金黃色葡萄球菌DPO-PCR快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

李丹丹， 徐義剛，邱索平， 王 昱，高會(huì)江， 高慎陽(yáng)

（1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 海口 570311；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；3.從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 從化510900；4.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶404100；5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；6.遼寧醫(yī)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121001）

金黃色葡萄球菌DPO-PCR快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

李丹丹1， 徐義剛*2，邱索平3， 王 昱4，高會(huì)江5， 高慎陽(yáng)6

（1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 海口 570311；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；3.從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 從化510900；4.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶404100；5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；6.遼寧醫(yī)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121001）

為建立檢測(cè)金黃色葡萄球菌（SA）的PCR方法，以SA Sa442基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了一對(duì)雙啟動(dòng)寡核苷酸引物（DPO），建立了SA的DPO-PCR快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，在45～65℃退火溫度范圍內(nèi)均能高效地?cái)U(kuò)增出目的基因，表明DPO引物對(duì)退火溫度不敏感，該方法的靈敏度為2.27×102cfu/mL，同時(shí)DPO引物特異性強(qiáng)，與其他菌株無(wú)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。利用該方法和行標(biāo)法分別對(duì)采集的175份樣品進(jìn)行檢測(cè)，均共計(jì)檢出13份SA陽(yáng)性樣品，兩者符合率為100%。作者建立的DPO-PCR方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)，具有良好的實(shí)用性，為快速準(zhǔn)確檢測(cè)SA提供新的檢測(cè)手段。

金黃色葡萄球菌；Sa442基因；DPO-PCR

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一種重要的人畜共患病致病菌，具有重要的公共衛(wèi)生意義。在食品微生物檢驗(yàn)工作中，金黃色葡萄球菌是進(jìn)出口動(dòng)物性食品必檢的食源性致病菌。食物中帶有的SA主要是由原料帶入或在生產(chǎn)、包裝和烹調(diào)過(guò)程中污染，在通風(fēng)不良的高溫環(huán)境中，易滋生該菌并產(chǎn)生腸毒素，人類因飲食受其污染的食品而感染［1-2］，主要引起食物中毒、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染［3-4］。因此，建立快速、準(zhǔn)確而且操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防SA的感染和保障食品安全具有重要意義。

傳統(tǒng)的增菌、分離和生化鑒定方法，特異性差、靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、受環(huán)境及主觀因素影響大。通常情況下，鑒定一種細(xì)菌需要5～7 d，嚴(yán)重影響檢測(cè)效率［5-6］。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，是目前病原微生物檢測(cè)主要采用的檢測(cè)技術(shù)之一。引物設(shè)計(jì)是建立有效PCR方法的關(guān)鍵。但是，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，為了防止非特異性擴(kuò)增，不僅需要對(duì)引物進(jìn)行篩選還要優(yōu)化退火溫度，因此引物設(shè)計(jì)工作量加大，檢測(cè)效率不高。

雙啟動(dòng)寡核 苷 酸 引 物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一種新型的引物設(shè)計(jì)方法，DPO引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單且對(duì)退火溫度不敏感，引物設(shè)計(jì)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選以及對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，簡(jiǎn)化了普通PCR方法引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件優(yōu)化步驟［7-10］；另外，DPO引物與模板發(fā)生錯(cuò)配的幾率小，因?yàn)橹灰?個(gè)以上堿基發(fā)生錯(cuò)配，就不會(huì)成功擴(kuò)增［11-12］，比常規(guī)PCR引物的特異性更強(qiáng)，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其檢測(cè)結(jié)果比常規(guī)PCR方法更為精確。作者利用該技術(shù)，建立了SA DPO-PCR快速檢測(cè)方法，為快速準(zhǔn)確檢測(cè)SA提供新的檢測(cè)手段。

1　材料與方法

1.1菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)自美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC），分離株由海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室和黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室分離保存（見表1）。細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限公司。

表1　試驗(yàn)用菌株Table 1　Bacteria stains

1.2主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，增菌培養(yǎng)基BPW購(gòu)自北京蘭伯瑞公司，TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)以SA高度保守的Sa442基因?yàn)榘谢?，?jīng)BLAST分析，選取Sa442基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)DPO引物，詳見表2，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.2細(xì)菌DNA提取將表1中的菌株分別接種于5 mL BPW培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL菌液，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。試劑盒法提取?xì)菌。

