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      金黃色葡萄球菌DPO-PCR快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

      2016-09-03 08:33:49李丹丹徐義剛邱索平高會(huì)江高慎陽(yáng)
      關(guān)鍵詞:葡萄球菌靈敏度特異性

      李丹丹, 徐義剛,邱索平, 王 昱,高會(huì)江, 高慎陽(yáng)

      (1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,海南 海口 570311;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150030;3.從化出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東 從化510900;4.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,重慶404100;5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;6.遼寧醫(yī)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 錦州121001)

      金黃色葡萄球菌DPO-PCR快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

      李丹丹1, 徐義剛*2,邱索平3, 王 昱4,高會(huì)江5, 高慎陽(yáng)6

      (1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,海南 海口 570311;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150030;3.從化出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東 從化510900;4.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,重慶404100;5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;6.遼寧醫(yī)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 錦州121001)

      為建立檢測(cè)金黃色葡萄球菌(SA)的PCR方法,以SA Sa442基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了一對(duì)雙啟動(dòng)寡核苷酸引物(DPO),建立了SA的DPO-PCR快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,在45~65℃退火溫度范圍內(nèi)均能高效地?cái)U(kuò)增出目的基因,表明DPO引物對(duì)退火溫度不敏感,該方法的靈敏度為2.27×102cfu/mL,同時(shí)DPO引物特異性強(qiáng),與其他菌株無(wú)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。利用該方法和行標(biāo)法分別對(duì)采集的175份樣品進(jìn)行檢測(cè),均共計(jì)檢出13份SA陽(yáng)性樣品,兩者符合率為100%。作者建立的DPO-PCR方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng),具有良好的實(shí)用性,為快速準(zhǔn)確檢測(cè)SA提供新的檢測(cè)手段。

      金黃色葡萄球菌;Sa442基因;DPO-PCR

      金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是一種重要的人畜共患病致病菌,具有重要的公共衛(wèi)生意義。在食品微生物檢驗(yàn)工作中,金黃色葡萄球菌是進(jìn)出口動(dòng)物性食品必檢的食源性致病菌。食物中帶有的SA主要是由原料帶入或在生產(chǎn)、包裝和烹調(diào)過(guò)程中污染,在通風(fēng)不良的高溫環(huán)境中,易滋生該菌并產(chǎn)生腸毒素,人類因飲食受其污染的食品而感染[1-2],主要引起食物中毒、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等,甚至引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染[3-4]。因此,建立快速、準(zhǔn)確而且操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防SA的感染和保障食品安全具有重要意義。

      傳統(tǒng)的增菌、分離和生化鑒定方法,特異性差、靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、受環(huán)境及主觀因素影響大。通常情況下,鑒定一種細(xì)菌需要5~7 d,嚴(yán)重影響檢測(cè)效率[5-6]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn),是目前病原微生物檢測(cè)主要采用的檢測(cè)技術(shù)之一。引物設(shè)計(jì)是建立有效PCR方法的關(guān)鍵。但是,在設(shè)計(jì)引物時(shí),為了防止非特異性擴(kuò)增,不僅需要對(duì)引物進(jìn)行篩選還要優(yōu)化退火溫度,因此引物設(shè)計(jì)工作量加大,檢測(cè)效率不高。

      雙啟動(dòng)寡核 苷 酸 引 物(dual-priming oligonucleotide,DPO)是一種新型的引物設(shè)計(jì)方法,DPO引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單且對(duì)退火溫度不敏感,引物設(shè)計(jì)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選以及對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,簡(jiǎn)化了普通PCR方法引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件優(yōu)化步驟[7-10];另外,DPO引物與模板發(fā)生錯(cuò)配的幾率小,因?yàn)橹灰?個(gè)以上堿基發(fā)生錯(cuò)配,就不會(huì)成功擴(kuò)增[11-12],比常規(guī)PCR引物的特異性更強(qiáng),所以利用DPO引物建立的PCR方法,其檢測(cè)結(jié)果比常規(guī)PCR方法更為精確。作者利用該技術(shù),建立了SA DPO-PCR快速檢測(cè)方法,為快速準(zhǔn)確檢測(cè)SA提供新的檢測(cè)手段。

      1 材料與方法

      1.1菌株

      標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC),分離株由海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室和黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室分離保存(見表1)。細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限公司。

      表1 試驗(yàn)用菌株Table 1 Bacteria stains

      1.2主要試劑

      細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司,增菌培養(yǎng)基BPW購(gòu)自北京蘭伯瑞公司,TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2均購(gòu)自TaKaRa公司。

      1.3方法

      1.3.1引物設(shè)計(jì)以SA高度保守的Sa442基因?yàn)榘谢?,?jīng)BLAST分析,選取Sa442基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)DPO引物,詳見表2,引物由上海生工生物工程公司合成。

