土壤線蟲的室內擴培方法研究及條件優(yōu)化

李　陽，賈美清，黃　靜，汪錢英，劉成寶，許　帥，張國剛（天津師范大學 a.生命科學學院，b.天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387）

土壤線蟲的室內擴培方法研究及條件優(yōu)化

李陽1，賈美清2，黃靜1，汪錢英1，劉成寶1，許帥1，張國剛1
（天津師范大學 a.生命科學學院，b.天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387）

摘要：為了尋求一種高效、快速的土壤線蟲培養(yǎng)方法，在人工氣候箱中分別以無菌水、土壤浸出液和生菜蛋黃（LE）為基質培養(yǎng)土壤線蟲，分析基質對土壤線蟲增殖的影響，并且對培養(yǎng)基濃度、培養(yǎng)基稀釋方式、線蟲初始接種密度、線蟲培養(yǎng)空間等4種培養(yǎng)條件進行優(yōu)化.研究結果表明：（1）在20d的培養(yǎng)周期內，土壤線蟲在生菜蛋黃培養(yǎng)基中增殖成功；（2）以無菌水稀釋、體積分數(shù)為25%的生菜蛋黃培養(yǎng)基中土壤線蟲的休眠時間最短、增殖速率最大；（3）土壤線蟲的初始接種密度為5條/mL時，培養(yǎng)效果最好；（4）培養(yǎng)空間對土壤線蟲的增殖沒有顯著影響.

關鍵詞：土壤線蟲；增殖；最佳方法；條件優(yōu)化

線蟲隸屬于無脊椎動物的線蟲動物門.土壤生態(tài)系統(tǒng)中，線蟲在有機質分解、養(yǎng)分礦化及能量傳遞等過程中起著重要作用［1-2］.土壤線蟲由于具有數(shù)量多、食性多樣、世代周期短、對污染物反應迅速等特點，越來越多地被用作土壤指示物，以此評價生態(tài)系統(tǒng)的土壤健康水平、生態(tài)系統(tǒng)演替或者受干擾程度等［3-4］.在以土壤線蟲作為指示生物的研究中，往往需要充足的線蟲樣本［5］，因此有必要建立一個操作便捷、富集高效的土壤線蟲培養(yǎng)體系.目前對線蟲培養(yǎng)的研究主要集中于病原線蟲［6］及模式線蟲——秀麗線蟲的培養(yǎng)［7］，有關土壤線蟲的培養(yǎng)研究鮮見報道［8］.李輝信等［9］研究土壤食細菌線蟲的富化培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌后接入線蟲，可使土壤食細菌線蟲成功富化.

在現(xiàn)有的土壤線蟲培養(yǎng)方式的基礎上，本課題組研究了土壤線蟲在生菜蛋黃、無菌水和土壤浸出液3種培養(yǎng)基中的增殖情況.在確定了最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎上，進一步對培養(yǎng)基的濃度、培養(yǎng)基稀釋方式、土壤線蟲初始接種密度及土壤線蟲的培養(yǎng)空間進行優(yōu)化，旨在為土壤線蟲培養(yǎng)體系的確立提供必要的實驗基礎.

1　材料與方法

1.1土壤采集與土壤線蟲的分離

在2015年4月份，從天津師范大學校園內的人工草坪中采集0～5 cm的表層土壤，帶回實驗室.

采用Baermann漏斗法分離土壤線蟲：將紗布包裹的土壤放入下端設置有乳膠管與止水夾的漏斗中，加入蒸餾水至水面淹沒土壤，上端設置60 W的白熾燈以加快線蟲分離速率，每小時打開止水夾收集土壤線蟲1次.于體式顯微鏡下挑取活性較強的土壤線蟲，用無菌水反復清洗5次至蟲體表面無雜質，清洗后迅速均分到不同的培養(yǎng)基內以減小無菌水對土壤線蟲的影響.

1.2不同培養(yǎng)基的制備方法

1.2.1土壤浸出液培養(yǎng)基的制備

取150 g新鮮土壤，加入500 mL的蒸餾水，煮沸10 min，過濾后收集濾液，冷卻至室溫后待用.

