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    甘草查爾酮A抑制ERK1/2/NF-κB途徑減輕吸煙誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

    2016-09-10 08:39:26任倩倩汪麗佩謝強敏張水娟浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院浙江杭州005浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院浙江杭州005浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院浙江杭州0006浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室浙江杭州0058
    中國藥理學(xué)通報 2016年5期
    關(guān)鍵詞:香煙煙霧肺泡

    任倩倩,汪麗佩,趙 煒,陸 紅,謝強敏,張水娟(.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州 005;.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,浙江杭州 005;.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江杭州0006;.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室,浙江杭州 0058)

    甘草查爾酮A抑制ERK1/2/NF-κB途徑減輕吸煙誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

    任倩倩1,汪麗佩2,趙煒3,陸紅1,謝強敏4,張水娟1
    (1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,浙江杭州310053;
    3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江杭州310006;4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室,浙江杭州310058)

    網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-4-26 11:06網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.022.html

    目的探討甘草查爾酮A(LA)對吸煙誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護作用及相關(guān)機制。方法整體實驗:香煙煙霧暴露構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型,取肺泡灌洗液(BALF)進行白細胞計數(shù),測定肺內(nèi)角質(zhì)形成細胞衍生趨化因子(KC)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的mRNA和蛋白表達水平,用試劑盒測定肺組織中過氧化物髓化酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及谷胱甘肽(GSH)水平。肺組織病理切片進行HE染色。離體實驗:香煙煙霧提取物(CSE)誘導(dǎo)上皮細胞損傷,測定細胞內(nèi)白介素-8(IL-8)、MMP-9 mRNA的表達。Western blot分析細胞外信號調(diào)節(jié)激酶l/2(ERK1/2)、p38分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的活性。結(jié)果整體實驗顯示LA組肺內(nèi)炎癥細胞數(shù)量及浸潤程度均明顯低于模型組。模型組肺內(nèi)KC、TNF-α、IL-1β、MMP-9 mRNA和蛋白表達較正常對照組均明顯升高,經(jīng)LA處理后,上述指標相比模型組明顯降低。與正常對照組相比,模型組肺內(nèi)MPO活性明顯上升,而SOD活性和GSH水平明顯下降。LA能逆轉(zhuǎn)這種變化,明顯降低MPO活性,升高SOD活性和GSH水平。離體實驗顯示,LA(2.5、5 μmol·L-1)能明顯降低CSE刺激的細胞內(nèi)IL-8和MMP-9 mRNA的高表達。CSE可以誘導(dǎo)細胞ERK1/2磷酸化和胞核內(nèi)NF-κB p65的表達,經(jīng)LA預(yù)處理后,上述指標可明顯抑制。結(jié)論LA可能通過阻斷ERK1/ 2/NF-κB途徑來抑制炎癥介質(zhì)的高表達、調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡、下調(diào)金屬蛋白酶,從而發(fā)揮對急性肺損傷小鼠的保護作用。

