黃腐酸處理對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用及對蘋果樹防御酶活性的影響

陳　臻,　侯寶宏,　王衛(wèi)雄,　徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 蘭州　730070)

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黃腐酸處理對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用及對蘋果樹防御酶活性的影響

陳臻#,侯寶宏#,王衛(wèi)雄,徐秉良*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 蘭州730070)

黃腐酸作為一種廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑,具有穩(wěn)定可靠的抗逆增產(chǎn)效果。本試驗以黃腐酸為生長調(diào)節(jié)劑,研究其對蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)的抑制作用及對蘋果樹皮抗腐爛病的影響。試驗結(jié)果表明,黃腐酸能抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲的生長,濃度越大抑制效果越明顯。經(jīng)黃腐酸處理后,蘋果樹腐爛病組織中SOD、POD、PAL和CAT均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中黃腐酸處理后SOD活性于14 d達到峰值,而其他酶活性均在21 d達到最大值。說明黃腐酸能顯著提高蘋果樹體內(nèi)相關(guān)防御酶系的活性,很大程度上提高了植物的免疫力,即增強了蘋果樹的抗病性。

黃腐酸;蘋果樹腐爛病菌;抑制作用;防御酶

近20年來,我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。自1993年起,無論種植面積還是總產(chǎn)量,均名列世界第一。2008年,據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計,我國蘋果栽培面積和產(chǎn)量為199.22萬hm2和984.66萬t,分別占世界蘋果栽培總面積和總產(chǎn)量的41.09%和42.88%,屬世界第一大蘋果生產(chǎn)國。但隨著蘋果樹大面積種植,蘋果樹腐爛病已經(jīng)成為限制蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要因素[1]。2013年,研究者對我國13個重點蘋果園調(diào)查發(fā)現(xiàn),輕者發(fā)病率25%～35%,重者達70%～80%,平均發(fā)病率株60%以上[2]。目前,生產(chǎn)上對蘋果樹腐爛病的防治主要采用化學(xué)防治,如福美胂,但福美胂由于毒性大、殘留多而被禁用,因此,尋求一種誘導(dǎo)蘋果樹產(chǎn)生抗性,并對環(huán)境友好的高效肥或防治藥劑已成為熱點問題。

黃腐酸(fulvic acid, FA)是一種既溶于酸性溶液,又溶于堿性溶液的腐植酸,也是一種兼有植物生長調(diào)節(jié)劑功能的新型肥料。有關(guān)研究表明,在果樹葉面噴施黃腐酸既可提高產(chǎn)量,又能增強多種果樹的抗性[3]。馬煥普等[3]在葡萄葉面噴施黃腐酸,降低了白腐病發(fā)病率,表明其可能影響了葡萄生理作用。有關(guān)研究也表明,黃腐酸還能增加酶活性和酚酸類抗性物質(zhì)的含量,改善植物的新陳代謝過程[4]。此外,黃腐酸作為一種富含高活性物質(zhì)的腐植酸,其不僅具有腐植酸的一般特征,又具有分子量小易被生物吸收、功能團生理活性大、易溶于水等特征,并且能夠抑制病菌DNA的復(fù)制,減少植株發(fā)病幾率,誘導(dǎo)作物免疫力提高,增強植株抗病能力[5],因此黃腐酸在農(nóng)業(yè)中的用途很廣泛[6]。本試驗通過測定黃腐酸對蘋果腐爛病菌的抑制作用和施用黃腐酸后蘋果樹腐爛病組織中各種防御酶系SOD、POD、PPO、PAL和CAT含量變化,研究了黃腐酸對蘋果樹皮抗腐爛病的影響,以期為今后蘋果樹腐爛病的綠色防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試果樹品種

蘋果樹品種為‘新紅星’,樹齡為18～21年,種植于蘭州市七里河區(qū)彭家坪蘋果基地。

1.1.2供試菌株

蘋果樹腐爛病菌(Valsamali) LZ29菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院病原學(xué)實驗室提供。

1.1.3供試藥劑

黃腐酸(有效成分為50 g/L,永業(yè)科學(xué)研究院) 600倍稀釋液、0.05 mol/L pH 7.8 磷酸緩沖液、130 mol/L 甲硫氨酸、750 μmol/L氮藍四唑(NBT)、100 μmol/L核黃素、100 μmol/LEDTA-Na2、PVP溶液、0.05 mol/L pH 6.5 磷酸緩沖液、0.3%的愈創(chuàng)木酚、0.6% H2O2、0.05 mol/L硼酸鹽緩沖溶液(pH 8.8)、0.02 mol/L 苯丙氨酸、0.05 mol/L鄰苯三酚、pH 6.8 磷酸緩沖溶液、0.067 mol/L H2O2。

