體外大量擴(kuò)增原發(fā)性肝癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及其生物學(xué)特性的初步分析

秦鵬，柴曉菲，王昭月，買玲，高全立

·論著·

體外大量擴(kuò)增原發(fā)性肝癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及其生物學(xué)特性的初步分析

秦鵬，柴曉菲，王昭月，買玲，高全立

目的探討體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增原發(fā)性肝癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）的新方法，并初步研究其分子表型和功能特征。方法20 例手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌組織經(jīng)混合消化酶消化為單個細(xì)胞后，應(yīng)用密度梯度離心法分離其中的淋巴細(xì)胞，然后應(yīng)用兩步培養(yǎng)法大量擴(kuò)增 TILs，并檢測它們的生長擴(kuò)增速度。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的分子表型，ELISA 法檢測其 IFN-γ 的分泌水平，并分析高表達(dá) PD-1和低表達(dá) PD-1 分子 TILs 分泌 IFN-γ 的能力。

結(jié)果18 例標(biāo)本中的 TILs 在體外經(jīng)兩步法培養(yǎng)后可以擴(kuò)增達(dá)到 1010數(shù)量級。擴(kuò)增的 TILs 中 CD3+細(xì)胞的比例為（91.7 ± 7.4）%，CD3+CD56+細(xì)胞的比例為（28.5 ± 11.7）%，CD3+CD4+細(xì)胞的比例為（32.5 ± 19.6）%，CD3+CD8+細(xì)胞的比例為（62.5 ± 29.1）%。PD-1 分子在 CD3+CD8+細(xì)胞的比例為（23.5 ± 16.1）%。擴(kuò)增的 TILs 分泌 INF-γ 的水平為（827.8 ± 307.7）pg/ml，其中 9 例 PD-1 分子低表達(dá)的 CD3+CD8+細(xì)胞的分泌 INF-γ 的水平為（1087.5 ± 249.6）pg/ml，6 例 PD-1 分子高表達(dá)的 CD3+CD8+細(xì)胞的分泌 INF-γ 的水平為（478.6 ± 69.3）pg/ml，兩者相比有明顯差異（P ＜ 0.05）。

結(jié)論應(yīng)用兩步培養(yǎng)法從原發(fā)性肝癌中大量擴(kuò)增 TILs 簡便易行，擴(kuò)增的 TILs 主要為 CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞，且TILs 中 PD-1 的表達(dá)與其分泌 IFN-γ 的能力呈負(fù)相關(guān)。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞；干擾素 γ；程序性細(xì)胞死亡受體 1；原發(fā)性肝癌

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2016， 11（4）：324-328

原發(fā)性肝癌是在亞洲發(fā)病率很高的惡性腫瘤，我國肝癌發(fā)病率和死亡率是世界上最高的，占全球每年新發(fā)病例和死亡人數(shù)的 55%［1］。由于原發(fā)性肝癌起病隱匿，確診時多已屬中晚期，且患者對放療和化療均不敏感，因此治療效果較差［2］。臨床中發(fā)現(xiàn)個別肝癌患者單獨應(yīng)用免疫治療后巨大腫塊消失并能獲得長期存活［3］，提示部分肝癌對免疫治療敏感。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）具有較強(qiáng)的特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，Klapper 等［4］首先在培養(yǎng)體系中應(yīng)用大劑量 IL-2 將惡性黑色素瘤組織的TILs 擴(kuò)增到一定數(shù)量，然后經(jīng) CD3 單抗和同種異體外周血單個核細(xì)胞刺激，將惡性黑色素瘤的TILs 擴(kuò)增到 1010數(shù)量級，用于治療進(jìn)展期惡性黑色素瘤取得了超過 70% 的有效率。肝腫瘤微環(huán)境內(nèi)往往浸潤有大量的淋巴細(xì)胞，如能將它們擴(kuò)增后回輸，可能對肝癌有較好的治療作用。本課題探討應(yīng)用兩步法體外大量擴(kuò)增肝癌 TILs，初步分析其分子表型和功能，為應(yīng)用 TILs 治療肝癌提供實驗和技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