    甘草;甘草查爾酮A;肺損傷;吸煙;肺上皮細胞;細胞因子;信號通路

    慢性阻塞性肺部疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases,COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病,它與肺部對有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。COPD目前已成為影響人類生活質(zhì)量的全球性健康問題,發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢,迄今尚無藥物能遏制COPD病情的進行性發(fā)展,因此迫切需要發(fā)展新的COPD治療方法。從中藥和植物藥中尋找新的有效成分,或從已有的有效成分中發(fā)現(xiàn)新的藥理作用是一個重要方向。盡管COPD發(fā)病機制尚未完全闡明,但目前普遍認為,吸煙是COPD發(fā)生的最主要因素之一[2],吸煙能誘導(dǎo)炎癥并直接導(dǎo)致肺組織的損傷[3]。COPD的病理生理除小氣道的炎癥外,氧化與抗氧化失衡也是一個很重要的因素[4]。因此,從中藥中尋找抗炎和抗氧化的治療COPD的新藥是一個值得探索的途徑。甘草是中藥中傳統(tǒng)的鎮(zhèn)咳祛痰藥,入藥歷史悠久,性味甘平,歸脾、胃、心、肺經(jīng),具有益氣補中、潤肺止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿和氨基酸等活性成分[5]。甘草中提取的黃酮單體甘草查爾酮 A (LA)經(jīng)研究表明具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用,能通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,誘導(dǎo)人胃癌細胞的凋亡[6-8]。目前LA對肺損傷的研究也有報道,研究發(fā)現(xiàn)其能抑制細菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)氣道滴入引起的小鼠急性肺損傷,降低肺內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)表達。進一步的研究發(fā)現(xiàn),LA主要是通過NF-κB和p38/ERK MAPK信號途徑起作用[9-10],但LA與香煙煙霧所引起的疾病之間的關(guān)系研究,無論是整體上還是離體上均未見到相關(guān)的報道。為此,本研究采用香煙煙霧誘導(dǎo)建立小鼠急性肺損傷模型,同時用香煙煙霧提取物(CSE)誘導(dǎo)肺上皮細胞損傷,觀察LA對肺損傷病理改變、炎癥因子、氧化/抗氧化水平、MAPK信號途徑和胞核內(nèi)NF-κB p65表達的影響,探索LA對香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護作用及其相關(guān)機制。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物與藥品C57BL/6清潔級小鼠,♀,體質(zhì)量(20±2)g,由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供,實驗動物質(zhì)量合格證:SCXK(滬)2012-0002,飼養(yǎng)于浙江大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房。人肺上皮細胞BEAS-2B細胞株,購自美國菌種保藏中心(ATCC)細胞庫。LA委托沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院趙余慶教授課題組提取和純化,純度>98%。3R4F標準香煙購自美國肯塔基大學(xué)煙草研究所(批號200712)。RT-PCR相關(guān)試劑購自日本TaKaRa公司。ELISA試劑盒購于eBioscience公司。過氧化物髓化酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司。ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p38、JNK、p-JNK、NF-κB p65抗體購于Cell Signaling公司。

    1.2模型制備與分組給藥整體實驗中,將60只♀C57BL/6清潔級小鼠隨機分為正常對照組、模型組、LA低、中、高劑量組(10、20、40 mg·kg-1)、地塞米松對照組(Dex,1 mg·kg-1)。依據(jù)我們以前報道的方法,建立香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型[11]。香煙煙霧連續(xù)暴露4 d,正常對照組使用空氣進行暴露。各組小鼠預(yù)給藥2 d,每天給藥1次,而后在連續(xù)4 d的煙霧暴露前1 h灌胃給予藥物。末次香煙煙霧暴露結(jié)束后18h處理動物。

    在離體實驗中,依據(jù)我們以前報道的方法制作CSE,用CSE刺激人肺上皮細胞(BEAS-2B),誘導(dǎo)上皮細胞損傷[12]。采用不同濃度的 LA(1、2.5、5 μmol·L-1)預(yù)處理1 h,而后加入2.5%CSE誘導(dǎo)上皮細胞損傷,48 h后提取細胞RNA進行細胞因子測定;2.5%CSE誘導(dǎo)30min后提取細胞蛋白進行信號通路研究。

    1.3小鼠肺泡灌洗液(BALF)制備和炎癥細胞計數(shù)末次香煙煙霧暴露結(jié)束后18 h,腹腔注射6 g· kg-1烏拉坦處死各組小鼠。分離小鼠氣道,插管,結(jié)扎左肺,進行肺泡灌洗,取50 μL肺泡灌洗液,加同體積白細胞計數(shù)液,100倍光鏡下進行白細胞計數(shù);其余肺泡灌洗液4℃ 2 000 r·min-1離心10min,沉淀做細胞涂片,室溫干燥后瑞氏-吉姆薩染色,400倍光鏡下依據(jù)形態(tài)學(xué)標準進行細胞分類計數(shù)。

    1.4肺組織病理學(xué)觀察按照我們以前報道的方法[11-12],將肺組織福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色,200倍鏡下檢查肺組織炎癥細胞浸潤程度。

    1.5ELISA取小鼠肺泡灌洗液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書,分別檢測灌洗液中角質(zhì)形成細胞衍生趨化因子(KC)、TNF-α、IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)蛋白含量。

