星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素包合物的制備工藝

王章姐，李晶晶，胡容峰

（1.安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥230038）

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素包合物的制備工藝

王章姐1，李晶晶1，胡容峰*2，3

（1.安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥230038）

研究星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素-β-環(huán)糊精（NAR-β-CD）包合物的制備工藝。采用攪拌法制備NAR-β-CD包合物，以β-CD與NAR的投料質(zhì)量比、包合時間、包合溫度為自變量，以包封率、包合物得率為因變量，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法，對結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合，經(jīng)效應(yīng)面法預(yù)測最佳工藝條件，并作驗證試驗。并比較NAR-β-CD包合物和NAR的累積溶出率。NAR-β-CD包合物的最佳工藝：β-CD與NAR投料質(zhì)量比為5∶1，包合時間為1.412 h，包合溫度為48.11℃。包合率和包合物得率預(yù)測值與理論值的偏差分別為1.43%、1.99%。NAR和NAR-β-CD包合物的累積溶出率分別為37.15%，為83.24%。

NAR；β-環(huán)糊精；包合率；包合物得率；星點設(shè)計；效應(yīng)面

柚皮素（naringenin，NAR）是一種二氫黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)咳、抗氧化等多方面生物活性［1-3］，但NAR水溶性和脂溶性均較差、口服生物利用度較低，故其口服制劑在臨床上應(yīng)用受到了限制。目前包合物的制備多采用正交設(shè)計或均勻設(shè)計法進(jìn)行優(yōu)化，雖然實驗設(shè)計相對簡單，實驗次數(shù)較少，但精密度低。星點設(shè)計-效應(yīng)面法是國內(nèi)近年來常用的集統(tǒng)計學(xué)和數(shù)學(xué)方法于一體的實驗設(shè)計和優(yōu)化方法，通過線性回歸和二項式擬合獲得最佳工藝參數(shù)［4-5］。作者采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化NAR-β-CD包合物的制備工藝，并考察了NAR和NAR-β-CD包合物的累積溶出率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

NAR原料藥 （批號HK20131222，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，陜西慧科植物開發(fā)有限公司產(chǎn)品）；NAR對照品（批號110722-201018，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品）；β-環(huán)糊精 （上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品）；乙醇等其余試劑均為分析純。

1.2儀器

DF-101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-DI-Ⅱ型循環(huán)水式真空泵：浙江黃巖求精真空泵廠產(chǎn)品；UV-2550紫外-可見分光光度儀：日本島津公司產(chǎn)品；Autoscience AS3120超聲波清洗機：奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；BT125D電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品：DZF1.0型真空干燥箱：上海長源儀器設(shè)備廠產(chǎn)品；CP2115D電子天平：Satorius公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1NAR-β-CD包合物的制備稱取適量β-CD溶于水中，加熱溶解制成β-CD飽和水溶液，備用。稱取一定量NAR原料藥，加入適量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，置恒溫磁力攪拌中，加入β-CD飽和水溶液，磁力加熱攪拌一定時間，靜置，放入冰箱中冷藏24 h，真空抽濾，用無水乙醇多次洗滌濾餅，干燥，得到橙黃色固體即為NAR-β-CD包合物［6］。

1.3.2對照品儲備液的制備取在105℃干燥至恒重的NAR對照品20mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇適量，搖勻使溶解，再加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇至刻度，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇稀釋至刻度，即得20mg/L對照品溶液。

1.3.3供試品溶液的制備取NAR-β-CD包合物適量，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解配成一定質(zhì)量濃度的供試品溶液。

1.3.4紫外檢測波長的掃描精密量取NAR對照品溶液適量，在200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，選取最大吸收波長作為NAR含量測定時的檢測波長。

1.3.5評價指標(biāo)以NAR-β-CD包合物包合率（Y1）和包合物得率 （Y2）評價指標(biāo)。Y1=包合物中NAR的質(zhì)量/投入NAR的質(zhì)量；Y2=干燥包合物的質(zhì)量/（β-CD的質(zhì)量+NAR的質(zhì)量）

1.3.6星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝通過前期預(yù)實驗選擇出對包合率、包合物得率有影響的3個因素為自變量：β-CD與NAR的投料質(zhì)量比 （X1）、包合時間（X2）、包合溫度（X3），并分別進(jìn)行單因素實驗，從而確定3個自變量水平范圍分別為X1：1∶1～6∶1；X2：0.5～5 h；X3：40～80℃。根據(jù)星點設(shè)計原理，每個因素設(shè)置5個水平，分別用-α、-1、0、1、α表示，本實驗中α=1.682。星點設(shè)計因素水平見表1，試驗安排及結(jié)果見表2［7］。

