青蒿琥酯在大鼠體內(nèi)外抗肝纖維化的作用

彭龍希，高思楠，王　媛，閆　靜，李艷蕓，方步武（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，天津　000；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心移植ICU，天津　0019；.天津市腫瘤醫(yī)院，天津　0000；.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，陜西西安　7100；.天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津　00070）

青蒿琥酯在大鼠體內(nèi)外抗肝纖維化的作用

彭龍希1，6，高思楠2，王媛3，閆靜4，李艷蕓5，方步武6
（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，天津300052；2.天津市第一中心醫(yī)院
器官移植中心移植ICU，天津300192；3.天津市腫瘤醫(yī)院，天津300060；4.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，陜西西安710032；5.天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，6.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津300070）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.026.html

目的觀察青蒿琥酯（artesunate，Art）對大鼠肝纖維化的治療作用及其對大鼠原代肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）增殖的影響，并探討其作用機制。方法建立牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）免疫性肝纖維化大鼠模型，分為正常對照組、模型對照組及青蒿琥酯低、中、高劑量組；給藥組分別給予不同劑量的青蒿琥酯灌胃，正常和模型對照組給予同體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)2個月；酸水解法檢測其肝組織膠原蛋白含量，測定血清白蛋白（albumin，Alb）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine amino transferase，ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate amino transferase，AST）水平；蘇木精-伊紅染色法 （hematoxylin-eosin staining，HE染色）和膠原染色法對肝組織切片染色。分離大鼠HSCs，以培養(yǎng)活化HSCs。用MTT法測定HSCs增殖率，消化法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量，Western blot和RT-PCR法檢測HSCs p53表達(dá)。結(jié)果與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清Alb水平降低（P＜0.05），ALT、AST水平增高（P＜0.05）；與模型對照組相比，青蒿琥酯低、中、高劑量組血清AST水平降低（P＜0.05），大鼠肝組織膠原蛋白含量降低（P＜0.05）。青蒿琥酯對培養(yǎng)活化的HSCs有抑制作用，且呈劑量和時間依賴性（P＜0.05）；青蒿琥酯作用24 h后，HSCs分泌羥脯氨酸減少（P＜0.05），p53 mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）。結(jié)論青蒿琥酯在大鼠體內(nèi)、體外均有抗肝纖維化作用，該作用與其增加HSCs p53的表達(dá)有關(guān)。

青蒿琥酯；肝纖維化；牛血清白蛋白；肝星狀細(xì)胞；細(xì)胞增殖；p53

肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝損傷之后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，是“慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化”這一發(fā)展過程的樞紐環(huán)節(jié)［1］。在肝纖維化形成的過程中，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活和增殖是發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［2］，阻止HSCs的增殖活化有可能阻斷肝纖維化的進(jìn)程［3］。但目前臨床上仍無療效確切且不良反應(yīng)少的抗肝纖維化藥物。青蒿琥酯（artesunate，Art）化學(xué)名為二氫青蒿素-1，2-α-琥珀酸單酯，是具有倍半萜內(nèi)酯類青蒿素的衍生物，具有廣泛的藥理作用［4-5］，如抗腫瘤、抗乙型肝炎病毒、解毒保肝、抗肝纖維化、調(diào)節(jié)免疫功能等。

本課題組以往研究證實［6］，Art能預(yù)防BSA誘導(dǎo)的肝纖維化，但其是否具有治療BSA誘導(dǎo)的肝纖維化作用尚不清楚，目前對Art抗肝纖維化的機制了解也較少。本實驗擬探討Art治療BSA免疫性大鼠肝纖維化的作用，以及對培養(yǎng)活化的原代HSCs的抑制纖維發(fā)生的作用，并初步探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1動物與試劑SPF級健康Wistar大鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。青蒿琥酯由廣西桂林南藥股份有限公司贈予，DMEM與胎牛血清（Hyclon），鏈酶蛋白酶E（Roche），羥脯氨酸、Alb、ALT 及AST測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），βactin抗體、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），p53抗體（Invitrogen），PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2青蒿琥酯抗BSA免疫性大鼠肝纖維化的體內(nèi)實驗