    1.6MPO、SOD和GSH水平測定取肺組織,制成5%肺勻漿,按試劑盒說明書分別測定上清液中MPO、SOD活力以及GSH的水平。

    1.7熒光實時定量PCR測定KC、TNF-α、IL-1β、MMP-9和白介素-8(IL-8)mRNA表達水平用TRIzol試劑提取小鼠肺組織及細胞樣本中總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,詳見Tab 1。用cDNA模板對相關(guān)基因分別進行PCR擴增,擴增條件:95℃ 預(yù)變性2 min,95℃變性10 s,退火58℃10 s,72℃延伸30 s,共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照,采用ΔΔCt值法測定基因表達水平。

    Tab 1 Primer sequences used in the present study

    1.8Western blot將處于對數(shù)生長期的BEAS-2B細胞接種至6孔板中,相應(yīng)處理后,棄培養(yǎng)液,提取細胞蛋白。制備SDS-PAGE凝膠,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h,取出硝酸纖維素膜,放入兔抗ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p38、JNK、p-JNK、NF-κB p65一抗液中,4℃過夜。次日洗膜后加入熒光二抗,室溫避光搖動2 h,用Odyssey熒光掃描儀,拍攝條帶,采用Quantity one軟件計算灰度值。

    1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS(20.0版)統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析,實驗數(shù)據(jù)以±s表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較多組均數(shù)以及SNK檢驗進行兩兩之間的比較。

    2 結(jié)果

    2.1LA對肺部炎癥細胞的影響對吸煙小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞進行總數(shù)和分類計數(shù),如Fig 1所示,與正常對照組小鼠相比,模型組小鼠BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數(shù)均有明顯增加(P<0.01)。LA能明顯抑制吸煙誘導(dǎo)小鼠BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞的增加,呈明顯的量效關(guān)系。LA 40 mg·kg-1組對淋巴細胞和巨噬細胞的增加亦有明顯抑制作用。小鼠肺組織HE染色后發(fā)現(xiàn),香煙煙霧暴露的小鼠肺組織中性粒細胞和巨噬細胞浸潤增加,而LA能明顯抑制吸煙小鼠中性粒細胞和巨噬細胞在肺部的浸潤,見Fig 2。

    2.2LA對肺內(nèi)細胞因子的影響為了探討LA是否通過抑制炎癥反應(yīng)而保護小鼠急性肺損傷,應(yīng)用熒光實時定量PCR檢測各組小鼠肺組織細胞因子mRNA表達及ELISA法檢測BALF中蛋白水平。結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組小鼠肺組織中KC、TNF-α、IL-1β和 MMP-9 mRNA的表達(Fig 3)及BALF中蛋白含量(Fig 4)均明顯升高。與模型組相比,LA 20、40 mg·kg-1組上述指標均明顯降低。

    2.3LA的抗氧化效應(yīng)為了探討LA是否通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)而保護吸煙誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠,用試劑盒測定各組小鼠肺組織中MPO、SOD和GSH的水平。結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組小鼠肺組織中MPO水平明顯上升(P<0.01),SOD和GSH水平明顯下降(P<0.05~0.01)。LA能逆轉(zhuǎn)這種變化,明顯降低MPO水平,升高SOD和GSH水平,見Fig 5。 Fig 1LA inhibits inflammatory cell accumulation in BALF of cigarette smoke-exposed mice(±s,n=10)

    A:Total leukocyte cell counts;B:Differential cell counts.##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.Licochalcone A(LA);Dexamethasone(Dex)

    Fig 2 LA inhibits inflammatory cells’infiltration in lungs of cigarette smoke-exposed mice(HE,×200)

    Fig 3 LA inhibits expression of cytokines mRNA in lung tissues of cigarette smoke-exposed mice(±s,n=10)