1.2.2生菜蛋黃（LE）培養(yǎng)基的制備

稱取30 g洗凈的生菜，剪碎后于研缽內研磨成勻漿，過濾并收集濾液.稱取熟蛋黃15 g，加入無菌水搗碎.將蛋黃液與生菜液混勻，用無菌水定容至1 L后加熱沸騰30 min，冷卻至室溫后pH調至7.0.最后將培養(yǎng)基于121℃下滅菌20 min，冷卻至室溫后待用.

1.3土壤線蟲的培養(yǎng)及計數(shù)方法

在不同處理方式的培養(yǎng)皿中隨機接入收集到的土壤線蟲，各處理均設置3次重復.在人工氣候箱中23℃下培養(yǎng)20 d，每天于同一時間在倒置顯微鏡下直接統(tǒng)計線蟲數(shù)量.本實驗主要調查土壤線蟲密度和土壤強活性線蟲密度2項指標.其中，土壤線蟲密度是指每毫升培養(yǎng)基中形態(tài)結構完整的土壤線蟲的數(shù)量；土壤強活性線蟲密度指的是每毫升培養(yǎng)基中蟲體移動波頻率≥20/min的土壤線蟲的數(shù)量［10］.

1.4土壤線蟲培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法

將LE培養(yǎng)基以無菌水稀釋至體積分數(shù)分別為100%、50%和25%進行實驗，選出最佳的LE培養(yǎng)基濃度.再分別以土壤浸出液和無菌水為溶劑，將LE培養(yǎng)基稀釋至最佳濃度，選出最佳稀釋溶劑.在此基礎上，分別設置初始接種密度為10只/mL和5只/mL，選出最佳的土壤線蟲初始接種密度.實驗觀察到土壤線蟲在培養(yǎng)基中主要集中于培養(yǎng)皿底部，為明確空間結構對土壤線蟲增殖的影響，選擇體積分數(shù)為25%的LE培養(yǎng)基，接種密度為5只/mL，在培養(yǎng)液體積不變的條件下，用內徑分別為2.2 cm和5.6 cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)土壤線蟲，考察培養(yǎng)空間對線蟲增殖的影響.

1.5統(tǒng)計分析

采用Excel和Sigmaplot 12.5進行數(shù)據(jù)處理與繪圖，使用SPSS 13.0進行t檢驗和方差分析，采用LSD進行多重比較檢驗，p≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2　結果與分析

2.1最優(yōu)土壤線蟲培養(yǎng)基的確定

本研究分別在無菌水、土壤浸出液和LE培養(yǎng)基中培養(yǎng)土壤線蟲，在20 d的培養(yǎng)期內每天對線蟲進行計數(shù)，結果如圖1所示.

圖1　不同培養(yǎng)基中土壤線蟲密度與土壤強活性線蟲密度Fig.1　Abundance of soil nematode and highly active soil nematode in different mediums

由圖1可以看出，土壤浸出液與無菌水培養(yǎng)基中的土壤線蟲增殖較少，在整個培養(yǎng)期內密度基本保持不變；LE培養(yǎng)基中的土壤線蟲在培養(yǎng)前期和中期密度沒有顯著變化，從第14天起密度開始增加，顯著高于另2種培養(yǎng)基中的線蟲密度，差異具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05），隨后保持上升趨勢，在培養(yǎng)20 d后達到最大值（184.58條/mL），為初始接種密度的36.92 倍.無菌水培養(yǎng)基中土壤線蟲的活性在整個培養(yǎng)期內波動性下降，培養(yǎng)17 d以后，強活性線蟲的密度穩(wěn)定在1條/mL以下；土壤浸出液培養(yǎng)基中土壤線蟲的活性同樣呈現(xiàn)下降趨勢，但在培養(yǎng)中、后期（14～20 d），仍有約1/2的土壤線蟲保持強活性，即強活性線蟲的密度約為2～3條/mL；LE培養(yǎng)基中土壤強活性線蟲密度在培養(yǎng)前3 d內下降，隨后逐漸恢復活性，培養(yǎng)前期和中期，LE培養(yǎng)基中土壤強活性線蟲的密度與另2種培養(yǎng)基中的密度接近，培養(yǎng)超過13 d后，LE培養(yǎng)基中的土壤強活性線蟲密度劇增，顯著高于另2種培養(yǎng)基中的密度，差異具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.

2.2不同培養(yǎng)基體積分數(shù)對土壤線蟲增殖的影響

根據(jù)2.1的結果，以LE為供試培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)基體積分數(shù)對土壤線蟲增殖的影響，結果如圖2所示.

