散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)PGF2α誘發(fā)小鼠子宮平滑肌細(xì)胞收縮的抑制作用探討

劉莉娜，呂耀中，孫　蘭，周　軍，王振中，蕭　偉（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港　222001）

散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)PGF2α誘發(fā)小鼠子宮平滑肌細(xì)胞收縮的抑制作用探討

劉莉娜1，2，呂耀中1，2，孫蘭1，2，周軍1，2，王振中1，2，蕭偉1，2
（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港222001）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.054.html

目的研究散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)前列腺素F2α致原代小鼠子宮平滑肌細(xì)胞收縮變化的影響，初步探討其對(duì)痛經(jīng)的治療作用。原代培養(yǎng)小鼠子宮平滑肌細(xì)胞并進(jìn)行純度鑒定，給藥后監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)鈣離子變化，染色法觀察細(xì)胞收縮的情況，免疫熒光法測(cè)定細(xì)胞鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）、肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）、磷酸化的肌球蛋白輕鏈2（phosphorylation of myosin light chain 2，p-MLC20）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫熒光染色呈強(qiáng)陽性。與PGF2α組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組的鈣離子熒光值明顯降低（P≤0.05）；細(xì)胞面積明顯增加（P≤0.01）；CaM的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P≤0.05）；MLCK的蛋白水平有下調(diào)趨勢(shì)；p-MLC20的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P≤0.01）。結(jié)論散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊能治療痛經(jīng)，可能與其能抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，緩解細(xì)胞的收縮，降低CaM，p-MLC20的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

原代小鼠子宮平滑肌細(xì)胞；鈣離子；細(xì)胞收縮；前列腺素F2α；CaM；p-MLC20

痛經(jīng)是目前婦科最常見的疾病，嚴(yán)重影響了婦女的正常工作和生活質(zhì)量。研究表明，痛經(jīng)與PGF2α的水平直接相關(guān)［1］，臨床多用非甾體抗炎藥來治療痛經(jīng)，但是在肝、腎、消化系統(tǒng)方面往往出現(xiàn)副作用。因此，用中藥治療痛經(jīng)是一個(gè)不錯(cuò)的選擇［2］。

散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組成為龍血竭、三七、浙貝母、薏苡仁，具有軟堅(jiān)散結(jié)，化瘀定痛的功效。本實(shí)驗(yàn)利用原代培養(yǎng)的小鼠子宮平滑肌細(xì)胞，建立PGF2α致其收縮模型來考察散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)原代小鼠子宮平滑肌細(xì)胞收縮的變化影響，為探討其治療痛經(jīng)的機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器與設(shè)備超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰，SW-CJ-2F型），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo scientific 3100），倒置顯微鏡（OLYPUS，CKX41SF），黑色底透96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Costar），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Costar），移液槍（Eppendorf），高壓蒸汽滅菌鍋（BXM-30R立式壓力蒸氣滅菌鍋），離心機(jī)（北京眾益中和生物技術(shù)有限公司，LD4-2A），細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀（Invitrogen，c1028），倒置熒光顯微鏡（DMI4000B），高內(nèi)涵檢測(cè)儀（ArrayScanⅦ），F(xiàn)lexstation?3鈣流工作站（MD）。

1.2材料與試劑DMEM/F12培養(yǎng)基、膠原酶Ⅱ（Gibco），胎牛血清（Hyclone），胰蛋白酶、EDTA、多聚甲醛（AMRESCO），青霉素/鏈霉素混合液（Biotopped），平滑肌肌動(dòng)蛋白（anti-α-actin）、CaM、MLCK（Abcam），p-MLC20、Alexa Fluor?488 Conjugate、DRAQ5?（CST），羊血清（武漢柏世德），Hoechst 33258、前列腺素 F2α（Sigma），Calcium 6-QF Assay Kit（MD），苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司），Triton X-100（生工生物），HCS CellMask Deep Red stain（life）。

1.3動(dòng)物♀ICR小鼠，7～8周齡，購于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，SCXK（蘇）2012-0004。

2　方法

2.1樣品的制備用DMSO溶解，配制成濃度為12.5 g·L-1的母液。

2.2小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定［3-4］

ICR♀小鼠注射苯甲酸雌二醇注射液2 d（每只注射0.1 mg）。ICR♀小鼠脫頸處死，75%酒精消毒，取出子宮置于新添入雙抗的PBS中。剝離脂肪、結(jié)締組織，縱向剪開子宮，手術(shù)刀輕輕刮除子宮內(nèi)膜，PBS沖洗1～2遍。棄去緩沖液，眼科剪將肌條剪成1～2 mm3碎糜，加入2 mL 0.025 g·L-1的膠原酶Ⅱ轉(zhuǎn)移入錐形瓶，5 mL膠原酶Ⅱ清洗剪刀。移錐形瓶于37℃水浴鍋消化1 h，隔0.5 h巴氏吸管吹打5 min。等體積含15%血清的完全培養(yǎng)基停止消化，200目細(xì)胞篩過濾，濾液1 000 r·min-1×10 min離心，棄上清，完全培養(yǎng)基混懸細(xì)胞，接種入25 cm2細(xì)胞瓶培養(yǎng)。