    2.4LA抑制CSE刺激BEAS-2B細胞表達IL-8 和MMP-9 mRNA利用熒光實時定量PCR檢測各組細胞中IL-8和MMP-9 mRNA的表達。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,2.5%CSE刺激細胞48 h后,IL-8和MMP-9 mRNA的表達明顯上升(P<0.01),而2.5、5 μmol·L-1的LA能明顯抑制兩者的上升(P<0.05~0.01)。不加CSE刺激,只單獨給予5 μmol·L-1LA的細胞,IL-8和MMP-9 mRNA的表達與空白對照組細胞(不加CSE,不加藥物)相當,無明顯變化,見Fig 6。

    2.5LA對CSE刺激BEAS-2B細胞信號通路活化的影響通過Western blot方法檢測BEAS-2B細胞p38、JNK和ERK1/2磷酸化表達,探索LA治療小鼠急性肺損傷的作用機制。如Fig 7所示,CSE可以誘導(dǎo)p38、JNK和ERK1/2的磷酸化,而LA能劑量依賴性抑制由CSE誘導(dǎo)的肺上皮細胞ERK1/2磷酸化(Fig 7C),但對p38(Fig 7A)和JNK(Fig 7B)磷酸化無明顯抑制作用。采用核質(zhì)分離的方法檢測細胞核內(nèi)NF-κB亞基p65的表達,以進一步探索LA治療小鼠急性肺損傷的作用機制。如Fig 7D所示,2.5%CSE能明顯誘導(dǎo)p65的表達,LA可明顯抑制其表達。

    3 討論

    COPD以遍及氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征。吸煙是誘發(fā)COPD的主要因素之一,香煙煙霧中含有數(shù)以萬計的有毒有害物質(zhì),這些有毒化合物一旦進入肺部,就難以代謝排出,從而誘導(dǎo)炎癥并直接導(dǎo)致肺組織的損傷[13]。本研究重點觀察LA對吸煙誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用及作用機制。

    Fig 4 LA inhibits expression of cytokines protein in BALF of cigarette smoke-exposed mice(±s,n=10)

    COPD的氣道炎癥不同于哮喘,其炎癥細胞主要為中性粒細胞、CD8+T淋巴細胞和巨噬細胞,肺損傷后炎癥細胞的浸潤、活化導(dǎo)致促炎細胞因子的異常表達,與COPD的病理生理過程密切相關(guān)。KC是人IL-8的同源物,通過其受體CXCR2產(chǎn)生作用,是肺中性粒細胞趨化的重要介質(zhì)。有研究顯示,通過小分子抑制劑抑制CXCR2受體,能明顯抑制吸煙誘導(dǎo)動物模型中肺中性粒細胞炎癥[14]。前炎細胞因子,如TNF-α和IL-1β,能增強炎癥反應(yīng)。吸煙可介導(dǎo)COPD患者全身性炎癥反應(yīng),與非吸煙者相比,吸煙的COPD患者血清中TNF-α表達明顯升高[15]。最近,IL-1β因其參與炎癥反應(yīng)的長期持續(xù)過程而廣受關(guān)注[16]。IL-1β能明顯激活COPD患者體內(nèi)的巨噬細胞,釋放炎癥細胞因子、趨化因子和MMP-9[17]。本研究中,香煙暴露4 d后,小鼠肺部炎癥細胞(中性粒細胞和巨噬細胞)大量聚集,肺泡灌洗液和肺組織中炎癥因子KC、TNF-α及IL-1β的蛋白和mRNA水平明顯上升。LA能有效抑制這些炎癥細胞的聚集和炎癥因子的釋放,提示其對肺損傷的保護作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

    體內(nèi)氧化/抗氧化平衡失調(diào)是COPD慢性損傷的重要原因。人們發(fā)現(xiàn),無論在急性發(fā)作期還是在緩解期均存在兩者作用失調(diào)。煙草中含有大量的氧化劑,刺激炎癥細胞生成內(nèi)源性氧化物,減少抗氧化物生成,促進氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD和GSH是氣道內(nèi)的抗氧化物質(zhì),研究表明香煙煙霧可以降低內(nèi)源性抗氧化物的活性。如在人支氣管肺泡上皮細胞實驗中,發(fā)現(xiàn)香煙提取物能降低GSH的含量[18],而另一項臨床研究發(fā)現(xiàn),吸煙者血漿中 SOD的活性下降[19]。研究顯示,LA能抑制由叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng),降低氧基自由基離子(ROS)水平,減少GSH的消耗[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn),LA不僅能夠抑制炎癥因子的釋放,而且能夠有效降低MPO活性,同時升高SOD活性和GSH水平。我們的結(jié)果表明,在香煙誘導(dǎo)的小鼠模型中,LA對肺損傷的保護作用可能與調(diào)節(jié)氧化和抗氧化的平衡有關(guān)。

