一個水稻富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶的RNAi及表達(dá)分析

宋　婷，熊　煒，李瑩瑩，曹振華，劉晨曦，劉薇茵，欒維江（天津師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

一個水稻富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶的RNAi及表達(dá)分析

宋婷，熊煒，李瑩瑩，曹振華，劉晨曦，劉薇茵，欒維江
（天津師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

摘要：為了揭示富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶（LRR-RLKs）家族成員OsLPR1在水稻生長發(fā)育與抗逆性中的功能，利用反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建了OsLPR1的RNAi載體，將其導(dǎo)入野生型水稻中獲得轉(zhuǎn)基因植株，觀察表型并且分析OsLPR1基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況.在表型觀察中發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)白化苗.進(jìn)一步的RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，白化苗中目的基因OsLPR1的表達(dá)量明顯偏低，野生型中的表達(dá)量則較高，這表明OsLPR1基因表達(dá)異常會導(dǎo)致水稻出現(xiàn)白化現(xiàn)象.另外，還分析了OsLPR1的組織特異性表達(dá)，結(jié)果表明，OsLPR1在不同的組織器官中均有表達(dá)，但在葉片及葉鞘中高表達(dá)，這說明該基因可能與水稻葉片的生長發(fā)育有關(guān).

關(guān)鍵詞：蛋白激酶；表達(dá)分析；RNAi分析；白化苗；OsLPR1

蛋白激酶是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用［1］.對水稻的全基因組測序結(jié)果表明，水稻基因組中至少有1 500個蛋白激酶［2］.類受體蛋白激酶（RLK）是蛋白激酶的一個亞家族，包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū).胞內(nèi)激酶區(qū)通過磷酸化或去磷酸化，開啟或關(guān)閉下游靶蛋白，將胞外信號轉(zhuǎn)化為胞質(zhì)信號［3-4］.富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶（LRR-RLKs）是已知的植物基因組中最大的一類跨膜類受體激酶，由胞外LRR結(jié)構(gòu)域、單次跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域3部分組成［5］，胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域相對保守，氨基酸同源性很高，通過序列比較分析，胞外受體蛋白序列都含有22～24個富含亮氨酸的重復(fù)序列［6-8］.這一類蛋白的胞外富亮氨酸的結(jié)構(gòu)域通過與多種特異信號分子結(jié)合，激活胞內(nèi)激酶區(qū)的磷酸化活性，從而將胞外信號傳遞到胞內(nèi)，調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆抗病等生理過程［9-10］.如在生長發(fā)育方面，擬南芥中的CLV1參與莖頂端分生組織的形成［11］、ERECTA控制器官的伸長與營養(yǎng)生長［12］；在抗病方面，擬南芥At1g09970的基因可能參與植物體的抗鹽過程.水稻中的Xa21是一個典型的編碼富含亮氨酸重復(fù)類受體激酶的基因，其胞外LRR區(qū)含有21個LRR基序［13］，已有研究證明Xa21具有自我磷酸化活性，而且只有蘇氨酸和絲氨酸可被磷酸化［14］，它在細(xì)胞表面識別病原物，二者結(jié)合后形成一個穩(wěn)定的二聚體，促使胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)部分相互靠攏，并激發(fā)胞內(nèi)激酶域發(fā)生磷酸化反應(yīng)［15］，在提高水稻白葉枯病抗性中起關(guān)鍵作用；另外還有抗白葉枯病的基因Xa26［16］、抗稻瘟病的基因Pi-d2［17］等.除了抗病方面的研究，LRR-RLKs類蛋白激酶在水稻中其他方面的功能尚不明確.

本研究以水稻LRR-RLKs類蛋白激酶家族成員OsLPR1為研究對象，利用反向遺傳學(xué)方法，構(gòu)建OsLPR1的RNAi載體，將其導(dǎo)入野生型水稻中獲得轉(zhuǎn)基因植株.通過觀察轉(zhuǎn)基因植株的表型和分析OsLPR1的表達(dá)量，揭示該基因在水稻生長發(fā)育與抗逆性中的作用.

1　材料與方法

1.1材料

野生型粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp.Japonica zhonghua11）及其轉(zhuǎn)基因植株.

1.2主要儀器與試劑

PCR儀，由美國Applied Biosystems 9902公司生產(chǎn)；凝膠成像分析儀，由美國BIO-RAD公司生產(chǎn)；瓊脂糖水平電泳儀，由美國BAYGENE公司生產(chǎn)；超速離心機(jī)和分光光度計，由美國Eppendorf公司生產(chǎn).

