角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)斯氏副柔線蟲的分子生物學鑒定

陳林軍,史紅蕾,楊蓮茹,楊曉野,鄧僑,李斌,李瑩瑩

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)斯氏副柔線蟲的分子生物學鑒定

陳林軍,史紅蕾,楊蓮茹,楊曉野,鄧僑,李斌,李瑩瑩

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

確定角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的斯氏副柔線蟲(Parabronema skrjabini)幼蟲.通過大量剖檢角蠅各齡期幼蟲,收集其體內(nèi)的線蟲幼蟲,經(jīng)擴增測序獲得ITS基因序列,利用DNAStar 5.0軟件,將其與斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列進行同源性比較.結(jié)果表明,角蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的線蟲幼蟲確為斯氏副柔線蟲幼蟲.該研究結(jié)果不但為鑒定角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的斯氏副柔線蟲幼蟲提供了簡易準確的方法,而且也為弄清斯氏副柔線蟲在其傳播媒介角蠅體內(nèi)的發(fā)育過程奠定了基礎(chǔ).

角蠅;斯氏副柔線蟲;ITS基因序列;分子生物學鑒定

Corresponding authors:YANG Lian-ru;YANG Xiao-ye

斯氏副柔線蟲(Parabronema skrjabini)首次發(fā)現(xiàn)于Rassowska R I(Р И Рассовская)對土庫曼斯坦地區(qū)反芻獸真胃內(nèi)寄生性蠕蟲種類進行調(diào)查的過程中[1].該寄生蟲寄生于駱駝真胃內(nèi),可導致嚴重危害養(yǎng)駝業(yè)的斯氏副柔線蟲病(Parabrone?mosis)的發(fā)生[2].目前,關(guān)于斯氏副柔線蟲的生活史尚不完全清楚,只知道西方角蠅和截脈角蠅是駱駝斯氏副柔線蟲病的傳播媒介;2008-2010年,趙志國等通過分子生物學技術(shù),確定了駱駝斯氏副柔線蟲病的傳播媒介為角蠅屬的西方角蠅(Haematobia irritans)和截脈角蠅(Haematobia titil?lans)[3];2011年,李文生通過光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡,對西方角蠅和截脈角蠅消化道內(nèi)的斯氏副柔線蟲幼蟲的形態(tài)特征進行了詳細的觀察和描述[4].但是角蠅變態(tài)過程中何時感染的斯氏副柔線蟲蟲卵,斯氏副柔線蟲蟲卵如何隨著角蠅的變態(tài)過程發(fā)育為感染性幼蟲以及角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)是否存在斯氏副柔線蟲等問題還不清楚.本試驗以傳統(tǒng)方法對各齡期角蠅幼蟲逐一剖檢,在各齡期角蠅幼蟲體內(nèi)收集疑似斯氏副柔線蟲幼蟲,然后在形態(tài)學鑒定的基礎(chǔ)上,利用分子生物學方法對其進行種類驗證.

1　材料與方法

1.1試驗蟲體的來源試驗用蟲體來自于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院預防獸醫(yī)系寄生蟲學教研室,經(jīng)形態(tài)學和分子生物學方法鑒定的野外采集的角蠅各齡期幼蟲.

1.2形態(tài)學鑒定收集到的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲形態(tài)觀察結(jié)果與李文生[4]通過光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察到的斯氏副柔線蟲幼蟲形態(tài)描述基本符合.其主要特征是:在光學顯微鏡低倍鏡下觀察,幼蟲呈淡黃色或乳白色,整條蟲體呈螺旋狀盤曲;高倍鏡下觀察可見其頭部稍窄,口孔位于其頂端;食道較短,由肌質(zhì)部和腺質(zhì)部兩部分組成;腸與食道后端相連,呈管狀,貫穿于整個蟲體;蟲體尾部末端頓圓,向腹面彎曲,似魚鉤,肛門明顯并開口于蟲體近末端處;在掃描電鏡下觀察,可見幼蟲體表有許多由角皮的索狀隆起形成的橫紋;其口孔及周圍的兩片側(cè)唇明顯,頭端的6個耳垂狀物結(jié)構(gòu)不明顯;肛門呈橫裂口狀,一端弓起呈圓弧狀,另一端平直.進一步采用分子生物學方法對其進行了驗證.

1.3DNA提取分別隨機取在角蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼蟲體內(nèi)剖檢得到的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲各50條,另取1條斯氏副柔線蟲成蟲,使用DNA提取試劑盒(DNeasy Blood&Tissue Kit)分別提取角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲的基因組DNA.

