黃素孕鼠體重、肝重及行為的影響

有研究表明，麻黃素可增強下丘腦飽覺中樞的興奮性，并抑制攝食中樞的興奮性，引起動物食欲減退，進而減少機體對食物的攝入，麻黃素與咖啡因混合物能減輕人體體重，使體脂減少[12].本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，麻黃素組孕鼠飲食量、飲水量減少，興奮異常，運動增多，易受驚嚇，體重和肝重均降低，與興奮劑成癮小鼠的癥狀相似[10,13].可能是因為孕鼠注射麻黃素后極度興奮，飲食飲水量減少，活動量增加，導(dǎo)致肝糖原分解加速，造成孕鼠體重和肝重的下降.與麻黃素組相比，中藥組孕鼠能正常飲食飲水，且運動次數(shù)減少，又出現(xiàn)肝重和體重的升高，表明中藥混合液具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗氧化和清除自由基等功效，可平衡中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和抑制過程，使機體新陳代謝趨于正常、能量消耗減少.

3.2中藥混合液對麻黃素孕鼠肝組織抗氧化酶活性的影響

在正常機體中，自由基的含量維持在有利無害、低水平、穩(wěn)定平衡的狀態(tài).T-AOC能有效的阻斷自由基引起的連鎖反應(yīng)，起到抗氧化的作用[14]，GST可清除體內(nèi)自由基，具谷胱甘肽過氧化物酶活力，能防止脂質(zhì)過氧化損傷，MDA作為肝組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量的改變反映細胞受損的情況[15].麻黃素經(jīng)腹腔注入體內(nèi)后，通過血液循環(huán)到達肝組織，可能通過細胞色素P450類酶系代謝產(chǎn)生過量的自由基，導(dǎo)致機體氧化抗氧化體系失衡[10]，同時氧自由基生成增多可反應(yīng)性下調(diào)GST等酶活性[16]，引起細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加，使組織T-AOC、GST活性大幅度降低，使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生超過了機體的代償能力，機體抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞，肝組織結(jié)構(gòu)和功能受到損傷.中藥組孕鼠肝組織T-AOC、GST活性均高于麻黃素組，MDA含量低于麻黃素組，表明中藥混合液可改善麻黃素所致的肝組織損傷，可提高肝組織清除自由基的能力，可增加細胞活性，提高組織細胞的抗氧化能力，減少細胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對麻黃素引起的肝組織損傷有一定的修復(fù)和保護作用.

3.3中藥混合液對麻黃素孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

妊娠期小鼠自身與胎兒新陳代謝產(chǎn)生的毒素在肝組織內(nèi)進行轉(zhuǎn)化或貯留[17].麻黃素在小鼠體內(nèi)主要以原形迅速分布到肝組織[18]，本實驗麻黃素組孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)有不同程度的損傷，注射麻黃素時間越長損傷越嚴重.這可能是麻黃素誘導(dǎo)機體產(chǎn)生過多的自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，使細胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常，導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生[2].鉤藤、人參、白術(shù)、甘草和當歸均具有保肝護肝、促使肝細胞再生及提高肝功能的作用[6-10].孕鼠灌胃中藥混合液后，肝組織損傷明顯減輕，肝細胞的損傷與凋亡明顯減少，表明中藥混合液能改善妊娠期小鼠肝組織的血液循環(huán)，促進肝細胞代謝和毒素的清除，對肝細胞有明顯的保護作用.

綜上所述，中藥混合液具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗氧化等功能，可改善麻黃素孕鼠的行為活動，可增加孕鼠肝細胞的活力，改善細胞代謝功能，對麻黃素引起的孕鼠肝組織損傷有一定的修復(fù)和保護作用.

[1]ZHOU Y，BUNNEY B S，SHI W X．Differential effect of cocaine on firing rate and pattren of dopamine neurons role of alphal receptor sand comparison with L-Dopa and apomorphine[J].J Pharmacol Exp Ther，2006，317(1):196．

[2]孫雋，李重陽，俞詩源，等．麻黃素對仔鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)和相關(guān)活性物質(zhì)的影響[J].解剖學(xué)報，2012，43(3):398．

[3]俞詩源，陳?。兴帍?fù)方液對麻黃素成癮小鼠大腦額葉結(jié)構(gòu)的影響[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2013，49(2):84．

[4]俞詩源，劉小媛．中藥復(fù)方液對麻黃素損傷小鼠卵巢的保護作用[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2014，50(3):79．

[5]郭潔，黃偉．中醫(yī)藥戒毒研究的歷史及近況[J].河南中醫(yī)，2008，28(2):85．

[6]王煜，王景霞，歐麗娜，等．鉤藤對嗎啡誘導(dǎo)的大鼠條件性位置偏愛效應(yīng)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(14):218．