表1　星點設(shè)計因素水平表Table 1　Independent variables and levels

表2　星點設(shè)計表與結(jié)果Table 2　Experiment design and results

2　結(jié)果與分析

2.1NAR的含量測定

2.1.1紫外檢測波長的確定經(jīng)全波長掃描，結(jié)果顯示NAR在288 nm和322 nm處有最大吸收波長，由于β-CD在288 nm處也有吸收，為避免處方中β-CD的干擾，故選用322 nm處作為NAR含量測定時的檢測波長。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取NAR對照品儲備液3、4、5、6、7、8mL于10mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇至刻度，得到6、8、10、12、14、16 mg/L的對照品溶液。以70%乙醇為空白對照溶液，照紫外-可見分光光度法 （《中國藥典》2010年版一部附錄VA）試驗，在322 nm波長處測定吸光度。以對照品濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制NAR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.052 1C+0.035 0，r=0.992 7，表明NAR在6～16 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗配制高、中、低3個質(zhì)量濃度（14、10、6 mg/L）的NAR對照品溶液，對NAR進(jìn)行日間和日內(nèi)差別的測定。日內(nèi)精密度RSD分別為1.68%、2.31%、1.96%（n=5）；日間精密度RSD分別為1.25%、2.42%、2.37%（n=5），結(jié)果顯示本方法精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，每隔5min測定一次，記錄吸光度，連續(xù)測定6次，計算NAR吸光度的RSD為1.06%，表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗取NAR-β-CD包合物6份，平行配制成供試品溶液進(jìn)行測定，連續(xù)測定，記錄吸光度，計算NAR的RSD為0.92%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.6回收率試驗按處方量的80%、100%、120%加入NAR對照品，平行制備3份，測定樣品中NAR的量，計算回收率。結(jié)果平均回收率分別為98.42%、98.85%、99.14%，RSD分別為1.83%、2.36%、2.49%。

2.2星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.2.1模型擬合采用Design Expert 8.05軟件，分別對各因素水平進(jìn)行多元線性回歸和非線性回歸（二項式公式擬合），多元線性回歸方程：包合率C= 87.42+4.57A+5.70B+2.39C，r=0.729；包合物得率Y2= 62.76+2.51A+3.82B+1.74C，r＝0.665；多元線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均較低，表示自變量與因變量之間線性相關(guān)性較差，多元線性回歸擬合度不佳，預(yù)測性較差，故采用二項式擬合。二項式擬合模型為包合率Y1=95.48+4.57A+5.70B+2.39C+0.61AB+0.17AC+ 0.071BC-5.05A2-3.97B2-2.78C2，r=0.964；包合物得率Y2=68.95+2.51A+3.82B+1.74C-0.52AB-0.82AC-1.33BC-4.21A2-2.57B2-2.29C2，r=0.982。兩個二項式擬合方程的相關(guān)系數(shù)分別是0.964和0.982，表明此設(shè)計模型擬合程度良好，可以用此模型對NAR包合物工藝進(jìn)行預(yù)測和分析。

2.2.2效應(yīng)面優(yōu)化由Design Expert 8.05軟件繪制不同影響因素對于響應(yīng)值的三維曲線，分別固定投料質(zhì)量比、包合時間和包合溫度3個影響因素其中之一，考察其他2個因素對包合率、包合物得率的效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖1。根據(jù)方程和響應(yīng)面圖確定NAR包合物的最優(yōu)工藝參數(shù)：β-CD與NAR投料質(zhì)量比為5∶1，包合時間為1.412 h，包合溫度為48.11℃。

圖1　包合率，包合物得率的效應(yīng)面的三維圖Fig.1　Response surface p lot（3D）of the bias for the inclusion ratio andinclusion com plexes yield

2.3驗證試驗

根據(jù)優(yōu)化的最佳工藝條件，平行進(jìn)行3組NAR包合物驗證試驗，并對包合率和包合物得率進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。其中偏差＝（預(yù)測值－實測值）/預(yù)測值。通過驗證實驗可知，星點設(shè)計-效應(yīng)面法所建立的模型預(yù)測性良好，方法可行，可較好地應(yīng)用于NAR包合物的工藝優(yōu)化。

2.4NAR-β-CD包合物溶出度測定

表3　星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法驗證Table 3　Verification of the Central composite designresponse surfacemethodology