    正常人體的氣道、肺泡內(nèi)蛋白酶和抗蛋白酶處于平衡狀態(tài),這種平衡的失調(diào),會導(dǎo)致肺實質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞和纖維化。目前認為肺泡損傷和小氣道纖維化是COPD氣流受限的重要原因[21]?;|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組鋅離子依賴性蛋白水解酶家族,能降解細胞外基質(zhì)蛋白。MMP-9是該家族最重要的成員之一,在纖維化修復(fù)過程中,它是參與細胞外基質(zhì)成分降解的關(guān)鍵酶[22]。研究顯示,在香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥模型中,MMP-9表達明顯上升[23],另有研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的MMP-9表達較正常人高[24]。本實驗結(jié)果顯示,香煙暴露后,小鼠肺泡灌洗液內(nèi)MMP-9蛋白表達增加,而LA能夠明顯抑制這種蛋白的表達。MMP-9 mRNA的表達變化和其蛋白一致,在整體和離體實驗中,LA均能明顯抑制MMP-9 mRNA的高表達。我們推測LA對香煙誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護作用可能與下調(diào)蛋白酶有關(guān)。

    Fig 5 LA inhibits oxidative stress in lung tissues of cigarette smoke-exposed mice(±s,n=10)

    ?Fig 6 LA suppresses CSE-induced mRNA expression of cytokines in BEAS-2B cells(±s,n=6)

    肺上皮屏障是肺抵抗外界環(huán)境的第一道防御系統(tǒng),在這個屏障里,肺上皮細胞起很重要的防御作用。為進一步探索LA對急性肺損傷的保護作用和作用機制,我們用人肺上皮細胞株BEAS-2B進行了相關(guān)研究。目前的研究[25]和我們的實驗均顯示,在香煙煙霧刺激的人肺上皮細胞中,IL-8表達量的升高幅度比其他炎癥因子高。炎癥細胞的遷移和激活受到細胞因子和趨化因子的調(diào)節(jié),IL-8又稱CXCL8,是中性粒細胞趨化因子,在COPD發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[26]。Schneider等[27]的研究顯示,COPD患者氣道上皮細胞中 IL-8表達明顯升高。IL-8通過其受體CXCR2發(fā)揮作用,用CXCR2拮抗劑可明顯減輕中性粒細胞炎癥和肺泡損傷。本研究中,2.5%CSE刺激細胞48 h后,IL-8 mRNA的表達明顯上升,而LA能明顯抑制其高表達,進一步證明了LA對肺損傷中炎癥反應(yīng)的抑制作用。

    Fig 7 Effects of LA on CSE-induced protein expression of MAP kinases and NF-κB in BEAS-2B cells(±s,n=6)