1.1.4試驗儀器

TU-1810紫外分光光度計、石英比色皿、恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機。

1.2試驗方法

1.2.1黃腐酸抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法:將黃腐酸制成不同濃度的溶液,然后按照一定比例加入到熔融的PDA培養(yǎng)基中搖勻制成平板,配制成終濃度為100、50、33、25、20 μg/mL的含藥平板。用打孔器(d=5 mm)在活化5 d的蘋果樹腐爛病菌菌落邊緣打取菌餅,接種于含藥PDA平板中央,每個濃度梯度為1個處理,每個處理設(shè)5個重復(fù),以無菌水代替黃腐酸作為對照。接種后將平板置于25℃培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)3 d,采用十字交叉法測量蘋果樹腐爛病菌菌落直徑,并計算各處理的抑菌率[79]和致死中濃度EC50[10]。

1.2.2黃腐酸對蘋果樹防御酶活性的影響

試驗地位于蘭州市七里河區(qū)彭家坪蘋果基地。選取樹齡相同且患有蘋果樹腐爛病的蘋果樹,用刮刀刮取病斑部位及其周圍2 cm處健康部位樹干表皮帶回實驗室于4℃保存。將帶回的樹干表皮用75%乙醇消毒后無菌水沖洗3次晾干備用。選黃腐酸600倍稀釋溶液噴施于備用的患病組織。從施藥時開始,每7 d取樣一次,共取樣7次。分別以無菌水噴施患病組織和健康植株樹干表皮作為對照,處理和對照均重復(fù)3次。

1.2.2.1黃腐酸處理后SOD活性測定

SOD活性測定參照高俊鳳等[11]的方法,略作修改。粗酶液提取:稱取0.2 g 材料放入預(yù)冷的研缽中,加入少許石英砂和2 mL 0.05 mol/L pH 7.8 磷酸緩沖液(含1%聚乙烯吡咯烷酮,5 mmol/L EDTA),研磨至勻漿,并用該濃度的磷酸緩沖液定容至10 mL后倒入離心管中,于4℃、10 000 r/min離心20 min,上清液即酶粗提取液,處理和對照均為3次重復(fù)。

SOD活性測定:向5 mL離心管中分別加入0.2 mL 酶提取液,然后按順序加入1.5 mL pH 7.8 磷酸緩沖液、0.3 mL 130 mol/L甲硫氨酸、0.3 mL 750 μmol/L NBT、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2、0.2 mL蒸餾水,最后加入0.3 mL 100 μmol/L核黃素,然后光照 10 min,最后于560 nm下測定吸光度值,空白管分別加0.2 mL蒸餾水、1.5 mL pH 7.8 磷酸緩沖液、0.3 mL 130 mol/L甲硫氨酸、0.3 mL 750 μmol/L NBT、0.3mL 100 μmol/L EDTA-Na2、0.2 mL蒸餾水和0.3 mL 100 μmol/L核黃素,各處理和對照均重復(fù)3次。

式中A光照為光照管的吸光度值;A560為560 nm的吸光度值;V1為酶提取液總體積 (mL);0.5表示抑制50% NBT光化還原為1個酶活;V2為測定時取用酶液體積 (mL);W為樣品鮮重 (g)。

1.2.2.2黃腐酸處理后POD活性測定

POD活性測定參照高俊鳳等[11]的方法,略作修改。粗酶液提取:稱取材料0.2 g,加入PVP 0.1 g和0.05 mol/L pH 6.5 磷酸緩沖液,于研缽中研磨成漿,并用該磷酸緩沖液定容至10 mL后倒入離心管中,在4℃條件下,以4 000 r/min 離心15 min,上清液為酶液,每處理和對照均為3次重復(fù)。

POD活性測定:向比色皿中分別加0.2 mL酶提取液、2.6 mL 0.3%的愈創(chuàng)木酚,放入比色槽,再加0.3 mL 0.6% H2O,470 nm波長下比色。立即開始計時,每隔1 min讀取1次數(shù)值。以1 min內(nèi)A470變化值表示酶活性大小。以等量的蒸餾水代替酶液,依次向比色槽加入2.6 mL 0.3%的愈創(chuàng)木酚,0.3 mL 0.6% H2O為對照,各處理和對照均重復(fù)3次。

