乙酰木聚糖酯酶協(xié)同木聚糖酶降解木聚糖的研究

朱天地，何 瑤，楊 標(biāo)，劉加馳，鄔敏辰*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院 江蘇 無(wú)錫214122）

乙酰木聚糖酯酶協(xié)同木聚糖酶降解木聚糖的研究

朱天地1，何 瑤1，楊 標(biāo)2，劉加馳2，鄔敏辰*2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院 江蘇 無(wú)錫214122）

探討了宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）乙酰木聚糖酯酶和第10、11家族木聚糖酶之間的協(xié)同作用。利用作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏的3株工程酵母Pichia pastoris GS115/Auaxe、GS115/ Auxyn11A和GS115/Auxyn10A進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，分別獲得重組乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶。在木聚糖酶最適pH、40℃、料液質(zhì)量體積比1 g∶60mL、水解2 h的條件下分別研究了不同加酶量作用于小麥麩皮時(shí)生成的還原糖量。結(jié)果表明，乙酰木聚糖酯酶與第11家族木聚糖酶有更好的協(xié)同作用，并在添加量比（酶活力比）為5∶1時(shí)所測(cè)協(xié)同效果最好，還原糖生成量較木聚糖酶單獨(dú)作用增加了46%。因此，在乙酰木聚糖酯酶的作用下，木聚糖上乙酰基的去除，對(duì)提高木聚糖酶對(duì)木聚糖的水解效率具有重要作用。

乙酰木聚糖酯酶；木聚糖酶；協(xié)同作用；木聚糖

半纖維素是自然界中除纖維素以外最豐富的可再生生物資源，木聚糖是植物細(xì)胞壁中半纖維素的重要組成成分，約占植物細(xì)胞干重的15%-35%［1］。木聚糖是連接木質(zhì)素和纖維素的“橋梁”。在果膠等物質(zhì)的參與下，木聚糖的側(cè)鏈基團(tuán)和木質(zhì)素以化學(xué)鍵相互連接，并與纖維素結(jié)合，形成致密的結(jié)構(gòu)，這種致密結(jié)構(gòu)是細(xì)胞壁穩(wěn)定的基礎(chǔ)［2］。木質(zhì)纖維素中的木聚糖主要可分為硬木木聚糖 （被子植物）和軟木木聚糖（裸子植物和一年生植物）［3］。硬木木聚糖以O(shè)-乙酰-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖的形式存在，聚合度在150～200之間，通常在木糖的C-3位點(diǎn)高度乙?；?。與硬木木聚糖不同，軟木木聚糖為阿拉伯-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖，聚合度小，在70～130之間，以α-L-阿拉伯呋喃糖基替代乙?；⑼ㄟ^(guò)α-1，3-糖苷鍵與木糖殘基相連［4］。木聚糖的結(jié)構(gòu)也是多種多樣，通常包含不同的側(cè)鏈基團(tuán)，如阿拉伯糖、O-乙酰基、阿魏酸、4-O-甲基葡萄糖醛酸和香豆酸等［5］。這些側(cè)鏈基團(tuán)是影響其被水解的因素之一，產(chǎn)生空間障礙，限制了主鏈降解酶和主鏈的接觸，降低了可及性［6-7］。

廣義上來(lái)講，木聚糖酶（Xylanase）指的是一類具有將木聚糖水解為低聚木糖及木糖作用的酶的總稱。由于木聚糖的來(lái)源及其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性不同，其完全降解需要多種酶的協(xié)同作用，其中主要包括β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（β-1，4-endoxylanase，EC 3.2.1.8）、β-1，4-外切木聚糖酶（β-1，4-exoxylanase，EC 3.2.1.37）和β-木糖苷酶3種。此外，還有一些作用于木聚糖支鏈的水解酶，如α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和p-香豆酸酯酶等［8］。基于酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性及疏水簇分析，絕大多數(shù)木聚糖酶都屬于糖苷水解酶（Glycoside Hydrolase，GH）10和11家族［9］。GH11家族木聚糖酶具有底物特異性高、相對(duì)分子質(zhì)量小（＜30 000）和等電點(diǎn)一般為中性等特點(diǎn)。GH10家族木聚糖酶具有作用底物廣泛、高相對(duì)分子質(zhì)量（＞30 000）及等電點(diǎn)偏酸性等特點(diǎn)。由于木聚糖的徹底降解需要多種酶的協(xié)同作用，F(xiàn)aulds等［10］人做了關(guān)于阿魏酸酯酶與GH11和GH10協(xié)同作用釋放酚酸方面的研究。Várnai等［11］人報(bào)道了關(guān)于木聚糖酶與甘露聚糖酶協(xié)同作用于軟木的相關(guān)研究。迄今為止，關(guān)于乙酰木聚糖酯酶與木聚糖酶之間的協(xié)同作用鮮有報(bào)道。

乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.6，Acetyl Xylan Esterase，AXE）能夠消除乙?；揪厶侵心咎菤埢鵆-2和C-3位的O-乙酰取代基。作者利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏的 3株工程酵母 Pichia pastoris GS115/ Auaxe、GS115/Auxyn10A和 GS115/Auxyn11A進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，分別獲得重組乙酰木聚糖酯酶、GH10和GH11家族木聚糖酶，雙酶協(xié)同降解小麥麩皮。作者為酶法高效水解農(nóng)業(yè)廢棄物奠定了一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株和培養(yǎng)基

P.pastoris GS115/Auaxe、GS115/Auxyn11A 與GS115/Auxyn10A工程菌株均由江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏；YPD、BMGY和BMMY培養(yǎng)基參考 Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.2材料和試劑

生物素、酵母提取物、YNB、胰蛋白胨均購(gòu)自上海Sangon公司；櫸木木聚糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；麩皮購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，去淀粉麩皮的處理按照Mukherjee等［12］和龔燕燕等［13］提供的方法，每次處理做3組平行實(shí)驗(yàn)，每次預(yù)處理后并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶粗酶液的制備

分別挑取 GS115/Auaxe、GS115/Auxyn11A和GS115/Auxyn10A單菌落接種到25 mL液體BMGY中，30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，室溫靜置約1～2 h，棄上清，加入30 mL的BMMY，于同樣條件下培養(yǎng)至72 h，每隔24 h添加體積分?jǐn)?shù)1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。酵母發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，收獲上清即分別為重組乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶粗酶液。

1.4酶活的測(cè)定

以對(duì)硝基苯酚醋酸酯為底物，用分光光度法測(cè)定經(jīng)重組乙酰木聚糖酯酶（reAuAxe）水解后產(chǎn)物中對(duì)硝基苯酚的吸光值。具體步驟按Krastanova等［14］提供的方法稍作修改：取0.04 mL 100 mmol/L的底物 （DMSO溶解）與0.86mL 100mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）混勻，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后加入3 mL甲醇終止反應(yīng)，再加入2 mL去離子水，測(cè)定A410。在上述反應(yīng)條件下，1個(gè)酶活性單位 （U）定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

采用改進(jìn)的DNS法［8］測(cè)定木聚糖酶酶活，2.4 mL 0.5%木聚糖溶液 （pH 4.6）加入0.1 mL適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液，于50℃下反應(yīng)15 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴中顯色7min，測(cè)定A540nm。在上述反應(yīng)條件下，一個(gè)酶活性單位（U）定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量。

1.5乙酰木聚糖酯酶與木聚糖酶協(xié)同作用的研究

1.5.1不同加酶量的協(xié)同作用為了研究乙酰木聚糖酯酶與木聚糖酶之間是否有協(xié)同作用，先確定木聚糖酶單獨(dú)作用去淀粉小麥麩皮時(shí)的添加量，然后再研究乙酰木聚糖酯酶添加量的影響。分別準(zhǔn)確稱取0.5 g去淀粉小麥麩皮于100mL搖瓶中，加入不同單位木聚糖酶（50～200 U），以100 mmol/L、pH 5.0磷酸鈉緩沖液將反應(yīng)體系補(bǔ)至終體積為30 mL，置于40℃恒溫振蕩器中酶解2 h后沸水浴10 min終止反應(yīng)。水解液于10 000 r/min離心10 min，然后測(cè)定上清液中還原糖的含量。

1.5.2不同加酶順序的協(xié)同作用為了驗(yàn)證乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶是否有協(xié)同作用，均以0.5 g去淀粉小麥麩皮為底物，分別設(shè)計(jì)了以下反應(yīng)體系：1）只添加緩沖液反應(yīng)2 h；2）只加入木聚糖酶反應(yīng)2 h；3）只加入乙酰木聚糖酯酶反應(yīng)2 h；4）先加木聚糖酯反應(yīng)2 h，酶滅活后再加乙酰木聚糖酯酶反應(yīng)2 h；5）同時(shí)加入乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶反應(yīng)2 h；6）先加木聚糖酶反應(yīng)2 h，酶滅活后再加乙酰木聚糖酯酶反應(yīng)2 h。