    MAPK家族包括ERK(extracellular signal-regulated kinase)、p38和JNK(c-Jun NH2-terminal kinase),這些通路調(diào)節(jié)細胞的多種生理病理過程,如細胞增殖、分化、遷移、存活和死亡等。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是內(nèi)皮激活過程中重要的調(diào)節(jié)因子,與許多炎癥因子的表達相關(guān),包括細胞因子和黏附分子NO、TNF-α、MCP-1和CAMs[28-29]。在細胞核內(nèi),NF-κB以p65/ p50二聚體形式存在,NF-κB的激活過程首先是與IκBα解離,然后p65亞基入核,介導(dǎo)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性[30]。研究報道,CSE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與MAPK信號通路的激活密切相關(guān),阻斷MAPK通路的激活能保護上皮細胞,減輕炎癥反應(yīng)、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[31-32]。Chu等[9]的研究證明LA能通過p38/ERK MAPK信號通路緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的炎癥反應(yīng),F(xiàn)urusawa等[10]還發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。我們猜測LA調(diào)節(jié)CSE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與MAPK途徑中的多條信號通路及NF-κB的核轉(zhuǎn)錄有關(guān)。為了驗證這一推測,我們采用Western blot方法檢測BEAS-2B細胞中p38、JNK和ERK1/2的磷酸化表達以及NF-κB的活性。實驗結(jié)果表明,LA能明顯抑制CSE誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化,但對p38和JNK的磷酸化無明顯作用,同時LA也能有效阻斷細胞核內(nèi)NF-κB p65亞基的激活,提示LA發(fā)揮的抗炎作用可能是通過阻斷NF-κB p65的激活以及抑制CSE誘導(dǎo)的ERK1/2 MAPK的激活。

    綜上所述,LA對香煙煙霧誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護作用,這種保護作用可能與抑制炎癥介質(zhì)的高表達、調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡、下調(diào)金屬蛋白酶有關(guān),其調(diào)控機制可能與阻斷ERK1/2/NF-κB途徑有關(guān)。

    (致謝:本實驗在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室完成。感謝謝強敏教授和實驗室同學(xué)在本課題研究中給予的指導(dǎo)和幫助。感謝沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院趙余慶教授課題組提取和純化甘草查爾酮A。)

    [1]Vestbo J,Hurd S S,Agustí A G,et al.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease:GOLD executive summary[J].Am J Respir Crit Care Med,2013,187(4):347-65.

    [2]Barreiro E,Peinado V I,Galdiz J B,et al.Cigarette smoke-induced oxidative stress:a role in chronic obstructive pulmonary disease skeletal muscle dysfunction[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,182(4):477-88.

    [3]Crotty Alexander L E,Shin S,Hwang J H.Inflammatory diseases of the lung induced by conventional cigarette smoke:a review [J].Chest,2015,148(5):1307-22.

    [4]Matera M G,Calzetta L,Cazzola M.Oxidation pathway and exacerbations in COPD:the role of NAC[J].Expert Rev Respir Med,2016,10(1):89-97.

    [5]Zhang Q,Ye M.Chemical analysis of the Chinese herbal medicine Gan-Cao(licorice)[J].J Chromatogr A,2009,1216(11):1954-69.

    [6]Kühnl J,Roggenkamp D,Gehrke S A,et al.Licochalcone A activates Nrf2 in vitro and contributes to licorice extract-induced lowered cutaneous oxidative stress in vivo[J].Exp Dermatol,2015,24(1):42-7.

    [7]Hao W,Yuan X,Yu L,et al.Licochalcone A-induced human gastric cancer BGC-823 cells apoptosis by regulating ROS-mediated MAPKs and PI3K/AKT signaling pathways[J].Sci Rep,2015,5:10336.

    [8]王艷明,劉瑛,閻新燕,等.甘草查爾酮A抑制小鼠黑色素瘤B16F10細胞增殖機制研究[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(7):967-72.

    [8]Wang Y M,Liu Y,Yan X Y,et al.Inhibitory effects of Licochalcone A on proliferation of melanoma B16F10 cells[J].Chin Pharmacol Bull,2015,31(7):967-72.

    [9]Chu X,Ci X,Wei M,et al.Licochalcone A inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response in vitro and in vivo[J].J Agric Food Chem,2012,60(15):3947-54.

    [10]Furusawa J,F(xiàn)unakoshi-Tago M,Tago K,et al.Licochalcone A significantly suppresses LPS signaling pathway through the inhibition of NF-kappaB p65 phosphorylation at serine 276[J].Cell Signal,2009,21(5):778-85.

    [11]Shen L L,Liu Y N,Shen H J,et al.Inhalation of glycopyrronium inhibits cigarette smoke-induced acute lung inflammation in a murine model of COPD[J].Int Immunopharmacol,2014,18(2):358-64.

    [12]Li F F,Shen J,Shen H J,et al.Shp2 plays an important role in acute cigarette smoke-mediated lung inflammation[J].J Immunol,2012,189(6):3159-67.

