HPLC測定不同干燥方法亳菊中5種成分的含量*

鄭　娟，王國凱，劉勁松，張　偉

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽　合肥　230012)

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分析測試

HPLC測定不同干燥方法亳菊中5種成分的含量*

鄭娟，王國凱，劉勁松，張偉

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽合肥230012)

通過高效液相色譜法建立測定不同干燥方法亳菊中綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素、木犀草苷和金合歡素的含量的方法。采用菲羅門C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1% 磷酸水為流動相，梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長325 nm，柱溫30 ℃。綠原酸41.50～0.83×103μg·mL-1木犀草苷2.45～122.50 μg·mL-1、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?5.78～1.58×103μg·mL-1、木犀草素327.33～1.96×103μg·mL-1、金合歡素7.62～762 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程分別為y=3.3257x-10.6227 (r=1.0000)、y=0.9865x+0.1356 (r=1.0000)、y=3.6681x-27.6275 (r=0.9999)、y=1.2538x-4.3563 (r=1.0000)和y=3.6216x-1.2515 (r=1.0000)。加樣回收率分別為97.97%、97.49%、97.79%、98.27%、98.90%，RSD均小于5%。該方法快速，簡便，重復(fù)性好，適合于同時測定亳菊中綠原酸、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、木犀草苷和金合歡素的含量。

亳菊；綠原酸；3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸；木犀草素；木犀草苷；金合歡素

菊花為菊科植物ChrysenthemummorifkliumRamat.的干燥頭狀花序，是藥食同源的植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性平，味甘，微苦，歸肺、肝經(jīng)，具有疏風清熱、平肝明目的功效，用于風熱表證，溫病初起，目赤腫痛、目暗昏花，頭目眩暈[1]。2015年版中國藥典按產(chǎn)地和加工方法，分為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊和懷菊[2]。9-11月花盛開時分批采收，陰干或焙干，或熏、蒸后曬干[3-7]。亳菊因霜期較早，易受霜害變色，霉變，因此需要一種不影響有效成分含量的干燥方法。木犀草素、金合歡素等黃酮類成分是菊花中主要活性成分[8]，文獻報道[9-13]的基礎(chǔ)上，本文通過高效液相色譜法建立不同的干燥方法測定亳菊中綠原酸、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、木犀草苷和金合歡素的含量的方法，結(jié)合15版藥典一部，增加了木犀草苷和金合歡素的含量測定，以便更全面的、更快速的檢測菊花的質(zhì)量，為下一步研究提供依據(jù)。

1　儀器與材料

Agilent1260高效液相色譜儀,色譜柱為菲羅門C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AS3120超聲清洗儀,天津奧特賽恩斯；甲醇及乙腈(色譜純)；水為市售娃哈哈純凈水；CP225D十萬分之一電子天平,德國賽多利斯。綠原酸對照品(批號CF1026，純度≧98%),武漢天植生物技術(shù)有限公司；3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品(批號CF0973，純度≧98%),武漢天植生物技術(shù)有限公司;木犀草素對照品(批號：111520-200504),中國藥品生物制品檢定研究院；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(批號CF0919，純度≧98%),武漢天植生物技術(shù)有限公司、金合歡素對照品(純度≧98.5%)，武漢天植生物技術(shù)有限公司。亳菊藥材采自亳州，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定為Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel. ‘Boju’cv.nov. 的干燥頭狀花序。

2　方法與結(jié)果

2.1亳菊的不同加工方法

2.1.1陰干品的制備

亳菊于陰涼通風處至完全干燥。

2.1.2不同溫度干燥品的制備

取200 g新鮮的亳菊分別放入恒溫鼓風干燥箱內(nèi)，分別設(shè)置干燥溫度為40、50、60、70、80、90和100 ℃，干燥至重量小于15%鮮重，即為完全干燥，粉碎，待用。

2.2含量測定

2.2.1色譜條件

菲羅門C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈為流動相A，0.1%磷酸水為流動相B，按表1梯度洗脫；檢測波長：325 nm，柱溫30 ℃，理論板數(shù)按3,5-O-二咖啡?；鼘幩岱逵嬎銘?yīng)不低于8000；流速：1.0 mL·min-1。

表1　流動相梯度洗脫條件

2.2.2供試品溶液的制備

取藥材粗粉(過一號篩)1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，第一次精密加入70%甲醇50 mL，回流提取1.5 h，第二次加入甲醇40 mL，回流提取1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮，70%甲醇定容至25 mL，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品4.15 mg、木犀草苷對照品2.45 mg、3,5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌?.89 mg，木犀草素對照品9.82 mg、金合歡素對照品3.81 mg分別置5 mL棕色容量瓶中，加入70%甲醇溶解后定容，搖勻，即得各對照品儲備液。分別精密移取綠原酸對照品3 mL、木犀草苷對照品1 mL，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品0.5 mL，木犀草素對照品3 mL、金合歡素對照品2 mL置10 mL的容量瓶中，加70%甲醇稀釋定容，搖勻，即得混合對照品儲備液。