隔2 d，PBS清洗2遍，棄去死細(xì)胞和雜質(zhì)，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至d 5，棄上清，加入2 mL 0.025 g· L-1胰蛋白酶+0.002 g·L-1EDTA消化5 min，等體積完全培養(yǎng)基停止消化，1 000 r·min-1×3 min離心，棄上清，加入完全培養(yǎng)基，混懸細(xì)胞，接種于96孔板。于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。棄上清，PBS洗1遍，0.4 g·L-1多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，用封閉液5%山羊血清/0.3% Triton X-100封閉1 h。加入平滑肌肌動(dòng)蛋白（antiα-actin）一抗（1∶300），4℃過夜。次日平衡至室溫，Alexa Fluor?488 Conjugate（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，Hoechst 33258（2 μg·L-1）復(fù)染10 min，PBS清洗1遍，倒置熒光顯微鏡拍攝，以胞質(zhì)出現(xiàn)亮綠色為陽性結(jié)果，同時(shí)計(jì)算陽性百分率。陰性對(duì)照不加一抗，只加抗體稀釋液。鏡下劃分4個(gè)區(qū)域，數(shù)藍(lán)色細(xì)胞核，利用顯綠色的細(xì)胞總數(shù)%4個(gè)區(qū)域的染核細(xì)胞數(shù)，得到陽性百分率。

2.3鈣離子檢測(cè)細(xì)胞傳代，以1×108·L-1密度種板于黑色96孔板，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。棄上清，加入100 μL Calcium 6-QF溶液，37℃孵育2 h。按需要分為空白組、模型組和給藥組?？瞻捉M和模型組加入50 μL的PBS，給藥組加入PBS配制的散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊溶液（終濃度為12.5 g·L-1）50 μL，作用15 min。Flexstation?3鈣流工作站檢測(cè)動(dòng)態(tài)鈣離子變化：儀器設(shè)置成運(yùn)行20 s后空白組加入50 μL PBS，其余各組加入PGF2α（終濃度為420 nmol·L-1）50 μL，測(cè)定100 s內(nèi)鈣離子的變化。

2.4細(xì)胞收縮檢測(cè)［5］細(xì)胞傳代，以3×107·L-1密度種板于黑色96孔板，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。按需要分為空白組、模型組和給藥組?？瞻捉M和模型組加入無血清培養(yǎng)基100 μL，給藥組加入無血清培養(yǎng)基配制的散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊溶液（終濃度為12.5 g·L-1）100 μL，作用1 h。棄上清，空白組加入無血清培養(yǎng)基100 μL，模型組和給藥組加入PGF2α（終濃度為420 nmol·L-1）100 μL作用1 h。棄上清，0.4 g·L-1多聚甲醛固定，室溫孵育15 min，棄上清，PBS洗板3次。加入0.1% Triton X-100溶液100 μL，室溫孵育15 min，棄上清，PBS洗板3次。加入100 μL HCS CellMask Deep Red stain，室溫孵育30 min，棄上清，PBS洗板3次，高內(nèi)涵儀器檢測(cè)成像。

2.5蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)細(xì)胞傳代，以4×107·L-1密度種板于黑色96孔板，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。按需要分為空白組、模型組和給藥組?？瞻捉M和模型組加入無血清培養(yǎng)基100 μL，給藥組加入無血清培養(yǎng)基配制的散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊溶液（終濃度為12.5 g·L-1）100 μL，作用1 h。棄上清，空白組加入無血清培養(yǎng)基100 μL，模型組和給藥組加入PGF2α（終濃度為420 nmol·L-1）100 μL作用1 h。棄上清，0.4 g·L-1多聚甲醛固定15 min，PBS洗5 min×3次，用封閉液5%山羊血清/ 0.3%Triton X-100封閉1 h。分別加入CaM、MLCK、p-MLC20（1∶200）一抗，4℃過夜。次日平衡至室溫，Alexa Fluor?488 Conjugate（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，DRAQ5?復(fù)染5 min，PBS洗板1遍，高內(nèi)涵儀器成像。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0軟件分析結(jié)果。組間數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析結(jié)果。