    [13]Liao S X,Ding T,Rao X M,et al.Cigarette smoke affects dendritic cell maturation in the small airways of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Mol Med Rep,2015,11(1):219-25.

    [14]Thatcher T H,McHugh N A,Egan R W,et al.Role of CXCR2 in cigarette smoke-induced lung inflammation[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,289(2):L322-8.

    [15]Pelegrino N R,Tanni S E,Amaral R A,et al.Effects of active smoking on airway and systemic inflammation profiles in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Med Sci,2013,345(6):440-5.

    [16]Eltom S,Belvisi M G,Stevenson C S,et al.Role of the inflammasome-caspase1/11-IL-1/18 axis in cigarette smoke driven airway inflammation:an insight into the pathogenesis of COPD[J]. PLoS One,2014,9(11):e112829.

    [17]Culpitt S V,Rogers D F,Shah P,et al.Impaired inhibition by dexamethasone of cytokine release by alveolar macrophages from patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167(1):24-31.

    [18]Taylor M,Vella L,Carr T.Assessment of an in vitro model of lung epithelial cell stress responses[J].Free Radic Biol Med,2014,75(1):S51.

    [19]郭峰,況九龍.超氧化物歧化酶基因多態(tài)性及其活力與慢性阻塞性肺疾病的易感性研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(6):424-8.

    [19]Guo F,Kuang J L.Superoxide dismutase gene polymorphisms and functional activity in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Chin J Tuberc Respir Dis,2011,34(6):424-8.

    [20]Lv H,Ren H,Wang L,et al.Lico A enhances Nrf2-mediated defense mechanisms against t-BHP-induced oxidative stress and cell death via Akt and ERK activation in RAW 264.7 cells[J].Oxid Med Cell Longev,2015,2015:709845.

    [21]Fernandes D J,Bonacci J V,Stewart A G.Extracellular matrix,integrins,and mesenchymal cell function in the airways[J].Curr Drug Targets,2006,7(5):567-77.

    [22]Gueders M M,F(xiàn)oidart J M,Noel A,et al.Matrixmetalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of MMPs in the respiratory tract:potential implications in asthma and other lung diseases[J].Eur J Pharmacol,2006,533(1-3):133-44.

    [23]Nakamura M,Wada H,Honda K,et al.Clarithromycin ameliorates pulmonary inflammation induced by short term cigarette smoke exposure in mice[J].Pulm Pharmacol Ther,2015,35:60 -6.

    [24]Srivastava P K,Dastidar S G,Ray A.Chronic obstructive pulmonary disease:role of matrix metalloproteases and future challenges of drug therapy[J].Expert Opin Investig Drugs,2007,16(7):1069-78.

    [25]Lee K H,Lee C H,Jeong J,et al.Neutrophil elastase differentially regulates interleukin 8(IL-8)and vascular endothelial growth gactor(VEGF)production by cigarette smoke extract[J].J Biol Chem,2015,290(47):28438-45.

    [26]Larsson K.Inflammatory markers in COPD[J].Clin Respir J,2008,2(1):84-7.

    [27]Schneider D,Ganesan S,Comstock A T,et al.Increased cytokineresponse of rhinovirus-infected airway epithelial cells in chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,182(3):332-40.

    [28]Shin Y O,Park C H,Lee G H,et al.Heat-processed scutellariae radix enhances anti-inflammatory effect against lipopolysaccharideinduced acute lung injury in mice via NF-κB signaling[J].Evid Based Complement Alternat Med,2015,2015:456846.

    [29]劉丹丹,曹綱,張琦,等.三葉青黃酮經(jīng)p38MAPK和NF-κB途徑抑制老年小鼠急性肺損傷[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(12):1725-9.

    [29]Liu D D,Cao G,Zhang Q,et al.Inhibition effect of flavonoids from Radix tetrastigmae on acute lung injury of aged mice through p38MAPK and NF-κB pathawy[J].Chin Pharmacol Bull,2015, 31(12):1725-9.