1.5.3不同酶量比的協(xié)同作用分別準(zhǔn)確稱取0.5 g去淀粉小麥麩皮于100 mL搖瓶中，加入不同酶量比的reAuAxe和11家族重組木聚糖酶（reAuXyn11A）酶液，以100mmol/L、pH 5.0磷酸鈉緩沖液將反應(yīng)體系補(bǔ)至終體積為30mL，置于40℃恒溫振蕩器中酶解2 h后沸水浴10min終止反應(yīng)。水解液于10 000 r/min離心10 min，然后測(cè)定上清液中還原糖的含量。以底物中只加緩沖液的相同體系經(jīng)相同處理的樣品作為對(duì)照。為防止反應(yīng)體系中微生物對(duì)還原糖的降解，在反應(yīng)體系中添加了終質(zhì)量濃度為100mg/mL的氨芐青霉素。

不同酶量比（酶活力比）的reAuAxe和10家族木聚糖酶 （reAuXyn10A）反應(yīng)體系除100mmol/L、pH 5.5磷酸鈉緩沖液外其他條件均與上述相同。

2　結(jié)果與分析

2.1乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

Koseki［15］等人克隆表達(dá)了來(lái)自米曲霉的乙酰木聚糖酯酶，此乙酰木聚糖酯酶的最適溫度和pH分別是45℃和6.0，在40～50℃、pH 6.0～7.0范圍內(nèi)酶活性穩(wěn)定。黃孢原毛平革菌的乙酰木聚糖酯酶酶活大小為39.86 U/mg，最適溫度及pH分別為30～35℃和7.0［16］。根據(jù)1.4中酶活的測(cè)定方法，reAuAxe的酶活為35.6 U/mL，reAuXyn11A的酶活則為582 U/mL，reAuXyn10A的酶活則為 170 U/mL。reAuAxe、reAuXyn11A及reAuXyn10A酶學(xué)性質(zhì)［17-18］如表1所示。來(lái)自宇佐美曲霉的第10家族木聚糖酶和第11家族木聚糖酶的最適pH分別是5.5和5.0，而乙酰木聚糖酯酶在pH在4.5～7.0范圍內(nèi)仍有較高活性，所以乙酰木聚糖酯酶和第10和11家族木聚糖酶協(xié)同作用時(shí)反應(yīng)pH分別為5.5和5.0。與米曲霉乙酰木聚糖酯酶比較可見(jiàn)，reAuAxe的最適溫度更高一些，且pH穩(wěn)定性范圍更廣。與黃孢原毛平革菌乙酰木聚糖酯酶比較，reAuAxe的酶活性更高并且最適溫度比前者高近20℃。將3種不同來(lái)源的乙酰木聚糖酯酶的相關(guān)酶學(xué)特性進(jìn)行比較可見(jiàn)，reAuAxe有著酶活性更高、pH穩(wěn)定性范圍更廣的優(yōu)勢(shì)。

表1　reAuAxe、reAuXyn11A及reAuXyn10A的酶學(xué)性質(zhì)Table 1　Enzymatic properties of reAuAxe，reAuXyn11A and reAuXyn10A

2.2乙酰木聚糖酯酶與GH11家族木聚糖酶的協(xié)同降解作用

2.2.1不同加酶量的協(xié)同作用按照1.5.1中的方法，考察最佳木聚糖酶添加量，結(jié)果如圖1所示，在50～200 U之間，還原糖量隨著酶添加量的增加而逐漸升高。當(dāng)酶量為150 U時(shí)，生成的還原糖量為0.75mg/mL，但當(dāng)酶添加量大于150 U時(shí)，還原糖量趨于平穩(wěn)。因此，最佳木聚糖酶添加量為150 U。確定木聚糖酶添加量后，再研究乙酰木聚糖酯酶的添加量。

圖1　不同加酶量對(duì)還原糖釋放量的影響Fig.1　Effects of enzyme concentration on the release of reducing sugar