式中ΔA470:單位反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化;V1:酶提取液總體積(mL);0.01:每分鐘增加 0.01 為1個酶活;V2:測定時取用酶液體積(mL);t:反應(yīng)時間(min);W:樣品鮮重(g)。

1.2.2.3黃腐酸處理后PAL活性測定

PAL活性測定參照高俊鳳等[11]的方法,略作修改。粗酶液的提取:稱取材料0.2 g放入研缽中,加入2 mL pH 8.8的硼酸緩沖溶液和0.1 g PVP,研磨成勻漿移入10 mL容量瓶中,將定容后的勻漿移入離心管,在4℃的條件下,于4 000 r/min 離心30 min,上清液即為粗酶液,每處理和對照均為3次重復(fù)。

PAL活性測定:取pH 8.8 的硼酸緩沖溶液2 mL、0.2 mL酶液和0.02 mol/L L苯丙氨酸1 mL作為反應(yīng)體系,對照管中用等量蒸餾水代替酶液。搖勻后在290 nm 下測定起始吸光值A(chǔ)290,第1次測定后,將溶液分別倒入試管中, 于30℃恒溫水浴鍋中放置30 min后再次測定吸光值A(chǔ)290,反應(yīng)的酶活性為第2次的A290值減去第1次的A290值,每個處理和對照均為3次重復(fù)。

1.2.2.4黃腐酸處理后PPO活性的測定

PPO測定參照高俊鳳等[11]的方法,略作修改。粗酶液提取:取0.2 g材料放入預(yù)冷研缽,加0.1 g PVP 和2 mL pH 6.8磷酸緩沖溶液,研成勻漿后移入10 mL容量瓶中定容,4℃下4 000 r/min離心15 min,取上清液即為粗酶液。每處理3次重復(fù)。

PPO活性測定:吸取粗酶液0.2 mL于10 mL試管中,依次加入pH 6.8磷酸緩沖溶液1.5 mL,0.05 mol/L鄰苯三酚1.5 mL,于30℃恒溫水浴鍋中放置2 min,立即置于冰浴下停止反應(yīng),以緩沖液代替酶液作為對照,用TU-1810紫外分光光度計在470 nm 波長下測定吸光值A(chǔ)470,以每分鐘內(nèi)A470變化值表示酶活性大小,處理和對照各重復(fù)3次。

式中ΔA470:單位反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化;V1:酶提取液總體積(mL);0.01:每分鐘增加 0.01 為1個酶活;V2:測定時取用酶液體積(mL);t:反應(yīng)時間(min);W:樣品鮮重(g)。

1.2.2.5黃腐酸處理后CAT活性測定

CAT活性測定參照高俊鳳等[11]的方法略作修改。粗酶液提取:同SOD酶液提取方法。

CAT活性測定:用蒸餾水調(diào)0,向比色皿中加0.2 mL酶液,將比色皿放入比色槽,加2.8 mL 0.067 mol/L H2O2,立即置于240 nm處比色,用0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液代替酶液作為空白對照,每隔1 min讀1次。以每分鐘內(nèi)A240變化值表示酶活性大小,處理和對照各重復(fù)3次。

式中ΔA240:單位反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化;V1:酶提取液總體積(mL);0.01:每分鐘增加 0.01 為1個酶活;V2:測定時取用酶液體積(mL);t:反應(yīng)時間(min);W:樣品鮮重(g)。

2　結(jié)果與分析

2.1黃腐酸抑菌活性測定

通過菌絲生長速率法對黃腐酸抑菌活性測定結(jié)果表明:黃腐酸能夠抑制蘋果樹腐爛病菌的生長(圖1),具有很好的殺菌作用,濃度越大,抑制作用越強。其EC50=76.99 μg/mL,回歸方程為y=2.988 8x-0.638 2,相關(guān)系數(shù)r=0.988 3(表1)。

圖1　不同濃度黃腐酸對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用Fig.1　Inhibitory effect of fulvic acid at different concentration on Valsa mali