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker2000、DNA Marker15000等，由美國Takara公司生產(chǎn)；Trizol試劑，由美國Invitrogen公司生產(chǎn)；質(zhì)粒小量提取試劑盒，由美國OMEGA Bio-Tek公司生產(chǎn)；普通PCR試劑，由北京鼎國生物有限公司生產(chǎn)；DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，由北京康為世紀(jì)生物有限公司生產(chǎn).引物合成及DNA測序由金唯智生物科技有限公司完成.

1.3實驗方法

1.3.1RNAi載體的構(gòu)建

通過RT-PCR方法獲得RNAi載體的2段特異干涉片段：用Trizol試劑從生長30 d的水稻幼苗中提取總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.引物片段如下：

RNAi正向片段擴(kuò)增引物：IF1（5′-TACGGATCCTTTGACCTTGAGATGCGAGG-3′）；IR1（5′-TTGGGTACCGATGTCGACCAAGAGTCGAT-3′）.

RNAi反向片段擴(kuò)增引物：IF2（5′-TACGAGCTCTTTGACCTTGAGATGCGAGG-3′）；IR2（5′-TTGACTAGTGATGTCGACCAAGAGTCGAT-3′）.

PCR擴(kuò)增條件：94℃下4 min；運行35次循環(huán)的94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s；之后72℃延伸5 min.2段干涉片段依次連入RNAi空載體pUBI1460中，酶切檢測正確后導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，用介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的方法［14］將載體導(dǎo)入中花11中獲得轉(zhuǎn)基因植株.

1.3.2轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

用CTAB法［15］提取水稻葉片基因組DNA，然后用載體中的潮霉素抗性基因進(jìn)行分子檢測.引物為HygF （5′-CTTCTGCGGGCGATTTGT-3′）和HygR（5′-CAGCGTCTCCGACCTGAT-3′）.PCR擴(kuò)增條件：94℃下4 min；運行32次循環(huán)的94℃、30 s，57℃、30 s，72℃、30 s；之后72℃延伸5 min.PCR結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.

1.3.3目的基因的表達(dá)分析

檢測RNAi轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)情況時，從生長50 d的水稻葉片中提取總RNA；檢測植株的組織特異性表達(dá)情況時，分別從根、莖、葉和各個時期的幼穗等不同材料中提取總RNA；分析植株不同生長部位葉片中的表達(dá)情況時，從生長70 d的水稻最上部葉片、倒2葉、倒3葉及倒4葉中提取總RNA.用去基因組的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對500 ng的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng).所用引物：LPR-F（5′-CACCATGAATGCGGAAGAAC-3′）和LPR-R （5′-CCCAGAAGTAGATGGATGAC-3′）.

RT-PCR的擴(kuò)增條件：94℃下4 min；運行32次循環(huán)的94℃、30 s，57℃、30 s，72℃、30 s；之后72℃延伸5 min.以水稻OsActin1為內(nèi)參進(jìn)行相對定量分析，內(nèi)參基因所用引物為：ActinF（5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′）和ActinR（5′-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3′）.PCR反應(yīng)程序為：95℃下1 min；運行24次循環(huán)的94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s；之后72℃延伸5 min.每個反應(yīng)重復(fù)3次.

2　結(jié)果與分析

2.1OsLPR1的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

為了揭示水稻OsLPR1基因在干擾條件下的功能，本課題組構(gòu)建了OsLPR1基因的RNAi表達(dá)載體，其結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示.構(gòu)建載體時，首先利用RT-PCR方法獲得406 bp的干涉片段，如圖1（b）所示；之后將正向干涉片段用BamHI和KpnI與RNAi空載體進(jìn)行連接，獲得中間載體，再將反向干涉片段用SacI和SpeI與中間載體連接，獲得最終的RNAi表達(dá)載體.對重組載體進(jìn)行酶切檢測，按照預(yù)期的載體結(jié)構(gòu)，用BamHI和SacI進(jìn)行酶切，切出大小約為1 300 bp的預(yù)期目的片段，結(jié)果如圖1（c）所示.這說明正向和反向干涉片段都已連接到空載體中，測序驗證為連接正確.將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?