2.2.2不同加酶順序的協(xié)同作用如圖2所示，在反應(yīng)體系中只添加緩沖液或乙酰木聚糖酯酶均沒(méi)有檢測(cè)到還原糖的釋放（方案1和3）。如方案4、5 和6所示，在反應(yīng)體系中先添加reAuXyn11A、同時(shí)添加兩種酶、先添加reAuAxe，分別釋放出0.78、0.89、1.00mg/mL的還原糖，比單獨(dú)添加reAuXyn11A時(shí)還原糖的產(chǎn)生量分別提高了5.0%、20.2%和35.1%。方案4與方案2相比，方案4中還原糖量略高一點(diǎn)，可能是由于木聚糖酶作用木聚糖主鏈生成不同大小的片段，然后乙酰木聚糖酯酶作用于這些片段，使其結(jié)構(gòu)疏松，暴露出少量的還原端，所以還原糖量會(huì)增加但是增加量不大。方案5比方案2還原糖量增加了20.2%，說(shuō)明雙酶在協(xié)同降解去淀粉小麥麩皮的過(guò)程中有一定的協(xié)同作用。方案6比方案5生成的還原糖量多，可能是由于乙酰木聚糖酯酶先作用于木聚糖，能更充分的消去側(cè)鏈的乙?；鶊F(tuán)，使得木聚糖酶有更多的機(jī)會(huì)作用于木聚糖主鏈，并且總的反應(yīng)時(shí)間也比方案5時(shí)間長(zhǎng)，所以生成的還原糖量要更多。

2.2.3不同酶量比（酶活力比）的協(xié)同作用按照

1.5.2中的方法研究不同酶量比時(shí) reAuAxe與reAuXyn11A的協(xié)同作用，結(jié)果如圖3所示，不同酶量比產(chǎn)生還原糖的量不同。隨著 reAuAxe與reAuXyn11A比例的增加，還原糖的產(chǎn)量也逐漸增加，但是還原糖增加量的趨勢(shì)變緩，可能是由于加酶量達(dá)到飽和。當(dāng)reAuAxe與reAuXyn11A的添加酶量比為5∶1時(shí)協(xié)同效果較好，還原糖生成量比木聚糖酶單獨(dú)作用增加了46%。該結(jié)果表明，去淀粉麩皮中木聚糖上乙?；娜コ瑢?duì)提高木聚糖酶的水解效率具有重要作用。Huy［16］等人分別以樺木木聚糖、櫸木木聚糖和阿拉伯糖基木聚糖為底物研究黃孢原毛平革菌的乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶的協(xié)同作用，結(jié)果還原糖的增加量分別提高了19.4%，11.2%和6.3%。綜上所述，來(lái)自宇佐美曲霉的乙酰木聚糖酯酶和GH11家族木聚糖酶的協(xié)同作用效果更好。

圖2　加酶順序?qū)€原糖釋放量的影響Fig.2　Effects of the addition order on the release of reducing sugar

圖3　不同酶量比對(duì)還原糖釋放量的影響Fig.3　Effects of different enzyme ratios on the release of reducing sugar

2.3乙酰木聚糖酯酶與GH10家族木聚糖酶的協(xié)同降解作用

2.3.1不同加酶順序的協(xié)同作用如圖4所示，在反應(yīng)體系中只添加緩沖液或乙酰木聚糖酯酶均沒(méi)有檢測(cè)到還原糖的釋放（方案1和3）。如方案4、5 和6所示，在反應(yīng)體系中先添加reAuXyn10A、同時(shí)添加兩種酶、先添加reAuAxe，均能釋放出還原糖，比單獨(dú)添加reAuXyn10A時(shí)還原糖的產(chǎn)生量分別提高了5.3%、6.6%和14.6%。方案5與方案6的還原糖生成量均低于reAuAxe與reAuXyn11A作用生成還原糖的量。

圖4　加酶順序?qū)€原糖釋放量的影響Fig.4　Effects of the addition order on the release of reducing sugar

2.3.2不同酶量比（酶活力比）的協(xié)同作用按照1.5.2中的方法測(cè)不同酶量比時(shí) reAuAxe與reAuXyn10A的協(xié)同作用大小，結(jié)果如圖5所示，不同的酶質(zhì)量比例產(chǎn)生的還原糖量不同，隨著reAuAxe和reAuXyn10A比例的增加產(chǎn)生的還原糖量逐漸增加，由于加酶量達(dá)到飽和，增加趨勢(shì)平緩。當(dāng)reAuAxe和reAuXyn10A添加量比為5∶1時(shí)協(xié)同效果較好，還原糖生成量比木聚糖酶單獨(dú)作用增加了16%。比reAuAxe與reAuXyn11A協(xié)同作用還原糖增加量小，可能是受限于小麥麩皮組織縫隙的大小，使得分子量小的reAuXyn11A更容易進(jìn)入組織水解木聚糖［19］，另外由于11家族木聚糖酶空間位阻比較大，而10家族木聚糖酶的空間位阻較小，所以木聚糖側(cè)鏈的乙?；鶊F(tuán)的去除對(duì)于reAuXyn11A的影響比較大，綜上所述，reAuAxe與reAuXyn11A的協(xié)同作用效果要更好。