黃腐酸濃度/μg·mL-1Concentrationoffulvicacid菌落直徑/cmDiameterofcolony生長抑制率/%Inhibitoryrateofgrowth回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)(r)CorrelationcoefficientEC50/μg·mL-1100.001.85±0.24(63.50±3.33)a50.003.00±1.22(32.40±2.08)ab33.003.85±1.31(9.50±1.33)by=2.99x-0.640.9976.9925.003.93±0.11(7.30±0.89)b20.004.02±0.50(4.90±0.31)bcCK4.20±1.00(0.00±0.03)c

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±SE。菌落直徑為處理后72 h的數(shù)據(jù)。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗在P<0.05 水平差異顯著。

Data in the table are mean±SE. The colony diameter was measured in 72 hours after treatment. Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at 0.05 level by Duncan’s new multiple range test.

2.2SOD活性

SOD活性測定結(jié)果表明,用黃腐酸處理感染蘋果樹腐爛病的患病組織,隨著處理時間的增加,蘋果樹腐爛病組織中SOD酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。經(jīng)黃腐酸處理后第14天測定組織中SOD活性達最高,為85.09 U/(min·g),之后SOD活性開始下降。且經(jīng)黃腐酸處理的組織中SOD活性均明顯高于未經(jīng)黃腐酸處理的組織和健康組織,但未經(jīng)處理的和健康的組織中酶活性隨時間變化不顯著(圖2)。

2.3POD活性

由圖3可以看出,患病組織經(jīng)黃腐酸處理后測定不同時間POD活性變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨處理時間增加,蘋果樹腐爛病組織中POD活性的變化趨勢為先緩慢升高后逐漸降低,且明顯高于對照處理。施藥21 d后患病組織中POD活性達到最大值,為107.19 U/(min·g),處理42 d后POD活性為82.79 U/(min·g),而未經(jīng)處理的和健康的組織酶活性無明顯變化。

2.4PAL活性

試驗結(jié)果表明,患蘋果樹腐爛病的組織經(jīng)黃腐酸處理后,隨處理時間增加,其PAL酶活性先升高后降低,但變化趨勢較平緩,各處理之間差異不顯著。與未經(jīng)黃腐酸處理的組織和健康組織相比,經(jīng)黃腐酸處理后的組織中PAL 活性升高較顯著(圖4)。施用黃腐酸21 d后患病組織中PAL活性達到最大值,為97.12 U/(min·g),之后PAL 酶活性開始下降。而未經(jīng)處理的和健康的組織PAL 活性雖然起初有較小的變化,但整體變化趨勢不明顯。

圖2　黃腐酸對蘋果樹SOD活性的影響Fig.2　The effect of fulvic acid on SOD activity in apple tree

圖3　黃腐酸對蘋果樹POD活性的影響Fig.3　The effect of fulvic acid on POD activity in apple tree

圖4　黃腐酸對蘋果樹PAL活性的影響Fig.4　The effect of fulvic acid on PAL activity in apple tree

2.5PPO活性的測定

PPO 活性測定結(jié)果表明,黃腐酸對蘋果樹腐爛病組織中PPO 活性影響顯著,并明顯升高(圖5)。PPO 活性從處理后第7天開始明顯上升,分別于21 d和35 d出現(xiàn)兩次峰值,為69.90 U/(min·g)和70.02 U/(min·g),但從處理后21 d開始,PPO活性隨時間變化不明顯;與未處理的和健康的組織相比較,后兩者PPO活性雖有較小的變化,但前后變化無明顯差異。

圖5　黃腐酸對蘋果樹PPO活性的影響Fig.5　The effect of fulvic acid on PPO activity in apple tree

2.6CAT活性測定

從圖6可以看出,蘋果樹腐爛病組織中CAT 活性經(jīng)黃腐酸處理后呈急劇升高又急劇下降的趨勢,并與對照達到顯著差異。其中CAT 的活性于第21天達到最大,值為31.11 U/(min·g)。而未經(jīng)處理的組織和健康的組織中酶活性值很接近,無顯著差異,從開始至42 d CAT無明顯變化。