    [30]Liu Y,Liu Y,Xu D,Li J.Latanoprost-induced cytokine and chemokine release from human tenon's capsule fibroblasts:role of MAPK and NF-κB signaling pathways[J].J Glaucoma,2015,24(9):635-41.

    [31]Bao M J,Shen J,Jia Y L,et al.Apple polyphenol protects against cigarette smoke-induced acute lung injury[J].Nutrition,2013,29(1):235-43.

    [32]Lin X X,Yang X F,Jiang J X,et al.Cigarette smoke extract-induced BEAS-2B cell apoptosis and anti-oxidative Nrf-2 up-regulation are mediated by ROS-stimulated p38 activation[J].Toxicol Mech Methods,2014,24(8):575-83.

    Licochalcone A protects against cigarette smoke-mediated acute lung injury in mice by suppressing ERK1/2/NF-κB pathways

    REN Qian-qian1,WANG Li-pei2,ZHAO Wei3,LU Hong1,XIE Qiang-min4,ZHANG Shui-juan1
    (1.College of Pharmaceutical Science,2.College of Basic Medical Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou310053,China;
    3.the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou310006,China;4.Zhejiang Respiratory Drugs Research Laboratory,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou310058,China)

    AimTo explore the protective roles of licochalcone A(LA)on mice with cigarette smoke-mediated acute lung injury and the related mechanisms. MethodsIn vivo:Mice were exposed to cigarette smoke(CS)to establish acute lung injury model.The bronchoalveolar lavage fluid(BALF)was conducted for cell counting.The mRNA and protein expression of keratinocyte-derived chemokine(KC),tumor necrosis factor alpha(TNF-α),interleukin 1β(IL-1β)and matrix metalloproteinases(MMP)-9 in lungs were determined.The myeloperoxidase(MPO),superoxide dismutase(SOD)activities and glutathione(GSH)levels in lungs were quantified.The paraffin sections of lungs were prepared and stained with HE.In vitro:Human lung epithelial cells(BEAS-2B)were exposed to cigarette smoke extract(CSE),which induced cell injury.The releases of interleukin 8(IL-8)and MMP-9 were assessed.The phosphorylation of mitogen-activated protein kinases(MAPKs,including ERK1/2,p38 and JNK)and nuclear factor-κB(NF-κB)p65 protein were analyzed by Western blot.ResultsIn vivo:The accumulation of inflammatory cells was lower in LA groups than that in model group.In comparison with normal control group,the mRNA and protein lev-els of KC,TNF-α,IL-1β and MMP-9 were significantly increased in model group.Following treatment with LA,the above indicators were significantly decreased as compared to model group.In the CS-exposed mice,the MPO activity in lungs was significantly increased,meanwhile the SOD activity and GSH level were significantly decreased compared with the air-exposed animals.CS-induced activity of MPO was significantly inhibited,which were accompanied by increases in SOD and GSH levels by LA.In vitro:CSE-induced mRNA levels of IL-8 and MMP-9 were significantly inhibited by LA at 2.5 and 5 μmol·L-1.The CSE-induced phosphorylation of ERK1/2 and nucleus NF-κB p65 protein expression were prevented by pretreatment with LA.ConclusionsLA has protective effects on CS-exposed acute lung injury in mice by preventing CS-induced pulmonary inflammation,oxidative stress and protease rise.The exploration of the mechanisms suggests that LA exerts protective effects via suppressing ERK1/2/NF-κB pathways.

    licorice;licochalcone A;lung injury;cigarette smoke;lung epithelial cell;cytokines;signal pathway

    2016-01-07,修回日期:2016-02-02

    浙江省教育廳科研項目(No Y201328230);浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目(No 2010ZY07)

    任倩倩(1989-),女,碩士生,研究方向:抗炎免疫藥理學(xué),E-mail:61324680@qq.com;張水娟(1980-),女,博士,實驗師,研究方向:抗炎免疫藥理學(xué),通訊作者,E-mail:zsjdxw@163.com

    10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.011

    A

    1001-1978(2016)05-0643-09

    R-332;R284.1;R163.1;R322.35;R563.902.5

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