表2　引物序列Table 2　Primers used in this study

1.3.3DPO-PCR反應(yīng)25μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1μL，Mg2+（25 mmol/L）2.5μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.5μL，上/下游 DPO引物（10μmol/L）各 0.5μL，DNA模板1.0μL，去離子水補(bǔ)充至25μL。

反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃30 s、59℃45 s、72℃45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.3.4DPO-PCR退火溫度不敏感性試驗(yàn)退火溫度范圍設(shè)為45～65℃，以常規(guī)引物PCR方法作為參照，進(jìn)行DPO-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.3.5DPO-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)將菌體濃度約為2.27×108cfu/mL的SA進(jìn)行10倍梯度稀釋，經(jīng)試劑盒提取每級(jí)稀釋度細(xì)菌DNA，以此作為模板進(jìn)行DPO-PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定其檢測(cè)靈敏度。

1.3.6DPO-PCR特異性實(shí)驗(yàn)利用建立的SA DPO-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)表1中所示的菌株，以驗(yàn)證本方法的特異性。

1.3.7方法驗(yàn)證將建立的SA DPO-PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐工作中，其檢測(cè)結(jié)果經(jīng)傳統(tǒng)方法復(fù)驗(yàn)，以驗(yàn)證該方法的可靠性。

2　結(jié)果

2.1SA DPO-PCR檢測(cè)方法的建立

以SA高度保守的Sa442基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)DPO引物，經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化，建立了SA DPO-PCR檢測(cè)方法，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在約434 bp處有特異性電泳條帶（圖1）。

圖1　SA DPO-PCR檢測(cè)方法的建立Fig.1　Development of DPO-PCR　method　for Staphylococcus aureus

2.2DPO-PCR退火溫度不敏感性

在45～65℃的退火溫度范圍內(nèi)，利用設(shè)計(jì)的DPO引物均能高效地?cái)U(kuò)增出目的基因，說(shuō)明DPO引物對(duì)退火溫度不敏感，而常規(guī)PCR引物則存在最適退火溫度（圖2）。

2.3DPO-PCR方法檢測(cè)靈敏度

靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用建立的DPO-PCR方法能夠有效地檢測(cè)出濃度為2.27×102CFU/mL的SA，即該方法檢測(cè)SA的靈敏度為2.27×102CFU/mL（圖3）。

2.4DPO-PCR方法檢測(cè)特異性

利用建立的DPO-PCR方法檢測(cè)表1中所示細(xì)菌，僅SA為DPO-PCR陽(yáng)性，其它菌株為陰性，且無(wú)非特異性擴(kuò)增（圖4（a）），而常規(guī)PCR方法特異性較差，存在交叉反應(yīng)（圖4（b））。

圖2　DPO引物退火溫度不敏感性Fig.2　Insensitivity of DPO primers for the annealing tem peratures

圖3　SA DPO-PCR檢測(cè)方法靈敏度Fig.　3　Detection　sensitivity　of　DPO　-PCR　for Staphylococcus aureus

2.5方法實(shí)踐應(yīng)用

利用建立的金黃色葡萄球菌DPO-PCR方法對(duì)175份肉類、果蔬類、鮮牛奶和雞蛋等樣本進(jìn)行檢測(cè)，共檢出13份SA陽(yáng)性樣本，經(jīng)行標(biāo)法（SN/T 1870-2007）復(fù)檢，兩者檢測(cè)結(jié)果一致，顯示出良好的實(shí)用性和可靠性。

3　結(jié)語(yǔ)

圖4　SA DPO-PCR檢測(cè)方法的特異性Fig.4　Specificity of DPO-PCR for Staphylococcus aureus

目前，包括中國(guó)在內(nèi)的絕大多數(shù)國(guó)家針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定的方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進(jìn)而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在檢測(cè)效率低、靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足。通常情況下，鑒定一種細(xì)菌需要5～7 d，而針對(duì)一些生化特性復(fù)雜的細(xì)菌，如單增李斯特氏菌的檢測(cè)周期可長(zhǎng)達(dá)20 d之久，嚴(yán)重影響了檢測(cè)鑒定的周期，很難適應(yīng)現(xiàn)代化食品安全快速檢測(cè)的需要。SA作為一種重要的食源性致病菌亦是進(jìn)出口動(dòng)物性食品必檢微生物。因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)防止SA的感染和提高SA的檢測(cè)效率具有重要意義。