1.4基因擴增與純化將上述提取的角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲及斯氏副柔線蟲成蟲的基因組DNA,利用引物STM、STN對其ITS基因序列進行PCR擴增,引物序列為:上游引物(STM):5′-TTTTACAAGAGGGATACGCC-3′;下游引物(STN):5′-GGTATCACAAACTTATCGGG-3′. PCR擴增體系為50 μL,試驗組用量:STM 1 μL(20 μmol/L),STN 1 μL(20 μmol/L),Premix Taq 25 μL,模板10 μL,雙蒸水補足至50 μL;陰性對照組用量:STM 1 μL(20 μmol/L),STN 1 μL(20 μmol/L), Premix Taq 25 μL,雙蒸水補足至50 μL;同時設(shè)用去離子水代替模板的陰性對照.PCR反應條件: 94℃預變性5 min,進入循環(huán);94℃變性30,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,共進行35個循環(huán);72℃延伸10 min.擴展產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?反應結(jié)束后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,然后使用膠回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)對得到的PCR擴增產(chǎn)物進行目的片段回收.

1.5基因的克隆與測序

1.5.1載體連接將角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)疑似斯氏副柔線蟲幼蟲和斯氏副柔線蟲成蟲的PCR擴增純化產(chǎn)物分別與pMD19-T載體連接,連接反應體系為10 μL,反應體系:5 μL Solution 1,1 μL pMD19-T vector,3 μL目的片段,無菌去離子水補足至10 μL;對照體系:5 μL Solution 1,1 μL pMD19-T vector,3 μL Consert insert,無菌去離子水補足至10 μL;參照pMD19-T載體的使用說明書進行載體連接.

1.5.2大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及重組子的轉(zhuǎn)化參照DH5α感受態(tài)細胞的使用說明書將角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)疑似斯氏副柔線蟲幼蟲和斯氏副柔線蟲成蟲的載體連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中,將適當體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞,涂在含有X-gal、IPTG及氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,倒置平皿37℃培養(yǎng)12～16 h.

1.5.3重組菌落的篩選將培養(yǎng)好的瓊脂平板置于4℃冰箱內(nèi)充分顯色2 h,待平板上的藍、白菌落清晰可見時,用滅菌搶頭挑取白色菌落,接種至4 mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中,180 r/min、37℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜.

1.5.4重組菌落PCR鑒定及測序待菌液培養(yǎng)結(jié)束后,震蕩混勻,抽取10 μL菌液作為模板進行PCR鑒定.經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將出現(xiàn)陽性條帶的菌液用封口膜封口后,送上海華大生物公司進行測序.

1.6基因序列分析使用DNAStar 5.0軟件中的SeqMan程序,去掉角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)疑似斯氏副柔線蟲幼蟲和斯氏副柔線蟲成蟲測序結(jié)果中的載體序列,并用字符底紋標記出引物STM和STN的堿基序列.將序列放在NCBI網(wǎng)站中搜索其同源序列,確定疑似斯氏副柔線蟲幼蟲的種類.然后進一步使用DNAStar 5.0軟件中的MegA?lign程序,對角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列進行比對,計算兩者相關(guān)序列間的同源性,并尋找它們彼此之間的差異位點.

2　結(jié)果

2.1疑似斯氏副柔線蟲幼蟲ITS基因PCR擴增結(jié)果角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲經(jīng)斯氏副柔線蟲特異性引物STM、STN擴增后,均出現(xiàn)了約500 bp左右的清晰可見條帶,和陽性對照斯氏副柔線蟲成蟲擴增出的片段大小一致(圖1).因此,可初步確定角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲為斯氏副柔線蟲幼蟲,但最終確定其種類還需進一步的驗證.

圖1　疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與斯氏副柔線蟲成蟲ITS基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2疑似斯氏副柔線蟲幼蟲ITS基因陽性克隆菌液PCR鑒定結(jié)果角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲和斯氏副柔線蟲成蟲的陽性克隆菌液經(jīng)特異性引物STM、STN擴增后,均出現(xiàn)大小一致,約500 bp左右的良好目的條帶(圖2).

圖2　疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與斯氏副柔線蟲成蟲陽性克隆菌液PCR鑒定結(jié)果

2.3角蠅幼蟲體內(nèi)疑似斯氏副柔線蟲幼蟲ITS基因序列分析結(jié)果

2.3.1疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與斯氏副柔線蟲成蟲ITS基因序列比較通過比較角蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列,結(jié)果顯示,四者之間共有541個保守堿基和10個差異堿基,其中差異堿基均表現(xiàn)為堿基的替換,而未出現(xiàn)堿基的缺失或插入.四者間的堿基差異具體為:角蠅Ⅰ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與角蠅Ⅱ期幼蟲、角蠅Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲的ITS基因序列之間分別有8個、3個堿基不同,與斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列間有4個堿基不同;角蠅Ⅱ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與角蠅Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲的ITS基因序列有4個堿基不同,與斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列間有4個堿基不同;角蠅Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲的ITS基因序列與斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列之間有1個堿基不同.造成這些堿基的差異可能是由于測序過程中某些原因?qū)е碌?

2.3.2疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與斯氏副柔線蟲成蟲ITS基因序列同源性比較使用DNAStar 5.0軟件中的MagAlign程序,將角蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲和斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列,與GenBank中已登錄的斯氏副柔線蟲rDNA ITS序列(EU420130.1)進行比較,結(jié)果顯示,它們之間的同源性分別是98.9%、98.6%、99.5%和99.3%,且角蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲和斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列之間的同源性分別為99.3%、99.3%和99.8%(圖3).

