LC-MS/MS法測定腦透析液中人參皂苷Rg1濃度及對其體內(nèi)和體外探針回收率的考察

劉　楊，薛　薇，李　敏，齊文淵，高　妍，胡　欣，李可欣（衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學部，北京　100730）

LC-MS/MS法測定腦透析液中人參皂苷Rg1濃度及對其體內(nèi)和體外探針回收率的考察

劉楊，薛薇，李敏，齊文淵，高妍，胡欣，李可欣
（衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學部，北京100730）

網(wǎng)絡出版時間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.050.html

目的建立高效液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）方法，用于測定腦透析液中人參皂苷Rg1的濃度，并基于該方法考察Rg1在體外及大鼠海馬、腦室的體內(nèi)探針回收率，為Rg1在大鼠腦內(nèi)的藥代動力學研究奠定基礎。方法高效液相色譜采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），以甲醇-水為流動相，進行梯度洗脫，流速為0.4 mL·min-1?？疾毂痉椒ǖ奶禺愋?、線性范圍、精密度、準確度以及穩(wěn)定性。分別采用將探針置于不同濃度標準溶液以及將探針植入對應腦區(qū)后通入不同濃度灌流液的方法，考察微透析探針對人參皂苷Rg1的體外以及體內(nèi)回收率，并進一步比較兩者間的差異。結果人參皂苷Rg1的保留時間為1.91 min，線性范圍為0.1～50 μg·L-1，日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于15%。微透析探針對人參皂苷Rg1的體外回收率為（4.05±0.28）%，體內(nèi)回收率為（26.96± 4.45）%，且在9 h內(nèi)穩(wěn)定。結論LC-MS/MS法準確、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于大鼠腦微透析樣品中人參皂苷Rg1的濃度測定。探針對Rg1的體外回收率可能受溫度等多因素影響而低于體內(nèi)回收率，因此體內(nèi)回收率更接近體內(nèi)透析環(huán)境和過程，是校正透析液濃度的可靠方法。

高效液相色譜串聯(lián)質譜；人參皂苷Rg1；微透析；探針回收率；體外；體內(nèi)

人參自古被稱為益智良藥，其主要藥理活性成分為人參皂苷［1］，其中人參皂苷Rg1為一種原人參三醇型皂苷［2］。大量研究表明，人參皂苷Rg1與改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)病變［3］、促進神經(jīng)再生［4-5］、激活學習記憶轉導途徑［6-8］和提高神經(jīng)可塑性［9-10］等關系密切，由于其主要作用部位為腦，因此考察其在學習記憶相關腦區(qū)的吸收程度尤為重要。目前較常用的考察腦內(nèi)藥物濃度的方法為微透析方法［11］，然而檢測到的微透析液中藥物濃度不等同于腦內(nèi)真實藥物濃度，因此需進行探針回收率校正。考察探針回收率一般分為體內(nèi)和體外兩種方法［12］，本文即通過建立LC-MS/MS法測定大鼠腦脊液中人參皂苷Rg1的濃度，進而考察探針體外與體內(nèi)回收率，并比較兩者之間的差異，為今后進一步研究其在各腦區(qū)中的分布奠定基礎。

1　材料

1.1藥品與試劑復方氯化鈉注射液（Ringer’s，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司），人參皂苷Rg1對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量93.4%，批號110703-201128），紫杉醇（中國食品藥品檢定研究院，含量99.6%，批號100382-201102），甲醇（美國Fisher公司），超純水（法國 Millipore公司 Milli-QA10 Synthesis制備）。

1.2儀器AB API 5000型三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配備電噴霧電離源（ESI）（美國AB SCIEX公司）；SHIMADZU 20AD高效液相色譜儀，含LC-30AD型二元液相泵（日本島津公司）。

1.3動物清潔級Sprague Dawley大鼠（北京，維通利華公司），♂，250～300 g。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。

2　方法

2.1LC-MS/MS法檢測透析液中Rg1濃度

2.1.1溶液配制人參皂苷Rg1對照品溶液的配制：精密稱取人參皂苷Rg1標準品10.72 mg，用甲醇∶水=1∶1（V∶V）溶解并定容至50 mL，制成200 mg·L-1的Rg1儲備溶液。

紫杉醇（內(nèi)標）溶液的配制：精密稱取紫杉醇標準品10.35 mg，用甲醇∶水=1∶1（V∶V）溶解并定容至50 mL，制成200 mg·L-1的紫杉醇儲備溶液。

2.1.2生物樣品預處理精密量取10 μL微透析樣品置于1.5 mL PCR離心管中，加入10 μL甲醇混勻后，再加入100 μL紫杉醇（內(nèi)標）溶液，混勻，加入進樣小瓶中進樣。