按中國藥典2010年版（第二部）溶出度測定法第三法測定NAR-β-CD的體外溶出度。以100mL人工胃液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PEG400）作為溶出介質(zhì)，并設(shè)定溶出介質(zhì)溫度恒定在在 （37±0.5）℃，再將NAR-β-CD包合物及NAR分別置于相同的溶出介質(zhì)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為100r/min，于5，10，15，30，45，60，70，90 min吸取溶出液10 mL，并補充等體積含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PEG400的溶出介質(zhì)，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按2.2項下含量測定方法進(jìn)行測定，計算出不同時間NAR的累積釋藥率，結(jié)果見圖2。

圖2　NAR及NAR-β-CD包合物的累積溶出曲線Fig.2　In vitro release curve of NAR and NAR-β-CD

3　結(jié)語

將藥物分子與-包合材料通過范德華力形成包合物后，可使溶解度增大，穩(wěn)定性提高，毒副作用降低等作用，還可調(diào)節(jié)藥物在體內(nèi)的釋放速率，有效提高藥物生物利用度，可用于制備緩控釋制劑和靶向制劑。

采用攪拌法制備NAR-β-CD包合物，操作方法簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)；通過預(yù)實驗初步篩選出投料質(zhì)量比、包合時間、包合溫度范圍，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面發(fā)優(yōu)化NAR-β-CD包合物制備工藝，經(jīng)驗證實驗證明，星點設(shè)計-效應(yīng)面法對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，其試驗次數(shù)少、精度高，對結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合，經(jīng)效應(yīng)面法預(yù)測最佳工藝條件，所建立的模型相關(guān)系數(shù)較高，預(yù)測性較好，對開發(fā)研究NAR-β-CD包合物新劑型奠定基礎(chǔ)。

在包合過程中，藥物分子先溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，再與-β-CD形成包合物，由于疏水力是促進(jìn)包合的主要作用力，故包和條件通常在水或不同濃度的乙醇中進(jìn)行，NAR水溶性較低，在制備NAR-β-CD包合物時，先將NAR溶解在體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)溶解效果較好，且乙醇易于揮發(fā)，再與β-CD形成包合物，有利于包合物的形成。

比較NAR和NAR-β-CD包合物在人工胃液中90 min內(nèi)的累積溶出率，NAR為37.15%，NAR-β-CD包合物為83.24%，結(jié)果表明NAR制成NAR-β-CD包合物后溶出度顯著提高。

［1］Fa Yun Zhang，Gang Jun Du，Ling Zhang，et al.Naringenin nnhances the anti-tumor effect of doxorubicin through selectively inhibiting the activity ofmultidrug resistance-associated proteinsbutnotP-glycoprotein［J］.Pharmaceutical Research，2009，26 （4）：914-925.

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App lication of the Central Com posite Design and Response Surface M ethodology to the Preparation Optim ization of Naringenin-β-Cyclodextrin Inclusion Com p lexes

WANG Zhangjie1，LIJingjing1，HU Rongfeng*2，3
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Anhui Xinhua College，Hefei 230088，China；2.School of Pharmacy，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China；3.Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine in Anhui Province，Hefei230038，China）

The central composite design and response surfacemethodologywere applied to optimize the preparation technology of naringenin-β-cyclodextrin inclusion complexes.The inclusion ratio and the yield of inclusion complexeswere studied as independentvariables，using several dependent variables such as stirring，themass ratio of NAR-β-CD，inclusion time，and inclusion temperature. The results were fitted by linear equations and second-order polynom ial equation based on the central composite design and response surfacemethod.The optimal inclusion processwas predicted according to formulation and further verified by experiments.The cumulative dissolution ratesof the NAR-β-CD inclusion complexes and the NAR were comparatively studied.The optimal conditionfor the preparation of NAR-β-CD inclusion complexeswas achieved w ith a ratio of 5∶1（β-CD∶NAR），inclusion time of 1.412 h，and inclusion temperature at 48.11℃，where the bias for the prediction valueand theoreticalvalue of the inclusion ratio and the yield of inclusion complexeswere 1.43%and 1.99%，while the cumulative dissolution rate of NAR and NAR-β-CD inclusion complexeswere37.15%and 83.24%，respectively.

Naringenin，β-cyclodextrin，inclusion ratio，yield of the inclusion complexes，central composite design，response surface

TS 23

A

1673—1689（2016）04—0438—05

2014-11-19

安徽高校自然科學(xué)研究項目（KJ2016A312）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201312216024）；安徽新華學(xué)院校級科研項目（2013zr008）；安徽新華學(xué)院校級質(zhì)量工程項目（2013jgkcx02）。

王章姐（1982—），女，安徽安慶人，理學(xué)碩士，講師，主要從事藥物新劑型研究。E-mail：40462634@qq.com

胡容峰（1965—），女，理學(xué)博士，教授，主要從事緩控釋制劑技術(shù)研究。E-mail：hurongfeng@163.com