1.2.1模型制備及分組采用BSA免疫性肝纖維化大鼠模型，SPF級Wistar大鼠60只（♀♂各半），隨機取8只為正常對照組，其余52只用于造模。以9 g·L-1BSA弗氏不完全佐劑乳化液經(jīng)足跖皮下多點致敏注射5次后，通過瓊脂平板雙向擴散法檢測大鼠血清中的抗BSA抗體。取抗體陽性者，尾靜脈攻擊注射BSA生理鹽水，每周2次，劑量由每次每只2 mg（0.4 mL）遞增至每次每只3.4 mg（0.4 mL），共計15次。隨機處死10只造模大鼠，經(jīng)肝組織形態(tài)學(xué)觀察與膠原蛋白含量測定證實造模成功后，即對其余42只造模大鼠按體重隨機區(qū)組法分為4組，分別為：模型對照組、青蒿琥酯低、中、高劑量組（3.2、9.6、28.8 mg·kg-1），給藥組藥物濃度均按10 mL·kg-1體質(zhì)量灌胃，正常組和模型組灌胃同體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)2個月。

1.2.2肝組織膠原蛋白和血清Alb、ALT及AST水平的測定將脫水脫脂的肝組織研磨成粉，105℃干燥直至恒重，稱取40 mg肝粉，酸水解法于波長558nm處測吸光度值（A值）；由已知羥脯氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的A值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測試液的A值計算出肝組織內(nèi)的羥脯氨酸濃度。再將Hyp（mg/ g）乘以系數(shù)22.38（6 000/50×7.46/40）（μg/mg= mg/g，膠原蛋白/肝干粉）換算為肝組織膠原蛋白含量。按試劑盒說明測定大鼠血清Alb、ALT、AST水平。

1.2.3肝組織形態(tài)學(xué)觀察取肝右葉相同部位肝組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色和膠原染色。膠原染色采用Ponceau S/Victoria blue B染色法，肝纖維化程度的分期及計分標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)［7］。

1.3青蒿琥酯抗肝纖維化的體外實驗

1.3.1HSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定300～400 g Wistar大鼠經(jīng)烏拉坦腹腔注射麻醉后消毒，0.8 g· L-1鏈酶蛋白酶50 mL與0.5 g·L-1膠原酶50 mL原位灌流消化肝臟，細(xì)胞懸液經(jīng)8%、12%和18% Nycodenz梯度離心（1 450×g，20 min，4℃），于8%與12%的梯度界面獲取HSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105，接種于培養(yǎng)瓶中，以含20%FBS的DMEM培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察新鮮分離的細(xì)胞形態(tài)和生長特征。細(xì)胞爬片以免疫細(xì)胞化學(xué)法，即GFAP/FITC、actin/TRITC、DAPI染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3.2不同濃度青蒿琥酯對HSCs增殖影響的觀察采用MTT法，取對數(shù)生長的HSCs，以3×107· L-1密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度的青蒿琥酯使其終濃度分別為125、150、175、200、225 μmol·L-1，設(shè)空白對照組，每組6個復(fù)孔，分別孵育24、48、72 h，用酶標(biāo)儀測各孔吸光度值（A570nm值），按以下公式計算細(xì)胞抑制率（inhibition rate，IR），IR/%=（空白對照組A 值-實驗組A值）/空白對照組A值×100%。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸檢測取對數(shù)生長的HSCs以5×108·L-1的密度接種于6孔板，分別設(shè)有空白對照組、給藥組（濃度分別為150、175、200 μmol·L-1）。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4青蒿琥酯對大鼠原代HSCs p53表達(dá)的影響

取對數(shù)生長的HSCs以5×108·L-1的密度接種于6孔板，分別設(shè)有空白對照組、給藥組（濃度分別為150、175、200 μmol·L-1）。培養(yǎng)24 h后，經(jīng)胞核裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒測定核蛋白含量，取15 μg核蛋白上樣，12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶2 000）2 h，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，膠片曝光，顯影定影后掃描，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)讀取條帶面積和灰度，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比作為半定量標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)3次。取對數(shù)生長的HSCs，按上述方法分組，并給予相同處理，培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用20μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。目的基因p53（上游引物為5'-GTTCCGAGAGCTGAATGAGG-3'，下游引物為5'-TTTTATGGCGGGACGTAGAC-3'），擴增片段長125 bp；內(nèi)參GAPDH（上游引物為5'-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3'，下游引物為 5'-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3'），擴增片段長299 bp。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳圖像的采集，并對p53 mRNA、GAPDH mRNA的PCR產(chǎn)物光密度和面積進(jìn)行半定量分析，計算p53 mRNA、GAPDH mRNA的光密度積分，以二者比值代表HSCs中p53 mRNA的相對表達(dá)量。

