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    花生分離蛋白酶解物對(duì)雞肉肌原纖維蛋白流變性的影響

    2022-03-24 02:12:08許時(shí)慧陳金玉關(guān)文強(qiáng)張穎璐張坤生耿亞鑫胡方洋鄧金香宋健臣
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:解物蛋白酶解肌原纖維

    許時(shí)慧,陳金玉*,關(guān)文強(qiáng)*,張穎璐,張坤生,耿亞鑫,胡方洋,鄧金香,宋健臣

    (1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134;2.天津二商迎賓肉類食品有限公司,天津 300385)

    近年來(lái)雞肉產(chǎn)能增加,市場(chǎng)供應(yīng)充足,而且價(jià)格低廉[1],其中雞胸肉又以高蛋白、高營(yíng)養(yǎng)及低膽固醇等特點(diǎn)著稱,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。在雞胸肉中起主要作用的蛋白質(zhì)是肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP),MP約占肉中蛋白的55%[2],對(duì)肉的質(zhì)地、脂肪、香氣及色澤有很重要的影響[3],肌原纖維蛋白的流變性及凝膠性質(zhì)是影響肉質(zhì)的重要原因,是影響加工性能的一個(gè)重要指標(biāo)[4-6],也是決定肉制品品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

    利用植物蛋白來(lái)改善肌原纖維蛋白的功能性質(zhì),從而豐富肉制品種類并提高其品質(zhì)是當(dāng)前的熱點(diǎn)。如常用的大豆分離蛋白不但能增強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)及持水性[7]、節(jié)約生產(chǎn)成本還可促進(jìn)環(huán)境友好發(fā)展?;ㄉ蛛x蛋白(peanut protein isolate,PPI)也是常用的優(yōu)質(zhì)蛋白。我國(guó)的花生種植面積廣、產(chǎn)量高[8],是重要的經(jīng)濟(jì)作物。花生含有多種生物活性[9],能用作穩(wěn)定劑改善食品感官[10],將其添加到碎肉、塊肉和仿肉等肉制品中可以充當(dāng)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、抗氧化劑等,能彌補(bǔ)加工過(guò)程營(yíng)養(yǎng)損失[11]。但是天然的PPI凝膠成形能力較弱,對(duì)MP的加工性質(zhì)、組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用[12],而將PPI酶解,會(huì)得到由蛋白質(zhì)、小分子肽、氨基酸、糖和脂肪等物質(zhì)組成的酶解產(chǎn)物[13],這一過(guò)程會(huì)使花生蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)、內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露,花生蛋白分子間疏水相互作用增強(qiáng),能促進(jìn)其形成凝膠[14-15]。本試驗(yàn)擬將PPI酶解物與MP相結(jié)合,探究PPI酶解物與MP的相互作用,以期為二者的加工利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    雞胸肉(冷藏):市售;花生分離蛋白:上海源葉生物科技有限公司;NaH2PO4(分析純)、NaCl(分析純)、乙二胺四乙酸[(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),分析純]、無(wú)水乙醇(分析純):天津市贏達(dá)?;瘜W(xué)試劑廠;堿性蛋白酶(200 U/g)、木瓜蛋白酶(2 000 U/g)、中性蛋白酶(4 800 U/g):丹麥諾維信有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH),分析純]、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA):美國(guó)Sigma公司;鹽酸(分析純):天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;MgCl2(分析純):天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠;三聚磷酸鈉(分析純):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

    1.2 試驗(yàn)儀器

    SMSTA TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀:英國(guó)Stable MicroSystems公司;Physica MCR301高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀:奧地利安東帕公司;HW-S24型電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FA2004A電子天平、FD-5N型真空冷凍干燥機(jī):日本EYELA公司;H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)、H185臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;IKA T10高速組織勻漿機(jī):德國(guó)IKA公司;KQ-250B型超聲波清洗機(jī):昆山市超聲儀器有限公司;EL20型pH計(jì):梅特勒-托利多儀器有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 花生分離蛋白酶解物的制備方法

    取一定量的花生分離蛋白,加入適量去離子水,配制3組蛋白質(zhì)量濃度5%的花生蛋白液,分別加入底物濃度3%的堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶,于各自的最適酶解條件下酶解3 h[13],使用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液維持體系pH值穩(wěn)定,待反應(yīng)結(jié)束后,用沸水加熱10 min滅酶,冷卻至室溫25℃左右,以4 000 r/min離心20 min,棄沉淀收集上清液即為酶解液,進(jìn)行真空冷凍干燥,最終得到酶解產(chǎn)物粉末。