2.2.4系統(tǒng)適應(yīng)性

吸取制備的供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進行測定，HPLC圖譜見圖1。由圖1可知各成分分離度良好，與其他成分達到完全分離。

圖1混合對照品(A)及亳菊樣品(B)的HPLC圖

Fig.1Chromatograms of the mixed solution of reference substance (A) and the sample solution ofDendranthemamorifolium(B)

2.2.5標準曲線的繪制

精密移取混合對照品儲備液10 mL，5 mL，2.5 mL，0.5 mL，0.25 mL，0.025 mL分別置10 mL的容量瓶定容，精密吸取上述各溶液20 μL進樣。以峰面積(y)對綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、金合歡素濃度(x)進行線性回歸，計算各組分的回歸方程，結(jié)果見表2。其線性范圍分別為綠原酸41.50～0.83×103μg·mL-1、木犀草苷2.45～122.50 μg·mL-1、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?5.78～1.58×103μg·mL-1、木犀草素327.33～1.96×103μg·mL-1、金合歡素7.62～762 μg·mL-1。

表2　5種成分標準曲線

2.2.6精密度試驗

取同一供試品溶液重復(fù)進樣5次，每次20 μL，測定峰面積，計算RSD值。綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?，木犀草素、金合歡素精密度RSD值分別為1.23%、0.99%、1.91%、0.33%、0.42%。表明本法精密度良好。

2.2.7重復(fù)性試驗

按供試品制備方法制備同一供試品5份，分別進樣20 μL，測定峰面積，計算RSD值。綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩幔鞠菟?、金合歡素重復(fù)性結(jié)果RSD值分別為0.59%、0.88%、1.57%、3.09%、2.60%。表明本法重復(fù)性良好。

2.2.8穩(wěn)定性試驗

取對照品溶液分別于 0、3、6、9、12和24 h測定峰面積，計算RSD值。綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸，木犀草素、金合歡素穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD值分別為1.83%、0.42%、1.41%、0.79%、0.30%。表明本法穩(wěn)定性良好。

2.2.9加樣回收率試驗

取已測知含量的藥材，精密稱定，然后按樣品溶液制備方法制備，分別精密加入混合對照品溶液適量，分為高、中、低濃度加樣回收，測定，計算出回收率。綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?，木犀草素、金合歡素回收率分別為97.97%、97.49%、97.79%、98.27%、98.90%。RSD值分別為1.92%、0.86%、1.31%、3.44%、1.44%。表明本法回收率良好。

表3　加樣回收率試驗(n=6)

3　結(jié)　果

不同干燥方法的亳菊中綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素、金合歡素的含量各不同，結(jié)果見表4和圖2。

表4　亳菊樣品的含量測定結(jié)果

圖2　亳菊樣品的含量測定結(jié)果

4　討　論

根據(jù)2015年版藥典規(guī)定按干燥品計算綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量分別不低于0.20%、0.080%、0.70%，陰干組分別為1.83%、0.26%、9.06%，40 ℃烘干組分別為0.21%、0.10%、0.18%，50 ℃烘干組含量分別為0.13%、0.07%、0.12%，60 ℃烘干組含量分別為0.13%、0.06%、0.13%，70 ℃烘干組含量分別為0.11%、0.04%、0.06%，80 ℃烘干組含量分別為0.14%、0.06%、0.13%，90 ℃烘干組含量分別為0.18%、0.06%、0.05%，100 ℃烘干組含量分別為0.20%、0.04%、0.11%，故以陰干組最佳。木犀草素以陰干組含量最高，烘干后木犀草素會明顯降低。金合歡素以50 ℃烘干時含量最高，90 ℃烘干時含量次之，超過陰干組含量。由表4及圖2可知，以該方法測量的陰干組、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃烘干組中綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、金合歡素總含量以新鮮菊花陰干含量最高，經(jīng)過烘干加工后的亳菊總含量均下降，因此以烘干方法加速菊花的干燥工藝有待進一步研究。探索出溫度對各組分的影響過程，才能更好地在干燥菊花的同時盡量不降低菊花中有效部位含量。

本實驗分別考察了藥典中的超聲方法和回流提取作對比，發(fā)現(xiàn)回流方法要比超聲提取物程中發(fā)現(xiàn)，以新鮮菊花所做的陰干組陰干所用時間最長，其次是40 ℃烘干時間，并且40 ℃烘干后易返潮，霉變。100 ℃烘干后菊花色澤明顯變焦化趨勢，以新鮮菊花陰干和50 ℃烘干色澤最好。通過文獻[14]測定綠原酸的紫外吸收峰為330 nm，以及文獻[15-16]測定綠原酸時，選擇的325 nm，綜合考慮選擇325 nm作為本實驗的檢測波長，實驗結(jié)果顯示在此波長下的各測定成分的含量變化和峰面積響應(yīng)以及線性都較好。HPLC 同時測定提取物中綠原酸、3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒛鞠菟?、木犀草苷、金合歡素的含量，實驗結(jié)果的精密度、線性關(guān)系、重復(fù)性、回收率數(shù)據(jù)均符合測定要求，因此，該實驗方法可快速準確地為菊花的質(zhì)量控制和臨床使用提供重要的參考數(shù)據(jù)。

[1]林慧彬,鐘方曉,王學榮,等.菊花的本草考證[J].中醫(yī)研究,2005,18(1):27-29.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:310.

