鏈霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的混料設(shè)計(jì)與研究

金偉，鄭長(zhǎng)春，郭強(qiáng)，高春慧，祈維蓉，柏莉娟，周東東，郭雷，盧春玲，郭曉梅，王靜，柏莉欣，王剛

·技術(shù)與方法·

鏈霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的混料設(shè)計(jì)與研究

金偉，鄭長(zhǎng)春，郭強(qiáng)，高春慧，祈維蓉，柏莉娟，周東東，
郭雷，盧春玲，郭曉梅，王靜，柏莉欣，王剛

鏈霉素發(fā)酵工業(yè)已經(jīng)有了比較長(zhǎng)的歷史，發(fā)展至今研究投入較大，生產(chǎn)水平也逐年增長(zhǎng)，它的菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程牽涉到一系列的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程［1］，包含著復(fù)雜的質(zhì)量和能量傳遞，所以對(duì)其發(fā)酵過(guò)程難以進(jìn)行人為控制，使得在具體生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中主要以經(jīng)驗(yàn)作為依據(jù)，而理論知識(shí)方面較為匱乏。由于后來(lái)耳毒性的發(fā)現(xiàn)，各個(gè)國(guó)家對(duì)鏈霉素的產(chǎn)量和使用量開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降［2］，但是近年來(lái)由于化學(xué)農(nóng)藥污染較為嚴(yán)重，各個(gè)國(guó)家開(kāi)始研究易分解、殺菌譜廣和藥效強(qiáng)的生物農(nóng)藥，正是由于鏈霉素的這些優(yōu)點(diǎn)，它逐漸開(kāi)始廣泛地應(yīng)用于農(nóng)牧行業(yè)，并且取得了非常好的效果。鏈霉素的獲得主要是通過(guò)對(duì)灰色鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)，灰色鏈霉菌從培養(yǎng)基獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)組分和能量來(lái)合成鏈霉素，所以適宜的培養(yǎng)基成分和比例對(duì)于鏈霉素生產(chǎn)水平的提高至關(guān)重要?；炝显O(shè)計(jì)是一種研究配料中各組分的最佳比例的科學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，因子是配料中的組分或分量［3］，可以深入研究成分對(duì)響應(yīng)目標(biāo)值的影響，以及各個(gè)成分之間的交互作用。應(yīng)用傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)方法，比如單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)等，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且效率不高，無(wú)法精確地求取最優(yōu)值，但是應(yīng)用科學(xué)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法就非常方便和高效。近幾年來(lái)風(fēng)靡全球企業(yè)的六西格瑪科學(xué)管理方法，其中很重要的一部分就是試驗(yàn)設(shè)計(jì)理論，尤其是在研發(fā)領(lǐng)域［4］的應(yīng)用效果更是得到了高度的評(píng)價(jià)。六西格瑪工具中有一專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)模塊，可以完成混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)的整個(gè)過(guò)程，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，依據(jù)分析結(jié)果建立變量曲線(xiàn)方程，最后利用響應(yīng)優(yōu)化器求得最優(yōu)值，能在最短的時(shí)間內(nèi)利用最科學(xué)的理論方法得到所需要的目標(biāo)值［5］，此種試驗(yàn)設(shè)計(jì)可廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥和材料等各個(gè)涉及配方配比的領(lǐng)域。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器XHPC-3.22 型滅菌柜為山東淄博Shinva 公司產(chǎn)品；722N 型可見(jiàn)分光光度計(jì)為上海精科公司產(chǎn)品；SPH-3112 型雙層搖瓶機(jī)為上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司產(chǎn)品；L-530 型高速離心機(jī)為湘儀公司產(chǎn)品；PB-10 型 pH 計(jì)為德國(guó) Sartorius 公司產(chǎn)品；SBA-40E 型生物傳感分析儀為山東省科學(xué)院生物研究所產(chǎn)品。

1.1.2菌株供試菌種灰色鏈霉菌來(lái)自山東魯抗集團(tuán)鏈霉素生產(chǎn)車(chē)間菌種保藏室。

1.1.3試劑鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于 98%）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；葡萄糖、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸羥胺和硫酸鐵銨均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；低溫黃豆餅粉為濟(jì)寧雙華工貿(mào)公司工業(yè)級(jí)產(chǎn)品；碳酸鈣為上海美宇牌工業(yè)級(jí)產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基組成為葡萄糖 30 g/L、低溫黃豆餅粉 25 g/L、硫酸銨 4 g/L、碳酸鈣 5 g/L、硫酸二氫鉀 0.4 g/L、氯化鈉 2 g/L。先用蒸餾水溶解無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，然后邊攪拌邊加入黃豆餅粉、碳酸鈣和葡萄糖，攪拌均勻，pH 自然，115 ℃ 滅菌 30 min。