    1.3.2 酶解液的超濾分離

    按1.3.1的方法制得花生蛋白酶解液,通過(guò)UF超濾膜(截留分子量為3 kDa)進(jìn)行超濾,在25℃下以4 500 r/min離心30 min,收集下層濾液(截留分子量<3 kDa),確定酶解物的分子量。

    1.3.3 提取MP

    MP的提取參考胡方洋等[16]和Chen等[17]的方法,將雞胸肉及提取液(0.002 mol/L MgCl2、0.1 mol/L NaCl、0.001 mol/L EDTA、0.1 mol/L Na2HPO4pH=7)從 4℃冰箱取出,洗凈切成肉糜狀,用4倍體積的MP提取液[0.002 mol/L MgCl2、0.1 mol/L NaCl、0.001 mol/L EDTA、0.1 mol/L Na2HPO4(pH=7)]高速勻漿(8 000 r/min),充分混勻,在4℃、4 500 r/min條件下離心20 min,取沉淀,重復(fù)離心3次,再向所得沉淀中加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液,與上述相同的離心條件下重復(fù)離心3次,棄上清液,最后沉淀即為MP(4℃冷藏,需7 d內(nèi)用完)。

    1.3.4 PPI酶解物與MP共混體系的制備

    將1.3.1得到的酶解產(chǎn)物凍干粉以不同的添加量與MP進(jìn)行復(fù)配,添加量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%,用0.1 mol/L NaCl制備成20 mg/mL的蛋白溶液,利用勻漿機(jī)中速攪拌30 s,控制溫度不超過(guò)室溫25℃,測(cè)定其流變學(xué)特性。

    1.3.5 共混凝膠的制備

    分別將1.3.1制得的堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解物的凍干粉以 0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例與MP混合,用0.1 mol/L NaCl制備成40 mg/mL[18]的蛋白溶液,放入水浴鍋從20℃開(kāi)始升溫,升溫至75℃,保持10 min,加熱結(jié)束后用碎冰快速冷卻,放入4℃冰箱12 h后取出備用。

    1.3.6 流變學(xué)的測(cè)定

    1.3.6.1 剪切稀化的測(cè)定

    分別取不同比例的適量樣品(按1.3.4制備的PPI堿性蛋白酶酶解物、中性蛋白酶酶解物及木瓜蛋白酶酶解物與MP共混體系)置于流變儀的測(cè)定平臺(tái)上,選用PP 50(直徑為25 mm)的錐板模具,恒定溫度24℃,測(cè)定樣品的表觀黏度(η)在剪切速率(γ)從0.01 s-1~300 s-1遞增過(guò)程中的變化。

    1.3.6.2 動(dòng)態(tài)溫度剪切掃描

    參考Chen等[19]的方法將制備好不同組分與比例的樣品取3 mL置于流變儀測(cè)定平臺(tái)上,選用P/0.5的探頭,板間距1 mm,振幅1 Pa,頻率固定為1 Hz,溫度從20℃升至90℃,再?gòu)?0℃降至20℃,記錄溫度變化過(guò)程中儲(chǔ)能模量G′、損耗模量G″的變化,繪制曲線。

    1.3.7 質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的測(cè)定

    將1.3.5制備的共混凝膠置于質(zhì)構(gòu)儀測(cè)試臺(tái)面進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定參數(shù):探頭P/0.5、測(cè)前速度1.0 mm/s、測(cè)試速度1.0 mm/s、測(cè)后速度1.0 mm/s、觸發(fā)力為5 g、壓縮比40%,測(cè)試中的最大力即為破斷強(qiáng)度,對(duì)應(yīng)的壓縮距離為凹陷深度,凝膠強(qiáng)度等于二者的乘積[20],測(cè)定一次重新?lián)Q一個(gè)測(cè)量位置,每個(gè)樣測(cè)3次,每組3個(gè)平行。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用Excel 2007、Origin 8.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及繪圖。每個(gè)試驗(yàn)平行3次。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 酶解物成分分析

    酶解物成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 PPI酶解物成分組成Table 1 Composition of PPI hydrolysate

    采用超濾離心管對(duì)制備的PPI酶解物進(jìn)行膜超濾分離,得到了2種分子量組成的抗氧化肽。由表1可知,中性蛋白酶酶解物的級(jí)分I占24.18%,級(jí)分II占85.82%;堿性蛋白酶酶解物的級(jí)分I占32.33%,級(jí)分II占67.67%,級(jí)分II比級(jí)分I占比多;木瓜蛋白酶酶解物的級(jí)分I占54.27%,級(jí)分II占45.37%。