Tab 1　Effect of Art on liver tissue collagen，serum Alb，ALT and AST levels in immuno-injured hepatic fibrosis rats induced by BSA

2　結(jié)果

2.1青蒿琥酯對BSA免疫性肝纖維化大鼠肝組織膠原蛋白和血清Alb、ALT及AST水平的影響

與正常組比較，模型對照組大鼠血清Alb水平降低（P＜0.05），ALT、AST水平增高（P＜0.05）；青蒿琥酯各劑量組均能降低大鼠血清 AST水平（P＜0.05）；高劑量組能降低大鼠血清ALT水平（P＜0.05）。與正常組比較，模型對照組大鼠肝組織膠原蛋白含量增高（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組大鼠肝組織膠原蛋白含量均降低（P＜0.05），見Tab 1。

2.2青蒿琥酯對BSA免疫性肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響膠原染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織僅于匯管區(qū)及中央靜脈有少量膠原纖維存在；模型對照組大鼠肝組織中膠原纖維明顯增多，分布廣泛，多位于匯管區(qū)及血管周圍，并向肝小葉內(nèi)延伸，相互連接形成較粗大的纖維間隔，包繞肝細(xì)胞形成大小不等、形狀不規(guī)則的假小葉；青蒿琥酯中、高劑量組大鼠肝組織中有少量纖維組織增生，僅分布于匯管區(qū)及血管周圍；青蒿琥酯低劑量組大鼠肝組織中增生的纖維自匯管區(qū)及中央靜脈向四周延伸，但纖維間隔薄，未形成完全連接，不完全分割肝小葉，與模型組比較則明顯減少。HE染色結(jié)果顯示，模型對照組大鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，可見界板及中央靜脈周圍肝細(xì)胞壞死及較多炎癥細(xì)胞浸潤；肝細(xì)胞腫脹變性，多為脂肪變，部分呈氣球樣變，細(xì)胞邊界不清，胞質(zhì)不均、嗜酸性小體形成或胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡；匯管區(qū)結(jié)締組織不同程度增生擴大，向小葉內(nèi)延伸，將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)，可見假小葉形成；各治療組肝組織結(jié)構(gòu)破壞不明顯，肝細(xì)胞變性壞死程度減輕，纖維成分減少，匯管區(qū)結(jié)締組織增生減輕，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤（Fig 1）。各組大鼠肝纖維化程度分期及計分比較見Tab 2。

Tab 2　Stage and score of liver fibrosis in each group

2.3HSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定倒置熒光顯微鏡下觀察新分離的HSCs呈圓形，折光性強，遠(yuǎn)小于肝細(xì)胞，但大于枯否細(xì)胞和紅細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的脂滴，內(nèi)含典型的折光顆粒。4 h后，多數(shù)細(xì)胞已貼壁，胞質(zhì)內(nèi)脂滴明顯；48h后，細(xì)胞呈扁圓、橢圓形，少數(shù)細(xì)胞已開始伸展；3～4 d后，貼壁細(xì)胞伸展，胞體增大，形態(tài)多樣，一部分細(xì)胞已呈現(xiàn)多角偽足、星狀外形的典型形態(tài)。10 d后，細(xì)胞逐漸融合，形成單層。隨培養(yǎng)天數(shù)增加及細(xì)胞增殖，胞質(zhì)中脂滴逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)由星形向梭形變化，類似成纖維細(xì)胞。第2代HSCs細(xì)胞GFAP/FITC、actin/TRITC染色呈陽性，且陽性細(xì)胞數(shù)＞99%。見Fig 2。

2.4青蒿琥酯對HSCs增殖的影響青蒿琥酯抑制HSCs增殖，且呈濃度、時間依賴性，見Tab 3。

2.5青蒿琥酯對HSCs羥脯氨酸分泌量的影響青蒿琥酯作用24 h后，各給藥組細(xì)胞分泌羥脯氨酸水平降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見Tab 4。

Fig 1　HE and collagen staining of liver tissue

Fig 2　HSCs identification

Tab 3　Inhibition rate of Art on HSCs under different concentrations and time（±s，n=6）

Tab 3　Inhibition rate of Art on HSCs under different concentrations and time（±s，n=6）

0.01 vs 24 h；▲▲P＜0.01 vs 48 h

Art/Inhibition rate/% μmol·L-124 h　48 h　72 h 125　6.06±1.44　9.61±4.82　75.59±4.82▲▲150　21.47±5.57　26.97±9.28　92.60±1.18▲▲175　42.00±7.36##　70.53±6.77##△△　94.61±0.90▲▲200　67.12±4.55**　87.55±2.40**△△　94.91±4.04 225　79.83±3.67　94.91±0.99△△95.32±0.25##P＜0.01 vs 150 μmol·L-1；**P＜0.01 vs 175 μmol·L-1；△△P＜