圖2　不同體積分數(shù)LE培養(yǎng)基中土壤線蟲密度與土壤強活性線蟲密度Fig.2　Abundance of soil nematode and highly active soil nematode in different volume fractions of medium

由圖2可以看出，體積分數(shù)為100%、50%和25%的LE培養(yǎng)基中，土壤線蟲休眠的時間分別為13、11和7 d，即土壤線蟲休眠時間與培養(yǎng)基體積分數(shù)呈現(xiàn)一定的正相關.但線蟲開始增殖后，增殖速率與培養(yǎng)基體積分數(shù)相關性不明顯.在培養(yǎng)9～15d時，體積分數(shù)為25%的LE培養(yǎng)基中土壤線蟲密度顯著高于體積分數(shù)為50%和100%的LE培養(yǎng)基中的密度（p≤0.05）.培養(yǎng)16 d后，體積分數(shù)為20%和50%的LE培養(yǎng)基中線蟲密度相近，均顯著低于體積分數(shù)為100%的培養(yǎng)基中的線蟲密度（p≤0.05）.培養(yǎng)20 d后，體積分數(shù)為100%的培養(yǎng)基中土壤線蟲密度達到184.58條/mL，為初始密度的36.92倍；體積分數(shù)為25%和50%的培養(yǎng)基中線蟲密度分別為41.58條/mL和41.33條/mL，分別為初始密度的8.32和8.27倍.

3個體積分數(shù)的LE培養(yǎng)基中，土壤強活性線蟲密度的變化趨勢與線蟲總密度一致.在培養(yǎng)的第3天，體積分數(shù)為25%的培養(yǎng)基中36.6%的土壤線蟲保持較強活性，體積分數(shù)為100%和50%的培養(yǎng)基中沒有強活性線蟲.隨著土壤線蟲活性的恢復與增殖，從培養(yǎng)的第10天開始，體積分數(shù)為25%和50%的培養(yǎng)基中的線蟲活性急劇增強.到了培養(yǎng)的第16天，體積分數(shù)為100%的培養(yǎng)基中的線蟲恢復活性，密度顯著高于體積分數(shù)為20%和50%的培養(yǎng)基中的數(shù)值，差異具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.在增殖期間，體積分數(shù)為100%的培養(yǎng)基中強活性線蟲占總線蟲的比率為71.79%，體積分數(shù)為50%和20%的培養(yǎng)基中比率分別為77.50%和83.27%，即培養(yǎng)基濃度越低，強活性線蟲占全部線蟲的比率越大.

綜合考慮土壤線蟲的休眠時間、增殖速率、土壤線蟲活力、培養(yǎng)基使用量、最終檢測用線蟲密度等因素，認為體積分數(shù)為25%的LE培養(yǎng)基較為合理.

2.3培養(yǎng)基稀釋方式對土壤線蟲增殖的影響

根據(jù)2.2的結果，將LE培養(yǎng)基的體積分數(shù)設置為25%，研究分別以無菌水和土壤浸出液為溶劑的稀釋方式對土壤線蟲增殖的影響，結果如圖3所示.

圖3　不同稀釋方式中土壤線蟲密度與土壤強活性線蟲密度Fig.3　Abundance of soil nematode and highly active soil nematode with different medium dilution methods

由圖3（a）可以看出，以無菌水稀釋的LE培養(yǎng)基中，土壤線蟲在培養(yǎng)7 d后密度開始增加，10 d后密度急劇增加，到培養(yǎng)末期密度超過40條/mL，從培養(yǎng)的第11天開始，以無菌水稀釋的LE培養(yǎng)基中的土壤線蟲密度顯著高于以土壤浸出液稀釋的LE培養(yǎng)基中的密度，差異具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.以土壤浸出液稀釋的LE培養(yǎng)基中，培養(yǎng)11 d后土壤線蟲開始增殖，但速率緩慢，培養(yǎng)末期土壤線蟲的密度僅為15條/mL.由圖3（b）可以看出，在培養(yǎng)的前3 d，土壤浸出液與無菌水稀釋的LE培養(yǎng)基中，土壤強活性線蟲所占比率下降，而后土壤線蟲的活性開始恢復；培養(yǎng)5 d后，土壤浸出液稀釋的培養(yǎng)基中強活性線蟲數(shù)量開始顯著低于無菌水稀釋的培養(yǎng)基中的數(shù)值（p≤0.05）；培養(yǎng)結束時，無菌水稀釋的培養(yǎng)基中，強活性線蟲的密度約為37條/mL，而土壤浸出液稀釋處理的培養(yǎng)基中強活性線蟲的密度僅為10條/mL左右.由此認為，無菌水稀釋培養(yǎng)基的處理方式更加有利于土壤線蟲的培養(yǎng).