    2.2 不同酶解物對(duì)MP功能的影響

    2.2.1 對(duì)流變學(xué)性質(zhì)的影響

    2.2.1.1 剪切稀化現(xiàn)象

    混合體系的表觀黏度剪切速率的變化見(jiàn)圖1。

    圖1 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的剪切稀化現(xiàn)象Fig.1 Shear thinning of different peanut protein hydrolysates and myofibrillar protein blends

    由圖1可知,隨著剪切速率在0~300 s-1逐漸增加,表觀黏度先快速降低而后趨于平緩,添加PPI及其不同酶解物與MP組成的溶液均隨剪切速率的增大而降低,存在剪切稀化現(xiàn)象,屬于非牛頓流體[21]。而添加PPI酶解物后,共混溶液的表觀黏度均增大。原因可能是因?yàn)楣不祗w系間的分子間作用力增強(qiáng),緊密連接,阻礙了其流動(dòng)速度,對(duì)混合液施加剪切力后,破壞了MP分子與改性酶解物小分子之間的纏繞,分子間氫鍵斷裂,作用力越大破壞效果越明顯,從而表現(xiàn)出表觀黏度減小;當(dāng)未施加剪切力時(shí),中性蛋白酶解PPI/MP共混體系的表觀黏度增大梯度較明顯,當(dāng)剪切力增大到一定值后,共混體系間的分子無(wú)法重新取向,此時(shí)表觀黏度維持在一個(gè)穩(wěn)定范圍[22],趨近于一個(gè)常數(shù)。

    還可看出,在沒(méi)有剪切速率的影響下,添加了PPI或其酶解物的表觀黏度均明顯高于未添加,而且隨著酶解PPI的添加量的增加,呈現(xiàn)先增大后減小的特點(diǎn),其中在添加量為4%時(shí)最大,而直接加入PPI會(huì)降低體系的黏度,說(shuō)明PPI酶解物在一定添加量下能增加混合體系的黏度,這可能與PPI酶解后性質(zhì)改變有關(guān)。如抗氧化作用的增加可能會(huì)使MP的分子形態(tài)更加緊致,而酶解后蛋白分解成氨基酸與MP分子作用范圍更加全面,使共混體系不易流動(dòng)變形;表觀黏度會(huì)隨著添加量的增加而減弱之后平緩,這可能是因?yàn)榈鞍字g的結(jié)合作用已經(jīng)被完全破壞,不會(huì)再出現(xiàn)新的變化。

    2.2.1.2 溫度掃描分析

    混合體系的儲(chǔ)能模量隨溫度的變化見(jiàn)圖2。

    圖2 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的儲(chǔ)能模量Fig.2 Storage modulus of the blend system of different peanut proteolysis products and myofibril protein

    G′的變化用于檢測(cè)食品的凝膠化[23]。G′表示凝膠結(jié)構(gòu)中由彈性變形量變化而引起的能量變化[24]。由圖2可知,測(cè)定溫度變化范圍是20℃~90℃~20℃,G′在45℃~55℃時(shí)開(kāi)始緩慢增加,凝膠網(wǎng)絡(luò)開(kāi)始初步形成,部分肌球蛋白的頭部開(kāi)始變性并交聯(lián)形成松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25];當(dāng)溫度高于55℃后,G′開(kāi)始下降,肌球蛋白尾部開(kāi)始變性,尾部超螺旋結(jié)構(gòu)解旋會(huì)破壞前期形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[26];當(dāng)溫度在63℃~90℃之間,G′開(kāi)始重新上升,由于共價(jià)二硫鍵和疏水相互作用而形成永久性不可逆交聯(lián)的肌球蛋白絲[27],當(dāng)溫度下降時(shí),凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強(qiáng),G′急劇上升,可能是酶解物與MP會(huì)通過(guò)非共價(jià)相互作用單獨(dú)重新分配和形成凝膠。

    其中在50℃~60℃之間,添加PPI酶解物的MP溶液的G′先增大后減小,可能是肌球蛋白尾部的變性被抑制,之前的網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)不會(huì)輕易被破壞;在降溫階段,PPI酶解物/MP共混體系相較PPI/MP共混體系的G′均有明顯增大,表明PPI酶解產(chǎn)物對(duì)MP的結(jié)構(gòu)有促進(jìn)作用,提高G′的作用優(yōu)于PPI,在添加量為4%時(shí)增強(qiáng)效果最大。

    混合體系的損耗模量隨溫度的變化見(jiàn)圖3。

    圖3 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的損耗模量Fig.3 Loss modulus of the blend system of different peanut proteolysis products and myofibril protein