20 例肝癌樣本均為河南省腫瘤醫(yī)院肝膽外科2009 年 11 月 - 2010 年 9 月手術(shù)切除所得，均經(jīng)病理證實為肝細(xì)胞性肝癌?；颊咧心?13 例，女7 例，年齡 34 ～ 62 歲，平均年齡 46 歲。均在腫瘤中心取材，大小約為 2 cm × 2 cm × 2 cm；RPMI 1640 培養(yǎng)基為美國 Gibcobrl 公司產(chǎn)品；混合膠原酶（I，II，IV）、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶均購自美國 Sigma 公司；人 AB 血漿購自河南省中心血站；健康供者外周血單個核細(xì)胞由河南省中心血站惠贈；重組人白介素-2 購自北京四環(huán)生物制藥有限公司；淋巴細(xì)胞分離液為中科院生物工程研究所產(chǎn)品；CD3、CD4、CD8、CD56、PD-1 以及 IgG1同型對照和 ELISA 檢測 IFN-γ 試劑盒均購自美國 BD 公司。

1.2方法

1.2.1TILs 細(xì)胞的分離將手術(shù)切除的腫瘤組織立即在無菌條件下去除腫瘤表面壞死組織和結(jié)締組織，用 RPMI 1640 漂洗并剪成約 0.5 mm × 0.5 mm × 1 mm 的小塊，種瓶并用混合膠原酶（I，II，IV）、透明質(zhì)酸酶和 DNA 酶 I 混合消化，37 ℃消化 3 ～ 4 h 后腫瘤組織被消化為單個核細(xì)胞，過濾并離心清洗。重新混懸離心后的沉淀并將等體積的 100% 和 75% 的淋巴細(xì)胞分離液先后置于離心管中，然后將細(xì)胞懸液慢慢加至最上層，非連續(xù)密度梯度離心 20 min（2000 r/min），收取下層界面的淋巴細(xì)胞。

1.2.2TILs 細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增應(yīng)用兩步法擴(kuò)增分離的 TILs。首先將分離出的 TILs 細(xì)胞懸浮于含有大劑量 IL-2（6000 U/ml）和 10% 人 AB 血清的 RPMI 1640 的培養(yǎng)基內(nèi)，置于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每 3 ～ 5 天換液 1 次。當(dāng)細(xì)胞總數(shù)生長至約 1 × 107個時，將其轉(zhuǎn)入含有 30 ng/ml OKT3 和 2 × 108個同種異體的經(jīng)輻射滅活的健康供者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的培養(yǎng)瓶內(nèi)。健康供者 PBMC 輻照劑量為 50 Gy。第 2 天加入IL-2 并調(diào)整其在培養(yǎng)液中的濃度為 6000 U/ml。以后每 3 天計數(shù) 1 次細(xì)胞并定期傳代。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測 TILs 的分子表型流式染色 CD3、CD4、CD8、CD56 和 PD- 1，檢測其在每個培養(yǎng)出的腫瘤浸潤 T 淋巴細(xì)胞的表達(dá)。

1.2.4ELISA 檢測按每孔 3 × 106個細(xì)胞的密度將培養(yǎng)出的淋巴細(xì)胞種入 96 孔板，24 h 后收上清，ELISA 試劑盒檢測 IFN-γ 分泌量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

兩組比較用 t 檢驗，所有統(tǒng)計學(xué)處理均用SPSS17.0 軟件完成。

2　結(jié)果

2.1體外 TILs 的大量擴(kuò)增

應(yīng)用含有大劑量 IL-2（6000 U/ml）和 10% 人AB 血清的 RPMI 1640 的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，20 例肝癌標(biāo)本中只有 1 例的 TILs 不能增殖，其余 19 例樣本的 TILs 均能在體外快速擴(kuò)增，但有 1 例擴(kuò)增到 6.7 × 106個細(xì)胞時停止增長，其余的 18 例TILs 均能生長到 1 × 107數(shù)量級。當(dāng)應(yīng)用 CD3 單抗和滅活的健康供者的 PBMC 刺激培養(yǎng)后，18 例樣本的 TILs 均能快速增殖到 1 × 109數(shù)量級，且持續(xù)增殖并最終達(dá)到 1010。每個樣本均在擴(kuò)增第10 天計數(shù)，結(jié)果見圖 1。

2.2大劑量擴(kuò)增后 TILs 的分子表型分析

18 例經(jīng)兩步法擴(kuò)增的 TILs，經(jīng)流式細(xì)胞分析后擴(kuò)增的 TILs 中 CD3+細(xì)胞的比例為 91.7% ± 7.4%，CD3+CD56+細(xì)胞的比例為 28.5% ± 11.7%，CD3+CD4+細(xì)胞的比例為 32.5% ± 19.6%，CD3+CD8+細(xì)胞的比例為 62.5% ± 29.1%，圖 2 為樣本 5、11、17 TILs 擴(kuò)增后流式細(xì)胞分析結(jié)果。