1.2.2培養(yǎng)方法對(duì)甘油管保藏的菌株進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑾♂尪葹?10-4的菌液涂布平板，在 27 ℃，濕度 30% ～ 50% 條件下培養(yǎng) 7 d，獲得單菌落。選取豐滿(mǎn)、白色、梅花狀、邊緣齊整的中型單菌落孢子，在無(wú)菌條件下用接種針接種于搖瓶中，然后在 27 ℃ 的恒溫?fù)u瓶間內(nèi)振蕩培養(yǎng) 68 h，取樣進(jìn)行鏈霉素含量測(cè)定，搖床轉(zhuǎn)速為 220 ～ 240 r/min，搖瓶間濕度 30% ～ 50%。

1.2.3鏈霉素的含量測(cè)定采用分光光度法，利用鏈霉素特有的麥芽酚反應(yīng)［6］進(jìn)行檢測(cè)。首先將發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)?15 ml 置于離心管中，加入草酸酸化，酸化至 pH = 3 左右，于水浴鍋中 75 ℃ 保溫 10 min，冷卻至室溫，于離心機(jī)中 5000 r/min 離心 20 min，準(zhǔn)備兩支干凈的試管，分別吸取 5 ml 離心后的上清液置于試管中，向其中一支試管加入 1 滴 4% 鹽酸羥胺作為空白對(duì)照，再向兩支試管中分別加入 1 ml 氫氧化鈉溶液（2 mol/L），振蕩搖勻，于水浴鍋中 85 ℃ 保溫 15 min，冷卻至室溫，再加入 1% 硫酸鐵銨 2 ml，振蕩搖勻，靜置 10 min，在分光光度計(jì)中設(shè)定520 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算發(fā)酵液鏈霉素的效價(jià)。

1.2.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法以 Minitab 軟件［7］實(shí)現(xiàn)單純形格子設(shè)計(jì)是混料回歸設(shè)計(jì)方案中最先出現(xiàn)的，也是最基本的設(shè)計(jì)方案，很多其他設(shè)計(jì)方案的構(gòu)成要用到單純形格子設(shè)計(jì)［8］。在（n - 1）維正規(guī)單純形（有 n 個(gè)頂點(diǎn)）d 階格子點(diǎn)集｛n，d｝中各格子點(diǎn)的正規(guī)單純形坐標(biāo)（重心坐標(biāo)）的計(jì)算中，取 n 個(gè)互相正交的單位向量，a1=（1，0，...，0），a2=（0，1，...，0），...，an=（0，0，...，1），則這 n 個(gè)單位向量的頂點(diǎn)便圍成一個(gè)（n - 1）維正規(guī)單純形，此正規(guī)單純形上任一點(diǎn) A 都可以表示為 A = i1a1+ i2a2+... + inan=（i1，i2，...，in），其中 i1，i2，...，in≥ 0，i1+ i2+ ... + ip= 1，當(dāng) i1，i2，...，in都取分母是 d 的分?jǐn)?shù)時(shí)，即

則表達(dá)式 A 所確定的總體就是（n - 1）維正規(guī)單純形的 d 階格子點(diǎn)集｛n，d｝，也就是說(shuō)可以算出｛n，d｝中各點(diǎn)的單純形坐標(biāo)系的坐標(biāo)［9］。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)借助 Minitab 15 六西格瑪輔助軟件工具進(jìn)行混料單純形格點(diǎn)設(shè)計(jì)，根據(jù)魯抗鏈霉素生產(chǎn)車(chē)間現(xiàn)有培養(yǎng)基配方，碳源和氮源的配比總和范圍為 1% ～ 10%，碳源為葡萄糖，氮源為黃豆餅粉和硫酸銨，在此配方基礎(chǔ)上，通過(guò)混料設(shè)計(jì)進(jìn)一步研究這 3 種變量的最優(yōu)配比組合，以進(jìn)一步提高鏈霉素的發(fā)酵效價(jià)，增加公司盈利，所以這 3 種因子的單獨(dú)取值范圍為 1% ～ 8%，得到的設(shè)計(jì)方案如圖 1 所示，3 維度共 13 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

圖1　單純形設(shè)計(jì)圖（按數(shù)量）

2　結(jié)果

2.1Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法

2.1.1設(shè)計(jì)與分析利用 Minitab 軟件，按照 Minitab →Stat → DOE → Factorial design → Plackett-Burman design的順序，對(duì)黃豆餅粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈣、起始 pH 七個(gè)因素進(jìn)行考察，采用試驗(yàn)次數(shù) n = 12 的設(shè)計(jì)［10］，每個(gè)因素取 -1 和 +1 兩個(gè)水平，響應(yīng)值為效價(jià)（Y）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表 1，各因素水平及主效應(yīng)分析見(jiàn)表 2。