圖6　黃腐酸對蘋果樹CAT活性的影響Fig.6　The effect of fulvic acid on CAT activity in apple tree

3　結(jié)論與討論

植物生長調(diào)節(jié)劑可調(diào)控植物體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和酶的合成,并能對植物不同生長發(fā)育階段起到調(diào)節(jié)和控制作用。有的植物生長調(diào)節(jié)劑能提高植物的蛋白質(zhì)、糖等的含量,有的能增強植物抗寒、抗旱、抗鹽堿和抗病蟲害的能力[12]。目前,隨著化學(xué)農(nóng)藥大量使用造成的不良后果,植物生長調(diào)節(jié)劑在植物病害防治中發(fā)揮出越來越大的作用。黃腐酸作為植物生長調(diào)節(jié)劑之一,既有腐植酸的特性,又不是農(nóng)藥,將其與農(nóng)藥配合使用,可以調(diào)控果樹營養(yǎng)并起到刺激作用。陳玉玲認(rèn)為黃腐酸既能直接刺激植物生長,也能通過改變IAA和脫落酸含量而間接刺激植物生長[13]。此外黃腐酸還可改變病樹的生理生化指標(biāo),有效地輔助農(nóng)藥發(fā)揮藥效,達到防治植物病害的作用[14]。再者,黃腐酸可提高作物免疫力,增強植株抗病能力,增根壯苗,抗旱抗病。回振龍等[15]的研究發(fā)現(xiàn)黃腐酸能促進連作馬鈴薯的生長發(fā)育,并提高馬鈴薯幼苗對連作的抗性。趙永峰等[16]在馬鈴薯上噴施黃腐酸使得馬鈴薯產(chǎn)量顯著提高。本試驗測定了黃腐酸對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用和施用黃腐酸后蘋果樹體防御酶系SOD、POD、PPO、PAL和CAT含量隨時間的變化情況。結(jié)果表明,黃腐酸對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用隨濃度的增加而增強;且經(jīng)黃腐酸處理蘋果樹腐爛病組織后,蘋果樹腐爛病組織中SOD、POD、PAL和CAT均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,其中黃腐酸處理后SOD活性于第14天出現(xiàn)峰值,而其他幾種防御酶的酶活性于處理后第21天達到最大值。此外,黃腐酸處理蘋果樹腐爛病組織后,PPO活性出現(xiàn)兩次高峰,分別于第21天和第35天。但從處理后第21天開始,PPO活性變化不明顯。因此,黃腐酸作為植物生長調(diào)節(jié)劑,可以顯著提高植物體內(nèi)相關(guān)防御酶系的活性,很大程度上提高了植物的免疫力,增強了植株抗病性。

目前,黃腐酸作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑,在植物病害防治中的應(yīng)用還相對較少,但其顯著的效果使該藥劑具有更加廣闊的應(yīng)用前景。2002年,趙永峰等測定了黃腐酸在馬鈴薯上的應(yīng)用效果,發(fā)現(xiàn)當(dāng)用量為3 000 mL/hm2和3 750 mL/hm2時增效顯著[16]。本試驗測定了黃腐酸對蘋果樹腐爛病菌抑制效果和對腐爛病組織中相關(guān)酶活性的影響,結(jié)果表明其可以顯著提高各種酶活性,這也為今后黃腐酸的

應(yīng)用提供了更加廣闊的領(lǐng)域,并為蘋果樹腐爛病的防治提供了新的途徑,但黃腐酸在植物組織中對其他抗病指標(biāo)的影響還不明確,需進一步探明。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Inhibition of fulvic acid toValsamaliand its effect on the activity of defense enzyme in apple tree

Chen Zhen,Hou Baohong,Wang Weixiong,Xu Bingliang

(College of Prataculture, Gansu Agricultural University, Lanzhou730070, China)

As one of the broad-spectrum plant growth regulators, fulvic acid can improve crop resistance and increase the yield stably and reliably. The inhibition of fulvic acid againstValsamaliand its effect on the activity of defense enzymes, including SOD, POD, PPO, PAL and CAT, were determined. The results showed that fulvic acid could inhibit the growth ofV.malihyphae, and the inhibition effect increased with the increase of concentration. The activities of SOD, POD, PPO, PAL and CAT increased at first and then decreased smoothly after treatment by fulvic acid. The SOD activity reached the peak 14 days after treatment, and the activity of other defense enzymes reached the maximum 21 days after treatment. These results revealed that fulvic acid could significantly increase the activity of the tested defense enzymes in apple trees, and improve the immunity and disease resistance of the apple tree.

fulvic acid;Valsamali;inhibition;defense enzyme

20150514

20150906

國家星火計劃 (2013GA860001)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203034)

E-mail:xubl@gsau.edu.cn

S 436.611.11

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.013

#為并列第一作者