圖3　ITS基因序列之間同源性的比較

2.3.3角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)疑似斯氏副柔線蟲幼蟲鑒定結(jié)果角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲,經(jīng)上述分子生物學方法鑒定為斯氏副柔線蟲幼蟲.

3　討論與小結(jié)

線蟲主要依靠其形態(tài)學特征進行分類鑒定,但只有具備豐富的專業(yè)知識和鑒定經(jīng)驗的專家才能借助于其形態(tài)學特征對線蟲進行分類鑒定,對于一般的科技人員和檢疫人員熟練掌握線蟲形態(tài)學鑒

定方法是比較困難的.最近隨著生命科學技術(shù)的發(fā)展,分子生物學方法已經(jīng)被廣泛應用到物種鑒定中,相比傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法,分子生物學鑒定具有容易掌握和操作準確可靠的優(yōu)點.

ITS序列位于18S～5.8S rDNA和5.8S～28S rDNA之間,分別為ITS1、ITS2兩段,全長約1.0～ 1.5 kb.ITS序列的優(yōu)點包括:(1)該序列不參與核糖體的形成且受到的選擇壓力小,適合于種屬間的種群分化方面的研究[5];(2)該序列在種內(nèi)非常保守,而在種間具有一定的差異,有利于PCR擴增引物的設(shè)計[6-7];(3)該序列包含著足夠多的遺傳信息且在絕大多數(shù)真核生物中均具有廣泛的序列多態(tài)性[8];(4)ITS序列長度適中,一般為1.0～ 1.5kb,含有足夠的遺傳信息;(5)ITS序列是中等重復的多拷貝基因,僅需很少的標本量就能達到分析鑒定的要求[9];因此難以用傳統(tǒng)分類方法進行分類的物種可以利用其有效地解決這一問題.由于ITS序列具有上述特點,因此在真核生物物種鑒定和系統(tǒng)分類中,常被作為重要的遺傳標記.

本研究對大量角蠅各齡期幼蟲進行了逐一剖檢,在一些角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了線蟲幼蟲,經(jīng)形態(tài)學鑒定初步定為斯氏副柔線蟲幼蟲,為了進一步確定其是否是斯氏副柔線蟲幼蟲,采用分子生物學方法進行了鑒定.通過提取角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)疑似斯氏副柔線蟲幼蟲的基因組DNA,利用斯氏副柔線蟲ITS基因特異性引物STM、STN對其進行了PCR擴增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果可知,疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與陽性對照斯氏副柔線蟲成蟲擴增出了大小一致的目的條帶,均為551 bp,可初步確定其為斯氏副柔線蟲幼蟲.繼而又將疑似斯氏副柔線蟲幼蟲和斯氏副柔線蟲成蟲的陽性克隆菌液測序,測得的角蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲、斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列,與GenBank中已登錄的斯氏副柔線蟲rDNA ITS序列(EU420130.1)同源性分別是98.9%、98.6%、99.5%和99.3%;角蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲與斯氏副柔線蟲成蟲的ITS基因序列之間的同源性分別為99.3%、99.3%和99.8%.因此可以確定角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的疑似斯氏副柔線蟲幼蟲為斯氏副柔線蟲幼蟲,該研究結(jié)果不但為鑒定角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)的斯氏副柔線蟲幼蟲提供了簡易準確的方法,而且也為弄清斯氏副柔線蟲在其傳播媒介角蠅體內(nèi)的發(fā)育過程奠定了基礎(chǔ).

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M olecular Identification of Parabronema skrjabini Larvae in Different Instars Larvae of Horn Flies

CHEN Lin-jun,SHI Hong-lei,YANG Lian-ru,YANG Xiao-ye,DENG Qiao,LI Bin,LI Ying-ying
(Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease, College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

In order to confirm the nematode larvae in different instars of horn flies is Parabronema skrjabini,a large number of different instars larvae of horn flies were dissected.We found that the nematodes in the insects could be the larvae of Parabronema skrjabini according to their morphology.To intestigate further,we used amplification and sequencing techniques,and obtained ITS sequences of the worm.Then,we compared it with ITS sequences of adult Parabronema skrjabini using DNAStar 5.0.The results showed that the worm in 1st,2nd and 3rd instar larvae of horn flies was proved to be Parabronema skrjabini.The study not only of?fered a simple and applicable way to identify Parabronema skrjabini larvae in different instars larvae of horn flies,but also build the foundation for studying the development process of Parabronema skrjabini in its vector,horn flies.

Horn Fly;Parabronema skrjabini;ITS sequences;Molecular Identification

S858.24

A

0529-6005(2016)02-0015-04

2015-09-28

國家自然科學基金項目(31160502)

陳林軍(1991-),男,碩士,主要從事獸醫(yī)寄生蟲學研究,E-mail:chenlinjunvip@163.com

楊蓮茹,E-mail:lianruyang122@126.com;楊曉野, E-mail:xiaoyeyang122@sohu.com