由表 2 分析結(jié)果可知，主效應(yīng)的 F 值為 13.31，P 值為 0.012，說(shuō)明主效應(yīng)是顯著的，分析效果較好，再看具體的因素，t 檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生正效應(yīng)的因素為：黃豆餅粉、葡萄糖和起始 pH。產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的因素為：硫酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和氯化鈉。在灰色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生鏈霉素的發(fā)酵過(guò)程中，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖三個(gè)因素對(duì)鏈霉素的效價(jià)影響較為顯著，應(yīng)取這三個(gè)因素作為下一步混料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。其他因素則根據(jù)各因素 t 檢驗(yàn)效應(yīng)的正負(fù)來(lái)取相應(yīng)的高值或低值［11］，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值，此時(shí)效價(jià)的平均值為 2803 U/ml。

表1　Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2　Plackett-Burman 因素水平及主效應(yīng)分析

2.1.2Pareto 圖Minitab 在 Pareto 圖中顯示效應(yīng)的絕對(duì)值，如圖 2，Pareto 圖使用相同的 α 作為正態(tài)圖來(lái)確定效應(yīng)的顯著性大小，其中響應(yīng)值為效價(jià)，α = 0.05。

由圖 2 可以看出，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖的效應(yīng)較為顯著，其中黃豆餅粉的效應(yīng)最大，硫酸銨其次，葡萄糖在三者中效應(yīng)最小。

2.1.3殘差分析由圖 3 可以看出，效價(jià)殘差的正態(tài)性檢驗(yàn)概率圖符合正態(tài)分布規(guī)律，直線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了95.88%，在殘差與擬合值圖中，殘差無(wú)規(guī)則地在水平軸上下隨機(jī)波動(dòng)（圍繞 0），沒(méi)有出現(xiàn)絕對(duì)數(shù)超過(guò) 3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的異常點(diǎn)［12］，說(shuō)明模型的適合性較好。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的 Pareto 圖

2.2混料設(shè)計(jì)

2.2.1混料實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果13 次混料試驗(yàn)［13］中，三種原材料的配比見(jiàn)表 3，其他原材料按照 2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果中的效應(yīng)正負(fù)取相應(yīng)的數(shù)值，考察三種原料按不同比例對(duì)效價(jià)和細(xì)菌濃度的影響。

由表 3 的結(jié)果可以看出，三種原料按不同的比例混合對(duì)效價(jià)和細(xì)菌濃度有著不同的影響。效價(jià)最大值出現(xiàn)在第4 次實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中，為 3329 U/ml；細(xì)菌濃度最大值出現(xiàn)在第2 次實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中，為 57%。

2.2.2不同原材料配比對(duì)效價(jià)的影響利用 Minitab 軟件中的混料設(shè)計(jì)分析選項(xiàng)可對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析擬合，模型中的分量項(xiàng)為完全立方模式，舍棄掉不顯著項(xiàng)（P ＞ 0.05）AD、ABD 和 BD（B - D）之后，得到關(guān)于效價(jià)和原料的模型如下：

模型的 F 值為 27.38，P 值為 0.011，說(shuō)明模型能較好地反映實(shí)際，模型方程的相關(guān)系數(shù) r2= 98.74%，說(shuō)明方程擬合度較高，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)該模型方程能夠較準(zhǔn)確地解釋響應(yīng)值的變化情況，可用來(lái)進(jìn)行響應(yīng)值分析和下一步預(yù)測(cè)。

混料設(shè)計(jì)可以根據(jù)各組分的三元等值線(xiàn)圖［14］直觀地觀察各組分間的變化對(duì)指標(biāo)的影響，通過(guò)響應(yīng)的等值線(xiàn)圖，可以直觀地看出原材料的不同配比對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖的比例變化對(duì)于效價(jià)的等值線(xiàn)圖見(jiàn)圖 4。

由圖 4 可以看出，不同的配比對(duì)效價(jià)有著不同的影響，在硫酸銨取值較大時(shí)效價(jià)取較小值，隨著硫酸銨比例的減少，效價(jià)值越來(lái)越大，最大的效價(jià)取值出現(xiàn)在兩個(gè)區(qū)域，分別在黃豆餅粉和葡萄糖取較大值時(shí)。

圖3　效價(jià)殘差圖

表3　混料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

圖4　效價(jià)的混合等值線(xiàn)圖

圖5　細(xì)菌濃度的混合等值線(xiàn)圖

2.2.3不同原材配比對(duì)細(xì)菌濃度的影響同樣利用 Minitab中的分析混料設(shè)計(jì)功能，模型中的分量項(xiàng)為二次［15］，得到關(guān)于細(xì)菌濃度和原料的模型方程：