3　結(jié)果

3.1小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的鑒定為了鑒定小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的純度，用平滑肌細(xì)胞特異的肌動(dòng)蛋白進(jìn)行免疫熒光染色后，用Hoechst 33258復(fù)染。Fig 1染色結(jié)果表明：平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)，綠色熒光為陽性染色，主要分布在胞質(zhì)區(qū)域。細(xì)胞核在復(fù)染后呈藍(lán)色。數(shù)出細(xì)胞總數(shù)和免疫染色陽性細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，平滑肌細(xì)胞純度在99%以上。陰性對(duì)照未呈現(xiàn)綠色熒光。

Fig 1　Identification of mouse myometrial smooth muscle cells

3.2鈣離子檢測(cè)藥物作用15 min后，直接上機(jī)檢測(cè)鈣離子的熒光強(qiáng)度，穩(wěn)定20 s后，儀器直接加入相應(yīng)液體，空白組20 s后的曲線因體積變化，熒光值有所增加。模型組和藥物組20 s后曲線因體積變化先升高，又因加入PGF2α，曲線降低。藥物組預(yù)給藥后，曲線回升要高一些。Fig 2結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組差異有顯著性；與模型組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊（12.5 g·L-1）組差異有顯著性，能明顯抑制USMCs內(nèi)鈣離子的內(nèi)流（P≤0.05）。

3.3細(xì)胞收縮檢測(cè)預(yù)給藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊后進(jìn)行造模1 h，F(xiàn)ig 3結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞面積明顯縮?。慌c模型組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組明顯擴(kuò)張，能明顯抑制PGF2α引起的細(xì)胞收縮（P≤0.01）。

Fig 2　Inhibitory effects of SJZT capsule on［Ca2+］iinduced by prostaglandin F2α

3.4蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)免疫熒光結(jié)果顯示（Fig 4），與空白組比較，模型組蛋白明顯上調(diào)；與模型組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組明顯下調(diào)，能明顯降低CaM、p-MLC20的蛋白表達(dá)水平（P≤0.05，P≤0.01），MLCK的表達(dá)有降低趨勢(shì)，差異無顯著性。

4　討論

散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊臨床上用來治療原發(fā)性痛經(jīng)、子宮肌瘤、慢性盆腔炎包塊、子宮內(nèi)膜異位癥等具有較好的療效，能明顯抑制PGF2α的含量［6-7］。平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子主要儲(chǔ)存在肌漿網(wǎng)［8］，作為在細(xì)胞收縮中起重要作用的第二信使，刺激后可通過細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放和胞外的內(nèi)流，引起鈣離子濃度的升高。

Fig 3　Inhibitory effects of SJZT capsule on contraction induced by prostaglandin F2α

平滑肌的收縮是通過細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度來調(diào)節(jié)的［9］，我們擬從平滑肌收縮角度考察散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)原代小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的鈣離子變化影響，以期對(duì)其治療原發(fā)性痛經(jīng)等機(jī)制能有進(jìn)一步的闡述。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們簡(jiǎn)化了原代培養(yǎng)小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，得到的細(xì)胞純度較高。實(shí)驗(yàn)室觀察發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的細(xì)胞至完全融合需要5～7 d，此后每隔5 d傳代1次，目前已傳代到第11代。同時(shí)我們也做了細(xì)胞凍存，與不斷傳代的細(xì)胞相比，復(fù)蘇后的細(xì)胞活力明顯要差一點(diǎn)，但是傳代后不影響使用，這為后續(xù)篩選散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊的有效部位提供了保證。

高內(nèi)涵篩選技術(shù)在藥物研發(fā)的初篩、機(jī)制研究和安全性評(píng)價(jià)方面具有重要作用，能將藥物對(duì)活細(xì)胞的作用進(jìn)行圖像采集，通過軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10］。通過高內(nèi)涵儀器分析讀取染色后的細(xì)胞面積，我們可以快速觀察到給藥前后細(xì)胞整體的形態(tài)變化。

原代小鼠子宮平滑肌細(xì)胞同批次提取得到的蛋白不足以進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，故而采用高內(nèi)涵儀器進(jìn)行蛋白免疫熒光實(shí)驗(yàn)。當(dāng)平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，與CaM結(jié)合，激活MLCK激酶，激酶繼續(xù)催化MLC20發(fā)生磷酸化反應(yīng)，構(gòu)象改變，導(dǎo)致平滑肌收縮［11］。

Fig 4　Levels of CaM，MLCK，p-MLC20induced by prostaglandin F2α

實(shí)驗(yàn)中用PGF2α刺激原代小鼠子宮平滑肌細(xì)胞，引起了CaM、MLCK、p-MLC20水平的升高，給予散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊后，蛋白均有下調(diào)，說明其確實(shí)可以抑制細(xì)胞的收縮，可能具有緩解疼痛的作用。

［1］Harel Z.Dysmenorrhea in adolescents and young adults：from pathophysiology to pharmacological treatments and management strategies［J］.Exp Opin Pharm，2008，9（15）：2661-72.