2.4不同初始接種密度對土壤線蟲增殖的影響

在無菌水稀釋的體積分數(shù)為25%的LE培養(yǎng)基中，設置土壤線蟲的初始接種密度分別為5條/mL和10條/mL，分析不同接種密度對土壤線蟲增殖的影響，結果如圖4所示.

圖4　 不同初始接種密度下土壤線蟲密度與土壤強活性線蟲密度Fig.4　Abundance of soil nematode and highly active soil nematode by different initial population density

由圖4（a）可以看出，土壤線蟲的初始接種密度為5條/mL時，線蟲在培養(yǎng)8 d后開始增殖，且在培養(yǎng)11 d后線蟲密度開始高于初始接種密度為10條/mL的數(shù)值，培養(yǎng)20 d后，土壤線蟲密度達到41.58條/ mL.土壤線蟲的初始接種密度為10條/mL時，線蟲在培養(yǎng)16 d后才開始增殖，且末期密度僅為20.33條/ mL，顯著低于接種密度為5條/mL的數(shù)值.圖4（b）的強活性線蟲密度結果顯示，在初始接種密度為10條/ mL的處理中，前期培養(yǎng)中土壤強活性線蟲的密度明顯下降，培養(yǎng)10 d后，活性才開始恢復；初始接種密度為5條/mL的處理中，線蟲在培養(yǎng)4 d后活性開始恢復，在整個培養(yǎng)期間，強活性線蟲的密度始終高于10條/mL的處理，差異具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.由此可見，初始接種密度為5條/mL的處理更有利于土壤線蟲的增殖.

2.5不同培養(yǎng)空間對土壤線蟲增殖的影響

在培養(yǎng)液體積相同的前提下，選用2種直徑的培養(yǎng)皿培養(yǎng)土壤線蟲，考察培養(yǎng)空間對土壤線蟲增殖的影響，結果如圖5所示.

圖5　空間結構對土壤線蟲密度與土壤強活性線蟲密度的影響Fig.5　Influence of spatial struture on abundance of soil nematode and highly active soil nematode

由圖5（a）可以看出，內徑5.6 cm的培養(yǎng)皿中土壤線蟲從培養(yǎng)的第9天開始增殖，在培養(yǎng)11～16 d期間，其線蟲密度大于小內徑培養(yǎng)皿中的線蟲密度，在培養(yǎng)后期，2種培養(yǎng)空間的線蟲密度相近.在圖5（b）中，培養(yǎng)的前期和中期，內徑5.6 cm的培養(yǎng)皿中的強活性線蟲密度也高于內徑2.2 cm培養(yǎng)皿中的密度，但在培養(yǎng)末期，二者相近.因此認為，培養(yǎng)空間對土壤線蟲增殖的影響不大.

3　討論與結論

線蟲具有“假死”特性，這是其在應對不利環(huán)境下的自我保護機制.本項研究中，不同處理方式下，土壤線蟲在接入培養(yǎng)基后的2～3 d內，線蟲的活性都迅速下降，呈現(xiàn)休眠狀態(tài).隨著培養(yǎng)時間的延長，土壤線蟲打破休眠狀態(tài)，活性恢復后仍然具備繁殖能力.為減少“假死”現(xiàn)象對實驗結果的影響，在分離線蟲過程中要盡量減少線蟲在濕漏斗中的停滯時間，并在培養(yǎng)期間，將總線蟲密度作為重要指標評價土壤線蟲的增殖情況，土壤線蟲蟲體的擺動頻率通常與其對環(huán)境的適應性和繁殖能力聯(lián)系密切［11］.