2.1.3色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters）；流動相：A相：水，B相：甲醇；流速：0.4 mL·min-1；洗脫程序：0～0.5 min 10% ～90%甲醇，0.5～2.5 min 90%甲醇，2.5～2.7 min 90% ～10%甲醇，2.7～3.5 min 10%甲醇，總分析時間為3.5 min，梯度流速恒定為0.4 mL·min-1，柱溫：40℃；自動進樣器：4℃；進樣量為10 μL。

樁基工程是房屋建筑工程領域中的重要組成部分，承載著房屋建筑結構支撐、房屋地基承載力提升的重要使命，其施工質量的高低直接影響房屋建筑施工質量與使用安全、穩(wěn)定與可靠。對此，在當前房屋建筑項目規(guī)?；?、大數(shù)量、多樣化發(fā)展背景下，需明確認知與掌握樁基施工技術，加強質量檢測，以提升樁基施工質量，為房屋建設奠定良好基礎。

2.1.4質譜條件電噴霧電離源（ESI），離子源電壓：5500 V，離子源溫度：500℃；離子源氣體1（N2）壓力：50 psi（1 psi≈6.9 kPa）；離子源氣體2（N2）壓力：60 psi；氣簾氣（N2）壓力：20 psi；碰撞氣壓（CAD）壓力：7 psi；去簇電壓（DP）均為200 V；碰撞電壓（EP）均為20 V；射入電壓（2CE）：47 V（Rg1），32 V（內(nèi)標紫杉醇）；碰撞室射出電壓（CXP）：20 V （Rg1），14 V（內(nèi)標紫杉醇）；正離子模式檢測；掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM）；待測物離子反應分別為：m/z 823.5→m/z 643.7（Rg1），m/z 876.9→m/z 308.5（內(nèi)標紫杉醇）。

2.2人參皂苷Rg1的探針回收率考察

2.2.1體外探針回收率考察用Ringer’s溶液配制成濃度為25 μg·L-1人參皂苷Rg1標準溶液，將探針置于其中，平衡2 h后，每30 min收集1次樣品，共收集3個樣品。以同樣的方法采集探針外液濃度（CECF）分別為50、100 μg·L-1的人參皂苷Rg1標準溶液的透析樣品，并測定對應透析液中Rg1濃度（Cdialysate），計算公式為：R（in vitro）=Cdialysate/CECF×100%。

2.2.2大鼠體內(nèi)探針回收率考察♂ SD大鼠隨機分為3組，每組5只，每組灌流液濃度（Cperfusate）分別為1、10、50 μg·L-1，定位腦區(qū)均為腦室（LV）及海馬（HIP）。將大鼠麻醉，定位側腦室（前鹵后0.8 mm，旁開2.4 mm，硬膜下3.4 mm）以及海馬（前鹵后5.6 mm，旁右開5.0 mm，硬膜下5.2 mm）后，在腦區(qū)內(nèi)埋置探針引導管，將接受以上手術的大鼠正常飼養(yǎng)3 d后，依次將兩個探針植入導管抵達兩目標腦區(qū)，再將探針連入由Ringer’s溶液配制的對應濃度的人參皂苷Rg1灌流系統(tǒng)，灌流液流速調至1.5 μL·min-1，平衡2 h后開始微透析液的收集工作，每0.5 h收集1次樣品，共收集9 h。其計算公式為：R（in vivo）=［（Cperfusate-Cdialysate）/Cperfusate］× 100%。

3　結果

3.1方法學驗證

3.1.1特異性按“2.1.2”樣品預處理方法處理空白Ringer's溶液、空白Ringer's溶液加人參皂苷Rg1標準品、空白Ringer's溶液加內(nèi)標標準品、大鼠腦微透析樣品。采用“2.1.3”及“2.1.4”中色譜、質譜方法檢測并比較。結果表明，在選定的條件下，基線噪音小，人參皂苷Rg1與腦內(nèi)內(nèi)源性物質得到良好的分離，峰形良好，且與內(nèi)標互不干擾。保留時間為1.91 min，見Fig 1。

3.1.2線性關系考察精密量取Rg1儲備液適量，用甲醇∶水=1∶1（V∶V）溶液依次稀釋成50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 μg·L-1的標準溶液，混勻后分別取20 μL，并加入100 μL內(nèi)標，混勻后進樣測定。以待測物峰面積Y為縱坐標，待測物濃度X為橫坐標，用加權（1/X2）最小二乘法進行回歸運算，得標準曲線回歸方程即為標準曲線。由結果可知，人參皂苷Rg1的線性范圍是0.05～50 μg·L-1。典型標準曲線為：^Y=0.265X+4.65e-007（R2=0.9991）。