PCR技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，是目前食源性致病菌檢測(cè)主要采用的檢測(cè)技術(shù)之一。在此基礎(chǔ)之上，又相繼發(fā)展了DNA探針技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)以及PCR結(jié)合變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)等，雖然能夠滿足快速檢測(cè)的需求，但是對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求很高，不僅需要對(duì)引物進(jìn)行篩選，而且需要優(yōu)化退火溫度，增加了試驗(yàn)操作步驟，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。作者引入一種新穎的dual priming oligonucleotide（DPO）引物設(shè)計(jì)方法，DPO引物結(jié)構(gòu)特殊，具有比常規(guī)PCR引物更強(qiáng)的特異性，并且引物自身以及引物間難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)且對(duì)退火溫度不敏感，試驗(yàn)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選以及對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了檢測(cè)效率。

基于DPO引物的設(shè)計(jì)方法建立了SA的DPOPCR特異性檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用設(shè)計(jì)的DPO引物在45～65℃的退火溫度范圍內(nèi)均可實(shí)現(xiàn)SA靶基因的高效擴(kuò)增，不需要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，而常規(guī)PCR引物則存在最適退火溫度。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用建立的DPO-PCR方法能夠有效地檢測(cè)出濃度為2.27×102CFU/mL的SA。特異性結(jié)果顯示，利用設(shè)計(jì)的DPO引物能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出目標(biāo)菌SA，與其它菌株無(wú)交叉反應(yīng)和非特異性擴(kuò)增，而常規(guī)PCR方法特異性較差，存在交叉反應(yīng)。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果表明，利用建立的SADPO-PCR檢測(cè)方法能夠?qū)?shí)際樣品中的SA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，與行標(biāo)法（SN/T 1870-2007）的檢測(cè)結(jié)果一致，具有良好的實(shí)用性。

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A DPO-PCR M ethod for the Rapid Detection of Staphylococcus aureus

LIDandan1，XU Yigang*2， QIU Suoping3， WANG Yu4，GAO Huijiang5， GAO Shenyang6
（1.Inspection&Quarantine Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau，Haikou 570311，China；2.College of Veterinary Medicine Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；3. ConghuaEntry-Exit Inspection&QuarantineBureau，Conghua，510900，China；4.Inspection&Quarantine TechnologyCenter of Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 404100，China；5. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；6.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

A dual-prim ing oligonucleotide（DPO）-based PCRwasdeveloped for the rapid detection of Staphylococcus aureus（SA）using Sa442 of SA as a target gene.DPO primers were able to efficiently amplify the target gene in a temperature range from 45℃to 65℃，indicating that theDPO-PCR method was not sensitive to the annealing temperature.The DPO-PCR sensitivity was 2.27×102cfu/m L.Because of a high specificity of DPO-PCR due to the special structures of DPO primers，no non-specific amplificationswere produced in reaction.In addition，13 positive samples for SA were detected from 175 clinical samplesby the DPO-PCRmethod，which was in accordance w ith the result by the SN/T 1870-2007 standard detection protocol.Therefore，the DPO-PCR could be used asa sensitive，rapid and simple tool.

Staphylococcus aureus，Sa442 gene，DPO-PCR

R 37

A

1673—1689（2016）04—0419—05

2014-11-23

海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)（2015SF29）；國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2013IK031，2013IK051，2015IK089）；重慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2014yykfA80017）；海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（ZDXM20130025）；廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013GDK04，2015GDK53）。

李丹丹（1979—），女，黑龍江哈爾濱人，農(nóng)學(xué)博士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事病原微生物診斷與防治技術(shù)研究。E-mail：108074182@qq.com

徐義剛（1978—），男，吉林汪清人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事病原微生物診斷與防治技術(shù)研究。E-mail：esta123@126.com