3　結(jié)語(yǔ)

中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年都產(chǎn)生很多的農(nóng)業(yè)廢棄物，如小麥麩皮、玉米芯、谷物類及甘蔗渣，都是地球上豐富的可再生有機(jī)碳源。中國(guó)近年來(lái)小麥的年產(chǎn)量超1億多噸，隨之每年產(chǎn)生高達(dá)2 000多萬(wàn)噸的副產(chǎn)品-麩皮，多被丟棄或用作動(dòng)物飼料。麩皮是一種含量豐富的工業(yè)副產(chǎn)物，它可以進(jìn)一步被降解利用，生產(chǎn)寡糖及發(fā)酵所需的糖。由于麩皮中木聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，僅僅利用單個(gè)的酶作用很難高效、徹底地將其降解。木聚糖側(cè)鏈上的乙?；鶊F(tuán)的存在對(duì)木聚糖酶降解木聚糖產(chǎn)生了阻礙作用，進(jìn)而影響底物的水解效率。乙酰木聚糖酯酶能夠消除乙?；揪厶侵心咎菤埢鵆-2和C-3位的O-乙酰取代基，從而提高木聚糖酶對(duì)主鏈的可及性，提高酶解效率。

圖5　不同酶量比對(duì)還原糖釋放量的影響Fig.5　Effects of different enzyme ratios on the release of reducing sugar

作者以去淀粉小麥麩皮為研究對(duì)象，經(jīng)試驗(yàn)確定reAuAxe和GH11家族reAuXyn11A在酶量比為5∶1，酶解時(shí)間為2 h，酶解溫度為40℃，pH為5.0，料液質(zhì)量體積比為1 g∶60mL時(shí)還原糖的生成量比木聚糖酶單獨(dú)作用增加了46%。而 reAuAxe和GH10家族reAuXyn10A酶活力比為5∶1時(shí)在pH 5.5、40℃、料液質(zhì)量體積比1 g∶60 mL、水解2 h的條件下還原糖的生成量比木聚糖酶單獨(dú)作用增加了16%。由此可見(jiàn)，乙酰木聚糖酯酶與GH11家族reAuXyn11A協(xié)同作用效果更好。

［1］謝響明，孫曉霞，吳玉英，等.綠色糖單孢菌產(chǎn)木聚糖酶規(guī)律及其耐堿耐熱性的初步研究 ［J］.生命科學(xué)研究，2005，9（1）：55-59. XIE Xiangming，SUN Xiaoxia，WU Yuying，et al.Studies of xylanase from Saccharomonospora viridis and analysis of its thermostability and alkali-tolerance［J］.Life Science Research，2005，9（1）：55-59（in chinese）.

［2］Beg Q K，KapoorM，Mahajan L，etal.M icrobialxylanasesand their industrialapplications：a review［J］.Applied M icrobiology and Biotechnology，2001，56（3-4）：326-338.

［3］Sunna A，Antranikian G.Xylanolytic enzymes from fungiand bacteria［J］.Critical Reviews in Biotechnology，1997，17（1）：39-67.

［4］Puls J.Chem istry of hemicelluloses：relationship between hem icellulose structure and enzymes required for hydrolysis［J］. Macromolecular Symposia，1997，120（1）：183-196.

［5］Tang CD，Guo J，Wu M C，etal.Cloning and bioinformaticsanalysisof a novelacidophilicβ-mannanase gene，Auman5A，from Aspergillus usamii YL-01-78［J］.W orld Journal of M icrobiology and Biotechnology，2011，27（12）：2921-2929.

［6］De Vries R P，Visser J.Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cellwall polysaccharides［J］.M icrobiology and M olecular Biology Reviews，2001，65（4）：497-522.

［7］Biely P，Cote G L，Kremnicky L，etal.Action ofacetylxylan esterase from Trichoderma reesei on acetylatedmethylglycosides［J］. FEBS Letters，1997，420（2）：121-124.

［8］Wang JQ，Zhang H M，Wu M C，et al.Cloning and sequence analysis of a novel xylanase gene，Auxyn10A，from Aspergillus usamii［J］.Biotechnology Letters，2011，33（5）：1029-1038.