3.1.4樣品穩(wěn)定性考察

3.1.4.1儲備液室溫放置穩(wěn)定性從-80℃取出配制濃度為200 mg·L-1人參皂苷Rg1儲備液分裝液，室溫放置10 h后，與新取出的Rg1儲備液各稀釋5份，分別按照“2.1.2”項下樣品預處理方法進行處理，并進樣測定。結果顯示，Rg1放置10 h后與新配制樣品峰面積的RSD（n=5）分別為1.8%及6.3%，比值為0.99，表明Rg1儲備液在室溫放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4.2樣品處理后進樣器放置穩(wěn)定性按“3.1.2”項下方法配制濃度為0.1、2、40 μg·L-13個濃度質控溶液，按“2.1.2”項下方法處理后測定，并代入新配制的標準曲線，計算各濃度，12 h后重新進樣，并將其代入標準曲線計算濃度。結果顯示，4℃進樣器的放置12 h的處理后的透析液樣品準確度均在85%～115%之間，表明人參皂苷Rg1處理后在4℃進樣器中至少能穩(wěn)定放置12 h。

3.1.4.3樣品短期室溫放置穩(wěn)定性考察用甲醇∶Ringer’s溶液=1∶1（V∶V）配制Rg1 10、200、4 000 μg·L-13個濃度的樣品各5份，再分別吸取10 μL至990 μL的Ringer’s溶液中，得到Rg1濃度為0.1、2、40 μg·L-1的3個濃度的質控樣品各5份，置于室溫，于2 h后按“2.1.2”項下方法處理并進樣測定，代入新配制的標準曲線計算濃度，結果顯示各質控點準確度均在85%～115%之間，表明Rg1樣品在室溫至少能穩(wěn)定放置2 h。

3.2人參皂苷Rg1的探針回收率

3.2.1Rg1體外探針回收率按照“2.2.1”項下方法操作，Rg1體外探針回收率結果見Tab 2，結果表明，Rg1在3種濃度標準外液中探針回收率相對穩(wěn)定。

3.2.2Rg1體內(nèi)探針回收率按照“2.2.2”項下方法操作，Rg1在3種灌流液濃度下體內(nèi)探針回收率在9 h內(nèi)的均值見Tab 3，9 h內(nèi)各采樣點的側腦室及海馬內(nèi)回收率見Fig 2，由結果可見，Rg1在腦室及海馬以3個濃度的灌流液得到的回收率差異均無顯著性（P＞0.05），且在9 h內(nèi)回收率較穩(wěn)定。

Tab 2　Probe recovery of Rg1 in vitro（±s）

CECF/Cdialysate/μg·L-1R（in vitro）/ μg·L-11234% 25　1.072　0.976　0.879　0.967　3.91±0.31 50　2.033　2.219　1.977　2.067　4.10±0.20 100　3.865　3.899　4.125　4.357　4.04±0.23

Tab 3　Probe recovery of Rg1 in vivo（±s，n=5）

CperfusateR（in vivo）/% /μg·L-1LV　HIP 1 25.94±9.04　23.62±10.7 10　26.93±5.41　25.89±6.91 50　23.68±5.27　23.72±5.83

Fig 2　Relationship between probe recovery of Rg1 in rats and time（±s，n=5）

4　討論

本實驗采用質譜方法進行檢測，靈敏度高，且線性范圍寬。此外，采用的液相方法中，流動相為甲醇、水，配制簡單且對色譜柱損傷小，且該法分析時間短，同時該方法具有樣品處理方法簡單、所需樣品量小、可行性高的優(yōu)點。

在采用HPLC-MS/MS方法檢測時，各組分響應在使用正離子模式比使用負離子模式時強，靈敏度高，且人參皂苷Rg1及內(nèi)標的加鈉母離子［M+ Na］+比其各自的加氫母離子［M+H］+響應更高。對MS/MS方法優(yōu)化后，采用多反應離子監(jiān)控模式對各組分進行檢測。

此外，在實驗中發(fā)現(xiàn)配制人參皂苷Rg1標準溶液時直接用Ringer’s溶液稀釋準確度差，不能達到實驗要求，而增加稀釋液中有機相比例，有明顯改善。因此推測為Rg1在Ringer’s溶液中溶解度低的原因所致，為方便配制，本實驗最終選擇用甲醇∶Ringer’s溶液=1∶1（V∶V）溶液逐級稀釋的方法對樣品進行處理。然而由于基質不同，標準溶液穩(wěn)定性有很大差異，因此，本文在考察樣品室溫放置穩(wěn)定性時，采取先用甲醇 ∶Ringer’s溶液=1∶1 （V∶V）溶液逐級稀釋到目標濃度的100倍，再用Ringer’s溶液將每個濃度稀釋到目標濃度的方法。此外，由于本實驗中的樣品采集后立即進行測定，因此未考察樣品長期放置穩(wěn)定性。

本實驗所建立的用于檢測透析液中人參皂苷Rg1含量的LC-MS/MS方法具有簡單快速、靈敏準確、重現(xiàn)性好的特點，可用于測定微透析實驗中探針體外及體內(nèi)回收率，并比較兩者間的差異。