本研究分別采用無菌水、土壤浸出液和LE培養(yǎng)基作為基質培養(yǎng)土壤線蟲，結果發(fā)現(xiàn)，只有LE培養(yǎng)基可使土壤線蟲發(fā)生增殖.LE培養(yǎng)基含有大量的蛋白質與纖維素等營養(yǎng)物質，而其是否可為不同食性土壤線蟲的生長與繁殖提供充足的食物來源，以及在LE培養(yǎng)體系中，各食性土壤線蟲在取食過程中是否存在競爭關系還有待進一步探究.在無菌水中，土壤線蟲可以存活但不能增殖，且活性不斷下降，這是因為無菌水只提供了可供生存的水環(huán)境，營養(yǎng)物質及滲透壓等條件均不利于線蟲生存［11］；另一方面，本實驗中無菌水培養(yǎng)基的相關研究也可為土壤線蟲在極端低滲條件下的生存狀態(tài)及饑餓脅迫下土壤線蟲的行為響應等研究提供基礎.土壤浸出液的培養(yǎng)中，土壤線蟲雖無明顯增殖，但仍可保持較高活性，因此土壤浸出液可用于土壤線蟲的長期保存.土壤線蟲生存在植物或土壤顆粒表面形成的水膜中，低濃度的培養(yǎng)基與線蟲生存環(huán)境更為相似，在培養(yǎng)過程中線蟲具有較短的休眠時間；而線蟲在高濃度培養(yǎng)基中休眠時間較長.休眠狀態(tài)一旦被打破，高濃度培養(yǎng)基中優(yōu)越的營養(yǎng)條件優(yōu)勢逐漸展現(xiàn)，土壤線蟲短期內大量增殖.土壤浸出液稀釋的LE培養(yǎng)基中，二者的復合效應反而給土壤線蟲的生存與繁殖造成壓力.增加線蟲初始接種密度同樣不能為土壤線蟲的生存與增殖帶來正向影響，個體平均可利用營養(yǎng)量較低可能是造成這一現(xiàn)象的主要原因.不同生存空間對線蟲增殖的影響也不明顯.對于線蟲的培養(yǎng)，也有使用NGM培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基的報道［9，12］，這些培養(yǎng)基可為某些特定類型的線蟲提供準確的營養(yǎng)供給，但其營養(yǎng)成分與操作過程卻較為復雜.一個操作便捷、快速大量的擴繁方式更能滿足生態(tài)學研究的需求.

綜上所述，在20 d的培養(yǎng)周期內，體積分數(shù)25% 的LE培養(yǎng)基中土壤線蟲休眠時間最短，增殖速率快，以無菌水稀釋LE培養(yǎng)基及5條/mL的初始接種密度下培養(yǎng)效果更優(yōu)，而生存空間對土壤線蟲增殖的影響不明顯.

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（責任編校紀翠榮）

第一作者：李陽（1990—），男，碩士研究生．

文章編號：1671-1114（2016）01-0057-05

中圖分類號：Q142.3

文獻標志碼：A

收稿日期：2015-05-19

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31100330，31270502）；天津市科技支撐重點資助項目（15ZCZDSF00410）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃資助項目（12JCYBJC19700）；天津市“用三年時間引進千名以上高層次人才”資助項目（5KQM110006）；天津師范大學引進人才基金資助項目（5RL111）.

通信作者：張國剛（1976—），男，副教授，主要從事土壤生態(tài)學方面的研究．

Investigation and optimization on laboratory culture of soil nematode

LI Yang1，JIA Meiqing2，HUANG Jing1，WANG Qianying1，LIU Chengbao1，XU Shuai1，ZHANG Guogang1
（a.CollegeofLifeSciences；b.TianjinKeyLaboratoryofWaterResourcesandEnvironment，TianjinNormalUniversity，Tianjin300387，China）

Abstract：To find an efficient and quick laboratory culture method of soil nematode，the sterile water，the soil extract medium and the lettuce eggs medium were adopted seperately to cultivate soil nematode，and the influence of the three kinds of medium on soil nematode proliferation was analyzed.Furthermore，the culture conditions，including medium concentration，medium dilution method，initial population density of soil nematode and spatial structures，were optimized.The results showed that：（1）During the whole culture cycle of 20 d，the soil nematode cultivated in the lettuce eggs medium proliferated successfully；（2）The soil nematode growing in the lettuce eggs medium，which was diluted with sterile water and had the volume concentration of 25%，had the shortest latent period and the largest proliferating rate；（3）The best cultivating effect was obtained when the initial population density of soil nematode was 5 ind/mL；（4）There were no obvious effects of spatial structure on soil nematode proliferation.

Keywords：soil nematode；proliferation；best method；optimization