Tab 4　Effects of Art on secretion of hydroxyproline of HSCs（±s，n=6）

Tab 4　Effects of Art on secretion of hydroxyproline of HSCs（±s，n=6）

**P＜0.01 vs control

Group　Hydroxyproline content/mg·L-1Control　1.715±0.030 Art 150 μmol·L-1　1.619±0.026**Art 175 μmol·L-1　1.515±0.020**Art 200 μmol·L-1　1.339±0.030**

2.6青蒿琥酯對HSCs p53表達(dá)的影響青蒿琥酯150、175、200 μmol·L-1分別作用HSCs 24 h后，p53表達(dá)明顯增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加而增加。HSCs對照組的p53表達(dá)極少，各給藥組p53 mRNA表達(dá)水平較對照組明顯升高（P＜0.05），各治療組之間差異未見統(tǒng)計學(xué)意義，見Fig 3。

Fig 3　Effects of Art on p53 protein（A）and mRNA（B）expression

3　討論

肝纖維化是指由于各種致病因子的刺激，肝臟中膠原蛋白等ECM的增生與降解失去平衡，導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過程［8］。目前抗肝纖維化的主要策略包括：治療原發(fā)病，抑制ECM增生，促進(jìn)ECM降解，抑制HSCs活化與誘導(dǎo)其凋亡。激活的HSCs產(chǎn)生一些促纖維發(fā)生的細(xì)胞因子和生長因子，這些因子通過旁分泌和自分泌效應(yīng)持續(xù)存在于肝纖維發(fā)生的過程中。因此，針對HSCs的治療是預(yù)防和治療肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。

青蒿素是我國發(fā)現(xiàn)的第一個被國際公認(rèn)的天然藥物，以此為基礎(chǔ)合成了多種衍生物如青蒿琥酯、蒿甲醚及雙氫青蒿素。其中水溶性的青蒿琥酯具有廣譜抗寄生蟲作用，如抗瘧原蟲、血吸蟲及肺孢子蟲等，是高效、低毒的抗瘧藥，且吸收好、分布廣、代謝和排泄快；陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等［10-12］。本課題組的前期研究表明青蒿琥酯具有抗肝纖維化作用，并從調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)HSCs凋亡、上調(diào)神經(jīng)酰胺的生成等環(huán)節(jié)探討了其抗肝纖維化的作用機制［13-14］。

本文體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯灌胃給藥能降低BSA免疫性肝纖維化大鼠肝組織膠原蛋白含量及血清AST和ALT水平；模型對照組大鼠界板及中央靜脈周圍肝細(xì)胞壞死伴炎性細(xì)胞浸潤，由膠原纖維等構(gòu)成的纖維間隔伸入肝小葉，甚至形成假小葉，經(jīng)青蒿琥酯治療后，膠原纖維增生程度明顯減輕，甚至僅在匯管區(qū)和中央靜脈有少量纖維增生，各治療組肝纖維化程度分期和計分均減低。同時，青蒿琥酯在體外能明顯抑制培養(yǎng)活化的HSCs的增殖，且抑制作用呈濃度和時間依賴性；并能降低培養(yǎng)活化的HSCs分泌羥脯氨酸，表明青蒿琥酯具有抑制肝纖維化發(fā)生的作用。

需要指出的是，BSA免疫性大鼠肝纖維化模型的死亡率與動物質(zhì)量、個體差異及操作技術(shù)等有關(guān)，如尾靜脈注射速度過快時易致死亡，對BSA敏感者易死亡。本文造模大鼠的總死亡率達(dá)40.4%，包括造模期間的死亡率，治療過程中的死亡率，后者又包括灌胃不當(dāng)引起的動物死亡等，但并非由于藥物的毒性導(dǎo)致的死亡。另外，AST水平在用藥組之間未見統(tǒng)計學(xué)差異，其原因有待進(jìn)一步研究。