微透析方法中，對采集的透析液濃度進行校正、得到腦間質液中藥物的真實濃度是實驗的關鍵環(huán)節(jié)。目前探針回收率的測定有多種方法，可分為體內(nèi)和體外兩類方法。本研究根據(jù)給藥后大鼠腦透析液中藥物濃度范圍及對兩種探針回收率的預估，分別選擇3個濃度對探針進行體內(nèi)和體外考察。

影響探針回收率的因素較多，除了受灌流液流速的影響外，還與藥物透過探針的曲折度有關，藥物透過越曲折，其透過探針的量越少，回收率越低。因此，考察體內(nèi)回收率時由于探針處于腦組織中，理論上其回收率應較體外回收率低。然而，本研究發(fā)現(xiàn)探針對Rg1的體外回收率較低，而體內(nèi)回收率明顯高于體外回收率，分析原因可能為：藥物透過濃度較高的探針至組織中后，會受組織中微脈管運輸及代謝的作用繼續(xù)向周圍擴散，且藥物代謝速率及微脈管轉運速率越快，藥物擴散速率越快，與探針內(nèi)濃度差越大，從而促進藥物繼續(xù)透過探針進入組織內(nèi)［13］，而體外不存在該作用。此外，探針所處環(huán)境溫度也與其回收率有關，溫度越高，回收率越大，因此體內(nèi)較高的溫度有利于提高探針回收率。綜上所述，以上原因可能導致體外回收率較體內(nèi)回收率低。

由于體內(nèi)回收率的實驗過程更接近在體透析過程，更適于藥代動力學研究。本實驗證明了Rg1的體外回收率與體內(nèi)回收率差異有顯著性，在今后校正腦透析液中Rg1濃度時，將采用體內(nèi)回收率的實驗結果。同時本實驗發(fā)現(xiàn)探針對Rg1的體內(nèi)回收率在9 h內(nèi)較穩(wěn)定，因此，在考察腦內(nèi)Rg1濃度時，可直接采取各時間點回收率的平均值進行校正，而不需對每個時間點采用不同的回收率分別進行校正。

綜上所述，本實驗建立了靈敏度高、準確性好的LC-MS/MS方法，用于測定透析液中Rg1濃度，基于該方法我們考察并比較了探針體外回收率以及大鼠體內(nèi)回收率間的差異。因此，本實驗的研究可為今后準確測定給藥后各腦區(qū)中透析液中Rg1濃度，并通過回收率校正得到腦內(nèi)真實濃度奠定基礎，具有一定的研究意義。

（致謝：本課題是在衛(wèi)生部北京醫(yī)院臨床藥理室完成的，感謝史愛欣主任為本課題提供的實驗平臺以及對所遇到困難的耐心解答，同時感謝李可欣、薛薇等老師對本實驗的幫助與大力支持。）

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Determination of ginsenoside Rg1 in intracerebral dialysate by LC-MS/MS and comparison of in vivo and in vitro recovery of microdialysis probe

LIU Yang，XUE Wei，LI Min，QI Wen-yuan，GAO Yan，HU Xin，LI Ke-xin
（Dept of Pharmacy，Beijing Hospital，Beijing100730，China）

AimTo establish a LC-MS/MS method to measure the concentration of ginsenoside Rg1 in intracerebral dialysate and compare the probe recovery in vitro and in vivo.MethodsThe assay was conducted with a ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）.The mobile phase consisted of methanol and ultrapure water and it was detected by gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min-1.Specificity，linear range，precision and accuracy，stability were evaluated to investigate the reliability of the method.The recovery of ginsenoside Rg1 in probe in vitro and in vivo was compared.ResultsThe retention time of ginsenoside Rg1 was 1.91 min，the linear range was 0.1～50 μg ·L-1，intra-day and inter-day precisions were less than 15%.The recovery of ginsenoside Rg1 was （4.05±0.28）%in vitro and（26.96±4.45）%in vivo.ConclusionThe LC-MS/MS method is accurate，sensitive，and reproducible for quantitative determination of ginsenoside Rg1 in microdialysate.The probe recovery of ginsenoside Rg1 in vivo is higher than in vitro，and both are stable in different concentrations.

LC-MS/MS；ginsenoside Rg1；microdialysis；probe recovery；in vitro；in vivo

◇復方藥物藥理學◇

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.025

A

1001-1978（2016）05-0722-05中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.81；R944.1

2015-12-22，

2016-01-26

國家自然科學基金資助項目（No 81303250）

劉楊（1990-），女，碩士，研究方向：神經(jīng)藥理學，E-mail：liuyang90421@163.com；李可欣（1962-），女，主任藥師，研究方向：神經(jīng)藥理學，通訊作者，E-mail：kexinli6202@163.com