［2］Hsu C S，Yang J K，Yang L L，et al.Effect of“Dang-Qui-Shao-Yao-San”a Chinese medicinal prescription for dysmenorrhea on uterus contractility in vitro［J］.Phytomedicin，2006，13（1-2）：94 -100.

［3］范晶晶.小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定［J］.淮坊學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24（12）：1121-3.

［3］Fan J J.Isolation culture and identification of mouse myometrial smooth muscle cell［J］.J Weifang Univ，2004，24（12）：1121-3.

［4］Uehata M，Ishizaki T，Satoh H，et al.Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension［J］.Nature，1997，389：990-4.

［5］Panchal R G，Kota K P，Spurgers K B，et al.Development of highcontent imaging assays for lethal viral pathogens［J］.J Biomol Screen，2010，15：755-65.

［6］Zou J，Guan Z，Zhang W Y，et al.Beneficial effects of the Chinese herbal medicine Sanjie Zhentong Capsule on experimental endometriosis in rats［J］.Chin J Nat Med，2013，11（6）：666-72.

［7］張迎春，程毓芝，王逸新，等.散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療子宮內(nèi)膜異位癥100例［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2004，23（5）：315-6.

［7］Zhang Y C，Cheng Y Z，Wang Y X，et al.Sanjie Zhentong capsule treating 100 cases of endometriosis［J］.Herald Med，2004，23 （5）：315-6.

［8］魏敏杰，郭科軍，叢華，等.氯化氨甲酰膽堿對(duì)人子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1999，15（3）：229-32.

［8］Wei M J，Guo K J，Cong H，et al.Experimental study of carbachol induced IP3 and［Ca2+］iincrease in cervix myometrium cells of human［J］.Chin Pharmacol Bull，1999，15（3）：229-32.

［9］Xiao D，Huang X L，Pearce W.Regulation of baseline Ca2+sensitivity in permeabilized uterine arteries：effect of pregnancy［J］.Am J Physiol，2006，291：413-20.

［10］Mouchet E H，Simpson P B.High-content assays in oncology drug discovery：opportunities and challenges［J］.Drugs，2008，11（6）：422-7.

［11］Aguilar H N，Mitchell B F.Physiological pathways and molecular mechanisms regulating uterine contractility［J］.Hum Reprod Update，2010，16（6）：725-44.

Inhibitory effects of Sanjie Zhentong capsule on primary mouse myometrial cells contraction induced by prostaglandin F2α

LIU Li-na1，2，LYU Yao-zhong1，2，SUN Lan1，2，ZHOU Jun1，2，WANG Zhen-zhong1，2，XIAO Wei1，2
（1.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.，Ltd.，2.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process，Lianyungang，Jiangsu222001，China）

AimTo investigate the effects of Sanjie Zhentong capsule on cultured mouse myometrial cell contraction induced by prostaglandin F2α（PGF2α），and to elucidate the mechanism of Sanjie Zhentong capsule in treating dysmenorrheal.MethodsPrimary mouse myometrial cells were cultured and identified.Intracellular calcium（［Ca2+］i）was monitored under a Flex-Station 3 Benchtop Multi-Modo Microplate Reader using Calcium 6-QF.Myometrial cells were labeled to observe the changes of contraction.The expressions of calmodulin（CaM），myosin light chain kinase（MLCK），myosin light chain phosphorylation（p-MLC20）in mouse uterine smooth muscle cells（USMCs）were de-termined by immunofluorescence.ResultsSanjie Zhentong capsule suppressed the intracellular［Ca2+］iinflow and reduced the areas of myometrial cells induced by PGF2α.Then it significantly decreased CaM and p-MLC20levels.ConclusionOur results indicate that Sanjie Zhentong capsule has inhibitory effect on dysmenorrheal induced by PGF2α.Furthermore，its major mechanism may be related with the regulation of intracellular［Ca2+］iinflow and the levels of CaM and p-MLC20.

primary mouse smooth muscle cells；intracellular calcium；contraction；PGF2α；CaM；p-MLC20

◇研究簡(jiǎn)報(bào)◇

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.027

A

1001-1978（2016）05-0732-05中國圖書分類號(hào)：R-332；R282.71；R322.65；R322.74；R329. 24；R711.510.531

2016-01-04，

2016-02-10

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No 2011ZX09201-201-20）

劉莉娜（1984-），女，碩士，工程師，研究方向：藥理毒理學(xué)，Tel：0518-81152335，E-mail：slina126305@126.com；蕭偉（1959-），男，博士，高級(jí)工程師，研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)，Tel：0518-81152337，E-mail：kanionlunwen@163.com