圖1　RNAi載體的構(gòu)建Fig.1　Construction of RNAi vector

2.2轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體導(dǎo)入中花11中，共獲得4個獨立株系的T0代轉(zhuǎn)基因植株65株.為了檢測構(gòu)建的RNAi載體是否轉(zhuǎn)入水稻中，提取葉片DNA，利用載體上的潮霉素抗性基因進(jìn)行PCR檢測.結(jié)果表明，65株轉(zhuǎn)基因植株中有52株為轉(zhuǎn)基因陽性植株，陽性率為80%，轉(zhuǎn)基因植株的部分分子檢測結(jié)果如圖2（a）所示.在獲得的4個株系的轉(zhuǎn)基因植株中，實驗觀察到有2個株系的11株出現(xiàn)白化苗，如圖2（b）所示.這些白化苗不能正常生長，生長約20 d后逐漸枯萎死亡.為了驗證白化苗的形成是否是由OsLPR1-RNAi干涉引起，本課題組提取了白化苗、正常綠苗和野生型植株的RNA，用RT-PCR方法檢驗OsLPR1的表達(dá)量，結(jié)果如圖2（c）所示.OsLPR1的表達(dá)量在白化苗中明顯較低，而在正常綠苗及野生型植株中表達(dá)較高，這表明白化苗是由目的基因RNAi干涉所致，由此認(rèn)為干涉OsLPR1的表達(dá)會導(dǎo)致水稻出現(xiàn)白化現(xiàn)象.

圖2　轉(zhuǎn)基因植株的表型分析Fig.2　Analysis of phenotype in transgenic plants

2.3OsLPR1基因在水稻中的表達(dá)分析

為了明確OsLPR1在水稻不同組織器官中的表達(dá)情況，分別提取了野生型的莖頂端分生組織（SAM）、根、莖、葉、葉鞘和不同時期幼穗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過RT-PCR檢測目的基因OsLPR1在水稻不同器官中的表達(dá)差異，結(jié)果如圖3所示.由圖3 （a）可以看出，OsLPR1在上述的SAM、根、莖、葉、葉鞘和不同時期幼穗中均有不同程度的表達(dá)，在水稻的葉和葉鞘中表達(dá)量較高，其他組織中表達(dá)量較低.分析OsLPR1在不同部位葉片中的表達(dá)，結(jié)果如圖3（b）所示，OsLPR1在最上部葉片、倒二葉、倒三葉、倒四葉中的表達(dá)沒有明顯差異.

圖3　OsLPR1基因的組織特異性表達(dá)Fig.3　Tissue-specific expression of OsLPR1

3　討論

本研究構(gòu)建了LRR-RLKs類家族成員OsLPR1的RNAi表達(dá)載體，利用反向遺傳學(xué)方法探究其功能.結(jié)果表明，干涉OsLPR1的表達(dá)能夠?qū)е滤境霈F(xiàn)白化苗，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)目的基因的表達(dá)量在白化苗中明顯下降.已有研究表明，白化突變體最典型的特征就是葉綠體不能正常發(fā)育，如在水稻白化突變體alb21中，葉綠體就因為葉綠素的合成途徑受阻從而無法正常發(fā)育［18］.本研究揭示的OsLPR1基因受到干擾后產(chǎn)生白化現(xiàn)象，這是否與水稻葉綠體的發(fā)育有關(guān)還需進(jìn)一步論證.因此，今后本課題組還將構(gòu)建OsLPR1基因的過量表達(dá)載體，研究該基因在過量表達(dá)情況下的功能；同時，研究該基因在葉綠體的發(fā)育及葉綠素合成途徑中的表達(dá)調(diào)控，以此揭示OsLPR1基因與葉綠素合成基因之間的關(guān)系，最終闡明OsLPR1基因表達(dá)受到干擾與水稻白化病的關(guān)系.此外，OsLPR1基因的組織特異性分析表明，其在葉片和葉鞘中表達(dá)量極高，說明該基因可能在葉片發(fā)育過程中起重要作用.

參考文獻(xiàn)：

［1］劉茜，孫健，李莉云，等.5個水稻蛋白激酶的克隆、表達(dá)及活性研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（6）：83-88. LIU Q，SUN J，LI L Y，et al.Cloning，expression and autophosphorylation of 5 rice protein kinases［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2007，23（6）：83-88（in Chinese）.

［2］CHEN X H，TAO Y，LIU G Z，et al.A recombination based strategy for assembling open-reading frames［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2005，23（4）：1-7.

［3］閆鋒，祝傳書，龐保平.植物類受體蛋白激酶的研究進(jìn)展［J］.西北植物學(xué)報，2009，29（4）：851-858. YAN F，ZHU C S，PANG B P.Advance in research of plant receptorlike protein kinases［J］.Acta Bot Boreal Occident Sin，2009，29（4）：851-858（in Chinese）.

［4］牛吉山.植物和小麥蛋白激酶的研究現(xiàn)狀［J］.西北植物學(xué)報，2003，23（1）：143-150. NIU J S.Studies on plant and wheat protein kinases［J］.Acta Bot Boreal Occident Sin，2003，23（1）：143-150（in Chinese）.

［5］馮蕾，張海文，黃榮峰.植物L(fēng)RR類受體蛋白激酶的研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2012，14（6）：43-48. FENG L，ZHANG H W，HUANG R F.Research progress on LRR receptor-like protein kinase in plant［J］.Journal of Agricultural Science and Technology，2012，14（6）：43-48（in Chinese）.