[7]郭秀麗，高淑蓮．人參化學(xué)成分和藥理研究進展[J].中醫(yī)臨床研究，2012，4(14):26．

[8]楊娥，鐘艷梅，馮毅凡，等．白術(shù)化學(xué)成分和藥理作用的研究進展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2012，28(2):218．

[9]高雪巖，王文全，魏勝利，等．甘草及其活性成分的藥理活性研究進展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2009，34(21):2695．

[10]孟茹，李重陽，俞詩源，等．當歸(粗)多糖對麻黃素肝組織損傷的保護作用[J].解剖學(xué)報，2015，46(3): 379．

[11]王小勇．中藥小復(fù)方對麻黃素仔鼠大腦顳葉皮層組織結(jié)構(gòu)和相關(guān)酶活性及Bax，c-fos，TGF-β1蛋白表達的影響[D].蘭州：西北師范大學(xué)，2013．

[12]CSAJKA C，HALLER C A，BENOWITZ N L，et al．Mechanistic pharmacokinetic modelling of ephedrine，norephedrine and caffeine in healthy subjects[J].British Journal of Clinical Pharmacology，2005，59(3): 335．

[13]張潔，潘三強，呂來清，等．苯丙胺對大鼠行為、學(xué)習(xí)能力及海馬CA3區(qū)突觸素表達的影響[J].解剖學(xué)研究，2008，30(2):93．

[14]左文濤，俞詩源，王昱，等．X線對仔鼠胃組織結(jié)構(gòu)及總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性的影響[J].解剖學(xué)報，2011，42(4):521．

[15]LI G，LI L，YIN D．A novel observation:melatonin’s interaction with malondiadehyde [J].Neuro Endocrinol Lett,2005，26(1):61．

[16]雷紅偉，楊偉峰.葛花對酒精性肝損傷保護作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(2):489．

[17]李東，孫殿興．妊娠期非傳染性肝臟損害的研究進展[J].實用肝臟病雜志，2007，10(2):136．

[18]魏鳳環(huán)，羅佳波，陳育堯．麻黃中麻黃堿在小鼠組織中的分布研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(5):769．

(責(zé)任編輯陸泉芳)

Effects of Chinese medicine mixture on liver damage and antioxidant function of pregnant mice by injected ephedrine

YU Shi-yuan1,2,PENG Jing1,LIU Ting-ting1,AN Jin-jin1

(1.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu,China; 2．Editoral Department of the University Journal,Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu,China)

To explore the effects of Chinese medicine mixture on ephedrine-induced liver damage in the pregnant mice，the 72 pregnant mice are randomly divided into control group，ephedrine group and Chinese medicine group．Ephedrine group and Chinese medicine group are injected with 0.043 g·kg-1doses of ephedrine．Chinese medicine group is intragastric with 0.2 mL Chinese medicine mixture after injected ephedrine 1 h．The changes of the behaviour of pregnant mice are recorded.The changes of the activity of T-AOC，GST are detected as well as the content of MDA by colorimetry，and the changes of liver tissue structure are observed by microscopy．Result shows that the eating and drinking reduce，jumping number increases，the activity of T-AOC and GST decrease significantly，the content of MDA increases in the liver in ephedrine group，and the tissue structure has different degrees damaged，for example,hepatic sinusoid expansion，endotheliocyte off，hepatic lobules boundaries disorder and liver cell vacuoles．In Chinese medicine group，the eating and drinking increase，jumping number decreases，the activity of T-AOC and GST are higher，and the content of MDA is lower．The damage of the tissue structure reduces significantly．Liver lobule boundary is clear．Endotheliocyte off is reduced significantly，and liver cell structure is normal．Ephedrine can inhibit the activity of antioxidant enzymes of the cell and has obvious damage in the liver tissue structure．The Chinese medicine mixture can significantly improve the antioxidant activity of the cell and helps to protect ephedrine-induced liver damage of the pregnant mice.Key words:Chinese medicine mixture；ephedrine； pregnant mice；liver；tissue structure;antioxidant enzyme

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.02.019

2015-11-26;修改稿收到日期:2015-12-06

甘肅省自然科學(xué)基金資助項目(1107RJZA141);蘭州市社會發(fā)展項目(2013-3-72，2014-1-105)

俞詩源(1957—)，男，甘肅蘭州人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師.主要研究方向為發(fā)育生物學(xué).

E-mail:syyu006@nwnu.edu.cn

R 338.21

A

1001-988Ⅹ(2016)02-0095-06