圖1　18 例能快速擴(kuò)增的 TILs 經(jīng)過 CD3 和健康供者 PBMC 刺激10 d 時的細(xì)胞計數(shù)（N2 和 N14 擴(kuò)增失?。〧igure 1　The cell accounts of eighteen TILs which can be expanded rapidly after stimulated for 10 d by CD3 and healthy honers' PBMC （N2 and N14 were failed to be expanded）

圖2　流式細(xì)胞儀檢測擴(kuò)增 TILs 的表型（CD3、CD4、CD8、CD56 在 TILs 中的表達(dá)）Figure 2　The phenotype of expanded TILs by flow cytometry （The expression of CD3， CD4， CD8， CD56 on TILs）

2.3PD-1 在 CD3+CD8+TILs 的表達(dá)及 IFN-γ 的分泌

PD-1 分子在 CD3+CD8+細(xì)胞的比例為23.5% ± 16.1%（圖 3）。擴(kuò)增的 TILs 分泌 INF-γ的水平為（827.8 ± 307.7）pg/ml。

流式細(xì)胞儀檢測 CD3+CD8+細(xì)胞表面可以檢測到不同程度的 PD-1 的表達(dá)，為比較 PD-1 的表達(dá)程度對 TILs 細(xì)胞分泌 IFN-γ 的影響，本實驗按其表達(dá)程度將這些細(xì)胞分為 PD-1 低表達(dá)組和高表達(dá)組，9 例表面表達(dá) PD-1低于 10% 的歸為低表達(dá)組，6 例表面表達(dá) PD-1 高于 20% 的劃為高表達(dá)組，另外 3 例表達(dá)在 10% ～ 20% 之間的未入組。結(jié)果見表 1，低表達(dá) PD-1 分子的 CD3+CD8+細(xì)胞分泌 INF-γ 的水平為（1087.5 ± 249.6）pg/ml，高表達(dá) PD-1 分子的 CD3+CD8+細(xì)胞分泌 INF-γ的水平為（478.6 ± 69.3）pg/ml，高表達(dá) PD-1 組TILs 細(xì)胞 IFN-γ 分泌量明顯少于低表達(dá) PD-1組，兩者相比有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

圖3　流式細(xì)胞儀檢測 N5 和 N7 CD3+CD8+TILs 表面PD-1 的表達(dá)Figure 3　The expression of PD-1 on N5 and N7's CD3+CD8+TILs tested by flow cytometry

表1　低表達(dá) PD-1 組和高表達(dá) PD-1 組CD3+CD8+細(xì)胞 IFN-γ 分泌量Table 1　The IFN-γ secretion of CD3+CD8+TILs in low PD-1 expressed group and high PD-1 expressed group

3　討論

原發(fā)性肝癌為我國常見的惡性腫瘤之一，由于多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時已無手術(shù)機(jī)會以及肝癌細(xì)胞對化療和放療的不敏感，其治療一直是一個亟待解決的難題。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）回輸是近年發(fā)展起來的一種抗腫瘤免疫治療方法，如何分離培養(yǎng)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的 TILs 細(xì)胞并使其擴(kuò)增到可以達(dá)到治療效果的數(shù)量級一直存在一些技術(shù)和應(yīng)用上的難題，且此方面的國內(nèi)報道較少。

在本課題的研究過程中，通過嘗試不同的培養(yǎng)方法，最終成功地應(yīng)用兩步法培養(yǎng)擴(kuò)增切除的肝癌組織內(nèi)的 TILs 細(xì)胞，使其達(dá)到 1010個數(shù)量級。兩步法包括樣本取回后淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，以及培養(yǎng)一定程度后應(yīng)用 CD3 和同種異體單個核細(xì)胞刺激 TILs 快速增殖。成熟的培養(yǎng)方法的建立給以后的試驗性臨床應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。

初步分析肝癌內(nèi) TILs 的分子表型發(fā)現(xiàn)，大部分 TILs 中以 CD8+細(xì)胞為主，而有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織內(nèi)浸潤 CD8+細(xì)胞的數(shù)量與患者的預(yù)后呈正相關(guān)。也有人發(fā)現(xiàn)富集 CD8+細(xì)胞可以提高TILs 細(xì)胞殺傷惡性黑色素瘤細(xì)胞的功能［5］，而肝癌TILs 中 CD8+細(xì)胞數(shù)量與其功能的影響仍有待進(jìn)一步的研究。