[3]王德群,劉守金,梁益敏.中國藥用菊花采集加工方法考察[J].中藥材,1999,22(9):452-454.

[4]何先元,郭巧生,徐文斌,等.道地藥材菊花形成的原因[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2005,12(10): 54-55.

[5]Miyazawa M,Hisama M.Antimutagenic activity of flavonoids from Chrysanthemum morlium[J].Biosci Biotechnol Biochem,2003,67(10):2091-2099.

[6]Kim H J, Lee Y S. Identification of new dicaffeoylquinic acids from Chrysanthemum morlium and their antioxidant activities[J].Planta Med,2005,71(9):871-876.

[7]陸兔林,寧子琬,單鑫.硫磺熏蒸對中藥材化學成分和藥理作用影響的研究進展[J]. 中國中藥雜志,2014,39(15):2796-2800.

[8]申海進,郭巧生,房海靈,等.RP_HPLC測定野菊花中槲皮素_木犀草素_芹菜素和刺槐素[J].中國中藥雜志,2010,35(2):191-193.

[9]吳德玲,金傳山,李瓊,等. SHPLC法同時測定菊花中4種黃酮的含量[J].中藥材,2011,34(10): 1556-1558.

[10]金傳山,吳德林,俞年軍,等.不同加工方法對亳菊黃酮類成分含量影響[J].中藥材,2012,35(5):702-704.

[11]劉金旗,吳德林,王蘭,等.菊花中黃酮苷的含量分析[J].中草藥,2001, 32 (4): 308-310.

[12]王巖,謝媛媛,孫嘉鴻,等.菊花提取物中總黃酮與總有機酸的含量測定[J].沈陽藥科大學學報,2011, 28(2):124-129.

[13]彭貴龍,周光明,秦紅英.HPLC同時測定藥用白菊花中綠原酸_木犀草素_芹菜素和金合歡素[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014(7):1067-1071.

[14]何雅君,蘇娟,楊茜,等.HPLC同時測定山楂提取物中綠原酸和牡荊素鼠李糖苷的含量[J].中國中藥雜志, 2012, 37(6):829-831.

[15]于嬌.亳菊元素分析及指紋圖譜的研究[D].合肥:安徽中醫(yī)藥大學,2014:37-52.

[16]況作品,周亞菁,謝曉梅,等.高效液相色譜法測定木瓜水溶性有機酸含量的樣品處理方法研究[J].安徽醫(yī)藥,2016(01):54-57.

Determination of Five Components inDendranthemamorifoliumUsing Different Dry Methods by HPLC*

ZHENGJuan,WANGGuo-kai,LIUJin-song,ZHANGWei

(School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Key Laboratory for Modern Chinese Materia Medica, Anhui Hefei 230012, China)

A sensitive and specific high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed to determine chlorogenic acid, 3,5-Dicaffeoyl quinic acid, luteolin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and acacetin inDendranthemamorifolium．The sample was extracted by reflux extraction. The chromatographic separation was carried out on a Phenomenex C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid as mobile phases at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The UV detection wavelength was set at 325 nm，and the column temperature was set at 30 ℃. The linear correlation equations for chlorogenic acid, 3,5-dicaffeoyl quinic acid, luteolin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and acacetin were y=3.3257x-10.6227 (r=1.0000), y=0.9865x+0.1356 (r=1.0000), y=3.6681x-27.6275 (r=0.9999), y=1.2538x-4.3563 (r=1.0000)和y=3.6216x-1.2515 (r=1.0000), respectively. A good linearity was obtained over the range of 41.50～0.83×103μg·mL-1, 2.45～122.50 μg·mL-1, 15.78～1.58×103μg·mL-1, 327.33～1.96×103μg·mL-1, 7.62～762 μg·mL-1, respectively. The recoveries of were 97.97%, 97.49%, 97.79%, 98.27%, and 98.90%, respectively. RSD both were less than 5%. The developed HPLC method was quick, simple and reproducible for the simultaneous determination of Chlorogenic acid, 3,5-dicaffeoyl quinic acid, luteolin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and acacetin inDendranthemamorifolium.

dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel.‘Boju’cv. nov.; Chlorogenic acid; 3,5-dicaffeoyl quinic acid; luteolin; luteolin-7-O-β-D-glucoside; acacetin

安徽省科技攻關(guān)項目(1031043016)；國家自然青年基金(81303229)。

鄭娟(1989-)，女，藥物化學專業(yè)研究生。

劉勁松，副教授，主要研究方向：藥物化學。

R284.2

B

1001-9677(2016)012-0108-03