表4　目標(biāo)響應(yīng)設(shè)置

模型的 F 值為 11.03，P 值為 0.005，說(shuō)明模型能較好地反映實(shí)際，模型方程的相關(guān)系數(shù) r2= 95.3%，說(shuō)明方程擬合度較高。

通過(guò)響應(yīng)的等值線(xiàn)圖，可以直觀地看出原材料的不同配比對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖的比例變化對(duì)于細(xì)菌濃度的等值線(xiàn)圖見(jiàn)圖 5。

由圖 5 可以看出，在黃豆餅粉取較大值時(shí)細(xì)菌濃度取較小值，硫酸銨取較大值時(shí)細(xì)菌濃度也取較大值，而細(xì)菌濃度為 40% 出現(xiàn)在三角等值圖的中間區(qū)域。

2.2.4響應(yīng)值的優(yōu)化基于建立的擬合度較高的模型方程［16］，利用 Minitab 中的響應(yīng)優(yōu)化器功能，可以求得在所研究區(qū)域內(nèi)獲得目標(biāo)響應(yīng)值時(shí)的各組分具體取值，在響應(yīng)優(yōu)化器的參數(shù)設(shè)定各個(gè)指標(biāo)的優(yōu)化目標(biāo)，具體目標(biāo)設(shè)置如表 4。

通過(guò)響應(yīng)優(yōu)化器功能，得到最優(yōu)解為黃豆餅粉 = 0.0262626，硫酸銨 = 0.0196400，葡萄糖 = 0.0540974。響應(yīng)值效價(jià)= 3225.13，合意性 = 0.912626，細(xì)菌濃度 = 39.97，合意性 = 0.999078；復(fù)合合意性 = 0.954874。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)各個(gè)參數(shù)的優(yōu)化效果，在所確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配比下進(jìn)行了五個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)，最佳培養(yǎng)基配方和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 5 和表 6。

由表 5 和表 6 可以看出，在 Minitab 設(shè)計(jì)的最佳培養(yǎng)基配方的條件下，各個(gè)批次實(shí)驗(yàn)的效價(jià)（Y）與模型效價(jià)的相對(duì)誤差均小于 3.0%，平均相對(duì)誤差為 1.58%，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)與實(shí)際取值較為吻合。五個(gè)批次的平均效價(jià)為3335.30 U/ml，與 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)中的平均效價(jià)為2803 U/ml 相比提高了 18.9%，而五個(gè)批次的菌濃分別為38%、40%、36%、41% 和 42%，均在 40% 左右，未出現(xiàn)明顯偏差，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較好，具有可重復(fù)性，說(shuō)明混料設(shè)計(jì)優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)基配比對(duì)于效價(jià)的提高和目標(biāo)細(xì)菌濃度值的獲得有著較好的效果。

表5　最佳培養(yǎng)基配方

表6　最佳配方條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　討論

本研究首先利用 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選出影響效價(jià)的最主要因素（黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖），然后進(jìn)行混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，利用 Minitab 軟件的繪圖功能直觀地觀察出響應(yīng)值隨變量的變化趨勢(shì)，最后利用響應(yīng)優(yōu)化器功能確定模型方程的最值點(diǎn)，也就是所研究因子水平范圍內(nèi)的響應(yīng)值的目標(biāo)點(diǎn)。混料設(shè)計(jì)中的單純形格子設(shè)計(jì)能夠?qū)?shí)驗(yàn)點(diǎn)取在正規(guī)單純形的格點(diǎn)上，這樣就保證了選取的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)能夠均勻分布，且計(jì)算快捷準(zhǔn)確，從而在各個(gè)行業(yè)被廣泛采用［17］。利用 Minitab 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其本質(zhì)上是一種合理安排實(shí)驗(yàn)和科學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)過(guò)程，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行科學(xué)合理設(shè)計(jì)［18］，實(shí)驗(yàn)的規(guī)模較小，實(shí)驗(yàn)的成本低，實(shí)驗(yàn)的次數(shù)也較少，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單快捷，實(shí)驗(yàn)周期短，效率高，能夠得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和正確的結(jié)論。

鏈霉素雖然是一種老產(chǎn)品，但是由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，成為一種常見(jiàn)的抗生素類(lèi)殺菌劑，可以防治細(xì)菌病害，目前在國(guó)內(nèi)外仍有巨大的市場(chǎng)。但是目前鏈霉素發(fā)酵生產(chǎn)存在著諸多問(wèn)題，關(guān)鍵之一就是要解決生產(chǎn)成本，合理安排培養(yǎng)基組成和配比，提高產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，但是由于其發(fā)酵工藝復(fù)雜，很難完全靠單一方法解決，因此將化學(xué)方法、儀器分析、生物分析和計(jì)算機(jī)模擬相結(jié)合是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.016

272000 濟(jì)寧，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)研發(fā)中心

金偉，Email：jinwei0538@163.com

2016-03-09