［9］Cantarel B L，Coutinho PM，Rancurel C，et al.The Carbohydrate-Active EnZymes database（CAZy）：an expert resource for glycogenom ics［J］.Nucleic Acids Research，2009，37（1）：233-238.

［10］Faulds C B，MandalariG，Curto RB L，etal.Synergy between xylanases from glycoside hydrolase family 10 and family 11 and a feruloyl esterase in the release of phenolic acids from cereal arabinoxylan［J］.App lied M icrobiology and Biotechnology，2006，71（5）：622-629.

［11］Várnai A，Huikko L，Pere J，et al.Synergistic action of xylanase and mannanase improves the total hydrolysis of softwood［J］. Bioresource Technology，2011，102（19）：9096-9104.

［12］Mukherjee G，Singh R K，M itra A，et al.Ferulic acid esterase production by Streptomyces sp［J］.Bioresource Technology，2007，98（1）：211-213.

［13］Gong Y Y，Yin X，Wu M C，etal.Cloning，expression of a feruloylesterase from Aspergillus usamii E001 and itsapplicability in generating ferulic acid from wheatbran［J］.Journal of IndustrialM icrobiology and Biotechnology，2013，40（12）：1433-1441.

［14］Krastanova I，Guarnaccia C，Zahariev S，etal.Heterologousexpression，purification，crystallization，X-ray analysisand phasing of the acetyl xylan esterase from Bacillus pumilus［J］.Biochim ica et Biophysica Acta：Proteins and Proteom ics，2005，1748（2）：222-230.

［15］Koseki T，M iwa Y，Akao T，et al.An Aspergillus oryzae acetyl xylan esterase：Molecular cloning and characteristics of recombinantenzyme expressed in Pichia pastoris［J］.Journal of Biotechnology，2006，121（3）：381-389.

［16］Huy N D，Thiyagarajan S，Kim DH，et al.Cloning and characterization of a novel bifunctional acetyl xylan esterase w ith carbohydrate bindingmodule from Phanerochaete chrysosporium［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115（5）：507-513.

［17］Zhang H M，Wang J Q，Wu M C，et al.Optimized expression，purification and characterization of a family 11 xylanase （AuXyn11A）from Aspergillus usamii E001 in Pichia pastoris［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94 （4）：699-706.

［18］Wang JQ，Yin X，Wu M C，etal.Expression of a family 10 xylanase gene from Aspergillus usamii E001 in Pichia pastoris and characterization of the recombinantenzyme［J］.Journal of IndustrialM icrobiology&Biotechnology，2013，40（1）：75-83.

［19］FauldsCB，MandalariG，Lo Curto RB，etal.Synergy between xylanases from glycoside hydrolase fam ily 10 and fam ily 11 and a feruloyl esterase in the release of phenolic acids from cereal arabinoxylan［J］.App lied M icrobiology and Biotechnology，2006，71（5）：622-629.

Combinative Degradation of Xylan with Acetyl Xylan Esterase and Xylanase

ZHU Tiandi1，HE Yao1，YANG Biao2，LIU Jiachi2，WUMinchen*2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The synergetic effect of the recombinant acetylxylan esterase and xylanase from Aspergillus usamii（abbreviated as reAuAxe，reAuXyn11A，reAuXyn10A，respectively）was investigated.Thefermentationof PichiapastorisGS115/Auaxe，GS115/Auxyn11Aand GS115/Auxyn10A was carried out using methanol as inducer and reAuAxe，reAuXyn11A and reAuXyn10A were successfully expressed.The amounts on the release of reducing sugar were optim ized w ith enzyme concentration when incubated for 2 h at the optimal pH under 40℃w ith the solid-liquid ratio of 1 g∶60m L.A better synergistic effectwas found when acetylxylan esterase and reAuXyn11A were combined.Comparing to use xylanase alone，the released reduce sugar could increaseby 46%when reAuAxeand reAuXyn11A wereaddedw ith a ratio of5∶1.The removalof the O-acetylgroups from the xylose residuesby acetylxylan esterasewasnecessary and important for the efficiency improvementof xylan hydrolysis.

acetylxylan esterase，xylanase，synergistic effect，xylan

Q 55

A

1673—1689（2016）03—0375—06

2014-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101229）。

鄔敏辰（1962—），男，江蘇無(wú)錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與基因工程研究。E-mail：biowmc@126.com