      1.3.2細(xì)菌DNA提取將表1中的菌株分別接種于5 mL BPW培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過(guò)夜,取1 mL菌液,利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,-20℃保存?zhèn)溆?。試劑盒法提取?xì)菌。

      表2 引物序列Table 2 Primers used in this study

      1.3.3DPO-PCR反應(yīng)25μL反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.1μL,Mg2+(25 mmol/L)2.5μL,dNTP(2.5 mmol/L)1.5μL,上/下游 DPO引物(10μmol/L)各 0.5μL,DNA模板1.0μL,去離子水補(bǔ)充至25μL。

      反應(yīng)程序:95℃5 min;95℃30 s、59℃45 s、72℃45 s,30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

      1.3.4DPO-PCR退火溫度不敏感性試驗(yàn)退火溫度范圍設(shè)為45~65℃,以常規(guī)引物PCR方法作為參照,進(jìn)行DPO-PCR擴(kuò)增試驗(yàn),經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

      1.3.5DPO-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)將菌體濃度約為2.27×108cfu/mL的SA進(jìn)行10倍梯度稀釋,經(jīng)試劑盒提取每級(jí)稀釋度細(xì)菌DNA,以此作為模板進(jìn)行DPO-PCR反應(yīng),經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定其檢測(cè)靈敏度。

      1.3.6DPO-PCR特異性實(shí)驗(yàn)利用建立的SA DPO-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)表1中所示的菌株,以驗(yàn)證本方法的特異性。

      1.3.7方法驗(yàn)證將建立的SA DPO-PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐工作中,其檢測(cè)結(jié)果經(jīng)傳統(tǒng)方法復(fù)驗(yàn),以驗(yàn)證該方法的可靠性。

      2 結(jié)果

      2.1SA DPO-PCR檢測(cè)方法的建立

      以SA高度保守的Sa442基因?yàn)榘谢?,設(shè)計(jì)DPO引物,經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化,建立了SA DPO-PCR檢測(cè)方法,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在約434 bp處有特異性電泳條帶(圖1)。

      圖1 SA DPO-PCR檢測(cè)方法的建立Fig.1 Development of DPO-PCR method for Staphylococcus aureus

      2.2DPO-PCR退火溫度不敏感性

      在45~65℃的退火溫度范圍內(nèi),利用設(shè)計(jì)的DPO引物均能高效地?cái)U(kuò)增出目的基因,說(shuō)明DPO引物對(duì)退火溫度不敏感,而常規(guī)PCR引物則存在最適退火溫度(圖2)。

      2.3DPO-PCR方法檢測(cè)靈敏度

      靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示,利用建立的DPO-PCR方法能夠有效地檢測(cè)出濃度為2.27×102CFU/mL的SA,即該方法檢測(cè)SA的靈敏度為2.27×102CFU/mL(圖3)。

      2.4DPO-PCR方法檢測(cè)特異性

      利用建立的DPO-PCR方法檢測(cè)表1中所示細(xì)菌,僅SA為DPO-PCR陽(yáng)性,其它菌株為陰性,且無(wú)非特異性擴(kuò)增(圖4(a)),而常規(guī)PCR方法特異性較差,存在交叉反應(yīng)(圖4(b))。

      圖2 DPO引物退火溫度不敏感性Fig.2 Insensitivity of DPO primers for the annealing tem peratures

      圖3 SA DPO-PCR檢測(cè)方法靈敏度Fig. 3 Detection sensitivity of DPO -PCR for Staphylococcus aureus

      2.5方法實(shí)踐應(yīng)用

      利用建立的金黃色葡萄球菌DPO-PCR方法對(duì)175份肉類、果蔬類、鮮牛奶和雞蛋等樣本進(jìn)行檢測(cè),共檢出13份SA陽(yáng)性樣本,經(jīng)行標(biāo)法(SN/T 1870-2007)復(fù)檢,兩者檢測(cè)結(jié)果一致,顯示出良好的實(shí)用性和可靠性。

      3 結(jié)語(yǔ)

      圖4 SA DPO-PCR檢測(cè)方法的特異性Fig.4 Specificity of DPO-PCR for Staphylococcus aureus

      目前,包括中國(guó)在內(nèi)的絕大多數(shù)國(guó)家針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定的方法,即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌,進(jìn)而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在檢測(cè)效率低、靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足。通常情況下,鑒定一種細(xì)菌需要5~7 d,而針對(duì)一些生化特性復(fù)雜的細(xì)菌,如單增李斯特氏菌的檢測(cè)周期可長(zhǎng)達(dá)20 d之久,嚴(yán)重影響了檢測(cè)鑒定的周期,很難適應(yīng)現(xiàn)代化食品安全快速檢測(cè)的需要。SA作為一種重要的食源性致病菌亦是進(jìn)出口動(dòng)物性食品必檢微生物。因此,建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)防止SA的感染和提高SA的檢測(cè)效率具有重要意義。