P53基因定位于17p13.1，長約20 kb，含11個外顯子，轉(zhuǎn)錄的mRNA長2.8 kb，其產(chǎn)物為p53蛋白，由393個氨基酸構(gòu)成。p53在正常細(xì)胞中表達(dá)量極低，但是當(dāng)細(xì)胞受到如低氧、紫外線照射、化合物刺激后，其表達(dá)量快速急劇增加并被激活，由于含有一段序列專一性DNA轉(zhuǎn)錄結(jié)合序列，作為轉(zhuǎn)錄因子，p53可調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期、凋亡、分化、靜息、DNA損傷、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制以及其他功能［15-16］。p53是細(xì)胞生長的“監(jiān)控器”，是細(xì)胞生長的重要負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞增殖。Weng等［17］發(fā)現(xiàn)，p53的缺失促進(jìn)了肝纖維化和腫瘤在 Alb-Mcl-1-/-鼠中的發(fā)展，表明 p53激活了Alb-Mcl-1-/-肝臟從而促進(jìn)肝細(xì)胞的生存。本文實驗顯示，青蒿琥酯能明顯提高p53 mRNA及其蛋白在HSCs的表達(dá)，從而抑制HSCs增殖及膠原蛋白合成等，也就抑制了肝的纖維發(fā)生。

總之，青蒿琥酯通過增加p53在HSCs的表達(dá)，發(fā)揮了體內(nèi)、外的抗肝纖維化作用。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步研究青蒿琥酯在肝纖維化治療方面提供了必要的實驗依據(jù)，對肝纖維化的治療有著積極的意義。

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Effect of artesunate on rat liver fibrogenesis in vitro and in vivo

PENG Long-xi1，GAO Si-nan2，WANG Yuan3，YAN Jing4，LI Yan-yun5，F(xiàn)ANG Bu-wu6
（1.Dept of Pharmacy，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin300052，China；2.Transplant Intensive Care Unit，
Dept of Organ Transplantation，Tianjin First Center Hospital，Tianjin300192，China；3.Tianjin Medical University Cancer Institute&Hospital，Tianjin 300060，China；4.Tangdu Hospital，Xi’an710032，China；5.Dept of Biochemistry and Molecular Biology，6.Dept of Pharmacology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

AimTo study the effect of artesunate on immuno-injured hepatic fibrosis induced by bovine serum albumin in rat model and the effect of artesunate on hepatic stellate cells（HSCs）proliferation，so as to provide experimental evidence for clinical application of artesunate and the treatment of hepatic fibrosis. MethodsThe model of immuno-injured hepatic fibrosis induced by bovine serum albumin was established in Wistar rats.Rats were randomly divided into 5 groups：normal group，model group，low dose of artesunate，middle dose of artesunate and high dose of artesunate.Drugs were given to the corresponding therapeutic groups，and then were continued once a day for two months.Distilled water was given to the rats of normal and model groups according to the same method.Liver tissues were used for measuring the content of collagen，the rat serum activities of albumin（Alb），alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）.Liver tissue’s pathological changes were observed by HE and collagen staining.Isolated and cultured rat primary HSCs in the flask for 10 days to make cells activated，MTT assay was used to detect rate of cellular proliferation；concentration of hydroxyproline in supernatant was detected by digestive method；the expression of p53 was investigated by Western blot and RT-PCR.ResultsSerum levels of Alb in model group were significantly lower（P＜0.05），and levels of ALT and AST in model group were significantly higher（P＜0.05）compared with normal group.Levels of AST in low，middle and high dose groups（3.2，9.6，28.8 mg·kg-1）were significantly lower（P＜0.05）compared with model group，and levels of ALT in high dose groups were significantly lower（P＜0.01）compared with model group.The contents of collagen in model groups were significantly higher（P＜0.01）compared with normal group，while the contents of collagen in therapy groups significantly decreased（P＜0.05）compared with model group. Activated HSCs treated with various concentrations of artesunate（150，175，200 μmol·L-1）were inhibited on dose and time-effect relationships.Production/ secretion of hydroxyproline decreased after HSCs was treated by artesunate for 24 h；the expression of p53 was up-regulated showed by Western blot and RT-PCR in artesunate treated cells.ConclusionArtesunate brings about anti-fibrosis in vitro and in vivo by increasing the expression of p53.

artesunate；hepatic fibrosis；bovine serum albumin；hepatic stellate cells；cell proliferation；p53

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.013

A

1001-1978（2016）05-0658-06

R-332；R284.1；R322.47；R329.24；R575.205.31

2016-01-06，

2016-02-01

國家自然科學(xué)基金資助項目（No 30772856）

彭龍希（1986-），女，碩士，藥師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：plx258123@sina.com；方步武（1962-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通迅作者，E-mail：fangdch@aliyun.com