實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在 CD3+CD8+細(xì)胞上可以檢測到 PD-1 的表達(dá)，而且高表達(dá) PD-1 組和低表達(dá) PD-1 組其分泌 IFN-γ 的能力有明顯不同，也就表示，TILs 表面 PD-1 的表達(dá)可以影響 TILs的功能。曾有人研究過惡性黑色素瘤內(nèi)浸潤 T 淋巴細(xì)胞表面 PD-1 的表達(dá)和功能的影響，結(jié)果證明腫瘤內(nèi)浸潤的腫瘤抗原特異性的 CD8 細(xì)胞高表達(dá)PD-1 且功能受損［6］。而本次實驗則發(fā)現(xiàn)在肝癌TILs 內(nèi)高表達(dá) PD-1 的 CD3+CD8+細(xì)胞其功能也受到影響，分泌 IFN-γ 的能力減弱。

PD 是 I 型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族CD28/CTLA-4 亞家族成員。人 PD-1 基因位于2q37，在正常狀態(tài)下 T、B 細(xì)胞不表達(dá)，但在活化狀態(tài)下誘導(dǎo)高表達(dá)。PD-1 和 TCR（T 細(xì)胞受體）結(jié)合可導(dǎo)致 SHP-2 的迅速磷酸化而抑制 TCR 信號，進(jìn)而傳遞負(fù)性信號，在外周免疫耐受的建立中有重要作用［7］。而 PD-1 如何通過通路傳遞信號影響肝癌 TILs 中 CD8+細(xì)胞的功能為下一步研究的重點。

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【Abstract】

ObjectiveTo explore a new method that can generate large scale tumor infiltrating lymphocytes （TILs） suitable for clinical use，and to analyze their molecular phenotype and biological function.

MethodsSingle cells were obtained by digesting freshly resected tumors of twenty hepatoma patients with mixed collagenase， and lymphocytes were then separated by the discontinuous density gradient centrifugation. TILs were expanded by two-step culturemethod. Molecular phenotype of generated TILs was tested by flow cytometry and the quantitation of IFN-γ secretion was detected by ELISA essay. The ability to secret IFN-γ from PD-1 high expressed TILs and PD-1 low expressed TILs was analysed afterwards.

ResultsThere were eighteen TILs samples reaching the 1010order of magnitude through two-step culture method. The proportion of CD3+TILs， CD3+CD56+TILs， CD3+CD4+TILs and CD3+CD8+TILs was （91.7 ± 7.4）%， （28.5 ± 11.7）%， （32.5 ± 19.6）% and （62.5 ± 29.1）%， respectively. The proportion of PD-1 expression in CD3+CD8+TILs was （23.5 ± 16.1）%. The quantitation of IFN-γ secretion in the expanded TILs was （827.8 ± 307.7） pg/ml， among which this IFN-γ values in six higher expressed PD-1 cases and nine lower expressed PD-1 cases of CD3+CD8+TILs were （478.6 ± 69.3） pg/ml and （1087.5 ± 249.6） pg/ml， respectively. The differences between these two groups had statistically significance （P ＜ 0.05）.

ConclusionIt is easy to expand TILs from primary hepatocarcinoma to a large scale number for clinical use by using the two-step culture method and the major population of the expanded TILs is CD3+CD8+T cells. In addition， the expresson of PD-1 in TILs are negatively correlated with its secretion of IFN-γ.

Author Affiliation： Cancer Biotherapy Department， The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450008，China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：324-328

Large scale amplication of the tumor infiltrating lymphocytes from primary hepatocarcinoma ex vivo and analysis of their biological characteristics

QIN Peng， CHAI Xiao-fei， WANG Zhao-yue， MAI Ling， GAO Quan-li

Lymphocytes， tumor-infiltrating；Interferon-gamma；Programmed cell death 1 receptor；Primary hepatocarcinoma

GAO Quan-li， Email： quanligao1@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.007

國家自然科學(xué)基金青年基金（81502468）

450008 鄭州大學(xué)附屬河南省腫瘤醫(yī)院生物治療中心

高全立，Email：quanligao1@aliyun.com

2016-02-22