      PCR技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn),是目前食源性致病菌檢測(cè)主要采用的檢測(cè)技術(shù)之一。在此基礎(chǔ)之上,又相繼發(fā)展了DNA探針技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)以及PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)等,雖然能夠滿足快速檢測(cè)的需求,但是對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求很高,不僅需要對(duì)引物進(jìn)行篩選,而且需要優(yōu)化退火溫度,增加了試驗(yàn)操作步驟,費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。作者引入一種新穎的dual priming oligonucleotide(DPO)引物設(shè)計(jì)方法,DPO引物結(jié)構(gòu)特殊,具有比常規(guī)PCR引物更強(qiáng)的特異性,并且引物自身以及引物間難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)且對(duì)退火溫度不敏感,試驗(yàn)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選以及對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,簡(jiǎn)化了操作步驟,提高了檢測(cè)效率。

      基于DPO引物的設(shè)計(jì)方法建立了SA的DPOPCR特異性檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示,利用設(shè)計(jì)的DPO引物在45~65℃的退火溫度范圍內(nèi)均可實(shí)現(xiàn)SA靶基因的高效擴(kuò)增,不需要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,而常規(guī)PCR引物則存在最適退火溫度。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示,利用建立的DPO-PCR方法能夠有效地檢測(cè)出濃度為2.27×102CFU/mL的SA。特異性結(jié)果顯示,利用設(shè)計(jì)的DPO引物能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出目標(biāo)菌SA,與其它菌株無(wú)交叉反應(yīng)和非特異性擴(kuò)增,而常規(guī)PCR方法特異性較差,存在交叉反應(yīng)。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果表明,利用建立的SADPO-PCR檢測(cè)方法能夠?qū)?shí)際樣品中的SA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè),與行標(biāo)法(SN/T 1870-2007)的檢測(cè)結(jié)果一致,具有良好的實(shí)用性。

      [1]劉金華,王蓓蕾,馬路遙,等.金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157、普通變形桿菌和副溶血弧菌多重PCR檢測(cè)體系的構(gòu)建[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2012,28(12):1120-1124. LIU Jinhua,WANG BeiLei,MA Luyao,et al.Development and application of themultiplex PCRmethod for the detection of Staphylococcus aureus,E.coli O157,Proteus vulgaris and Vibrio parahaemolyticus[J].Chinese Journal of Immunology,2012,28(12):1120-1124.(in Chinese)

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      A DPO-PCR M ethod for the Rapid Detection of Staphylococcus aureus

      LIDandan1,XU Yigang*2, QIU Suoping3, WANG Yu4,GAO Huijiang5, GAO Shenyang6
      (1.Inspection&Quarantine Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau,Haikou 570311,China;2.College of Veterinary Medicine Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China;3. ConghuaEntry-Exit Inspection&QuarantineBureau,Conghua,510900,China;4.Inspection&Quarantine TechnologyCenter of Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Chongqing 404100,China;5. Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China;6.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China)

      A dual-prim ing oligonucleotide(DPO)-based PCRwasdeveloped for the rapid detection of Staphylococcus aureus(SA)using Sa442 of SA as a target gene.DPO primers were able to efficiently amplify the target gene in a temperature range from 45℃to 65℃,indicating that theDPO-PCR method was not sensitive to the annealing temperature.The DPO-PCR sensitivity was 2.27×102cfu/m L.Because of a high specificity of DPO-PCR due to the special structures of DPO primers,no non-specific amplificationswere produced in reaction.In addition,13 positive samples for SA were detected from 175 clinical samplesby the DPO-PCRmethod,which was in accordance w ith the result by the SN/T 1870-2007 standard detection protocol.Therefore,the DPO-PCR could be used asa sensitive,rapid and simple tool.

      Staphylococcus aureus,Sa442 gene,DPO-PCR

      R 37

      A

      1673—1689(2016)04—0419—05

      2014-11-23

      海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)(2015SF29);國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2013IK031,2013IK051,2015IK089);重慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014yykfA80017);海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(ZDXM20130025);廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013GDK04,2015GDK53)。

      李丹丹(1979—),女,黑龍江哈爾濱人,農(nóng)學(xué)博士,高級(jí)獸醫(yī)師,主要從事病原微生物診斷與防治技術(shù)研究。E-mail:108074182@qq.com

      徐義剛(1978—),男,吉林汪清人,農(nóng)學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事病原微生物診斷與防治技術(shù)研究。E-mail:esta123@126.com

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