［6］SONG D H，LI G J，SONG F M，et al.Molecular characterization and expression analysis of OsBISERK1，a gene encoding a leucine-rich repeat receptor-like kinase，during disease resistance responses in rice［J］. Mol Biol Rep，2008，35（2）：275-283.

［7］KOBE B，KAJAVA A V.The leucine-rich repeat as a protein recognition motif［J］.Curr Opin Struct Biol，2001，11（6）：725-732.

［8］TORII K U.Leucine-rich repeat receptor kinases in plants：structure，function，and signal transduction pathways［J］.Int Rev Cytol，2004，23 （4）：1-46.

［9］查笑君，馬伯軍，潘建偉，等.植物富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶的研究進(jìn)展［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，33（1）：7-12. ZHA X J，MA B J，PAN J W，et al.Research advances in leucine-rich repeat receptor-like protein kinases in plants［J］.Journal of Zhejiang Normal University：Natural Sciences，2010，33（1）：7-12（in Chinese）.

［10］郭立琳，鄧沛怡，陳奇輝，等.擬南芥LRR-RLK亞家族基因At1g09970突變體鑒定及表型觀察［J］.湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2006，29（2）：80-83. GUO L L，DENG P Y，CHEN Q H，et al.Identification of LRR-RLK gene At1g 09970 homozygous mutants and their phenotypic observation in Arabidopsis［J］.Journal of Natural Science of Hunan Normal University，2006，29（2）：80-83（in Chinese）.

［11］CLARK S E，RUNNING M P，MEYEROWITZ E M.A regulator of meristem and flower development in Arabidopsis［J］.Development，1993，119（2）：397-418.

［12］TORIL K U，MISTSUKAWA N，OOSUMI T.The Arabidopsis ERECTA gene encodes a putarive receptor protein kinase with extracelluar leucine-rich repeats［J］.The Plant Cell，1996，8（4）：735-746.

［13］SONG W Y，WANG G L，CHEN L L，et al.A receptor-like protein kinase encoded by the rice disease resistance gene，Xa21［J］.Science，1995，270（5243）：1804-1806.

［14］LIU G Z，PI L Y，WALKER J C，et al.Biochemical characterization of the kinase domain of the rice disease resistance receptor-like kinase XA21［J］.J Biol Chem，2002，277（23）：20264-20269.

［15］SONG W Y，PI L Y，WANG G L，et al.Evolution of the rice Xa21 disease resistance gene family［J］.Plant Cell，1997，9（8）：1279-1287.

［16］SUN X L，CAO Y L，YANG Z F，et al.Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae in rice，encodes an LRR receptor kinaselike protein［J］.Plant J，2004，37（4）：517-527.

［17］CHEN X W，SHANGJ J，CHEN D X，et al.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance［J］.The Plant Journal，2006，46 （5）：794-804.

［18］余慶波，江華，米華玲，等.水稻白化突變體alb21生理特性和基因定位［J］.上海師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，34（1）：70-75. YU Q B，JIANG H，MI H L，et al.The physiological character and molecular mapping in rice albino21 mutant［J］.Journal of Shanghai NormalUniversity：NaturalSciences，2005，34（1）：70-75（inChinese）.

（責(zé)任編校紀(jì)翠榮）

第一作者：宋婷（1990—），女，碩士研究生.

文章編號：1671-1114（2016）01-0048-04

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2015-09-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（31171515）；天津市高校中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃資助項目（ZX110gg017）.

通信作者：欒維江（1971—），男，教授，主要從事水稻功能基因組學(xué)方面的研究．

RNAi and expression analysis of a leucine-rich repeat receptor-like protein kinase in rice

SONG Ting，XIONG Wei，LI Yingying，CAO Zhenhua，LIU Chenxi，LIU Weiyin，LUAN Weijiang
（a.College of Life Sciences，b.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Abstract：To reveal the function of OsLPR1，a member of leucine-rich repeat receptor protein-like kinase family（LRRRLKs），in growth and development of rice，the RNAi vector of OsLPR1 were constructed to produce transgenic plants by reverse genetics method.It was found that knockdown of OsLPR1 produced the albino seedlings by phenotypic observation. RT-PCR expression analysis showed that the expression of OsLPR1 was obviously lower in the albino seedlings compared with that in wild type，which suggested that OsLPR1 RNAi lead to the rice albino.In addition，the tissue-specific expression of OsLPR1 was analyzed，and the results showed that OsLPR1 was expressed in different organs，but was higher in the leaf and leaf sheath.Overall，the result indicated that OsLPR1 may be relative to the leaf development in rice.

Keywords：protein kinase；expression analysis；RNAi analysis；albino；OsLPR1