    G″表示加熱過(guò)程中黏性的變化,表示物質(zhì)受到外力作用時(shí)的變形程度[28],可以反映MP結(jié)構(gòu)的折疊和聚集[24]。圖2和圖3中G′和G″的變化趨勢(shì)相似,添加花生分離蛋白和酶解后的PPI均改變了MP原本的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),酶解后的PPI改變作用更加明顯,原因可能是PPI酶解后產(chǎn)生的活性多肽改變了MP的氧化能力,影響其G″的變化。在升溫階段50℃~60℃出現(xiàn)一次最大值,然后快速下降,繼續(xù)加熱,G″緩慢上升。在降溫階段,隨著溫度的降低G″急劇增加,在相同的溫度下,PPI及其酶解物在添加量為4%時(shí)增幅最大,與G′的變化重合。在堿性蛋白酶解PPI與MP共混體系中,酶解物添加量為10%的情況下,對(duì)MP的G″的作用最小;在木瓜蛋白酶解PPI與MP共混體系與中性蛋白酶解PPI與MP共混體中,酶解物添加量從2%~4%G″逐漸增加,超過(guò)4%之后,隨著添加量的增加而逐漸降低,但3種酶解物均增加了MP分子的G″。

    2.2.2 PPI酶解物對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響

    混合體系的凝膠強(qiáng)度隨PPI及其酶解物添加量的變化見(jiàn)圖4。

    圖4 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的蛋白凝膠強(qiáng)度Fig.4 Protein gel strength of blends of different peanut protein hydrolysates and myofibrillar proteins

    蛋白的凝膠是因外界條件變化導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生不同程度的變性開(kāi)始伸展,然后蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與溶劑之間相互作用,最后蛋白質(zhì)之間相互聚集,形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分離蛋白及其酶解物與MP共混凝膠隨PPI及其酶解物添加量變化的變化趨勢(shì)。添加2%的PPI酶解物對(duì)MP凝膠強(qiáng)度的影響不大,而同樣的添加量下未酶解的PPI會(huì)降低MP的凝膠強(qiáng)度;當(dāng)添加量升至4%時(shí),共混蛋白凝膠強(qiáng)度明顯增加,其中PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加3.80%~14.84%;堿性酶解PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加15.03%~45.09%;中性酶解PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加了9.70%,木瓜蛋白酶解PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加了54.13%,而后又隨添加量的增加而減小,這可能是酶解導(dǎo)致PPI變性,球狀結(jié)構(gòu)展開(kāi),埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露[12],增強(qiáng)PPI與MP之間的分子相互作用,表明PPI酶解物在4%的添加量下,形成的混合蛋白結(jié)構(gòu)較為緊致,形成的凝膠也比較牢固,從而增強(qiáng)MP的凝膠[29]。圖4反映了花生強(qiáng)度,其中木瓜蛋白酶酶解物與堿性蛋白酶酶解物增加MP的凝膠強(qiáng)度的作用較為明顯。當(dāng)添加量超過(guò)4%后,可能因?yàn)閮煞N蛋白質(zhì)的自身相互作用增強(qiáng),MP分子形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)的阻力增大[30-32],導(dǎo)致蛋白凝膠強(qiáng)度下降,當(dāng)PPI及其酶解物超過(guò)一定量與MP作用會(huì)阻礙或破壞MP原有的蛋白結(jié)構(gòu),不利于其形成致密的凝膠結(jié)構(gòu)。

    2.2.3 不同酶解物對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

    混合體系的彈性、黏結(jié)性和回復(fù)性隨PPI酶解物添加量的變化見(jiàn)圖5。

    圖5 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)Fig.5 Protein gel structure of blends of different peanut protein hydrolysates and myofibrillar proteins

    凝膠質(zhì)構(gòu)是蛋白質(zhì)在食品加工過(guò)程的一個(gè)重要的屬性,對(duì)食品品質(zhì)有重要影響,其中彈性、黏結(jié)性及回復(fù)性等性質(zhì)的改變反映了蛋白的變性情況。由圖5可知,隨著各蛋白酶所得酶解物添加量逐漸增加,蛋白的彈性、黏結(jié)性及回復(fù)性均呈現(xiàn)不同的變化。在堿性蛋白酶解PPI/MP共混體系中,彈性最大增加了4.55%,黏結(jié)性增加,回復(fù)性變化不大;在中性蛋白酶解PPI/MP共混體系中,在PPI酶解物添加量為4%時(shí),彈性最大增加了27.45%;在木瓜蛋白酶解PPI/MP共混體系中,混合蛋白的凝膠彈性增加了21.86%,添加量在4%時(shí)最大,回復(fù)性和黏結(jié)性均有所增加,由此可推測(cè),在肉類制品中添加經(jīng)酶處理改性的PPI能增強(qiáng)食品的彈性,改善食品品質(zhì)。

    3 結(jié)論

    MP與PPI及其酶解物復(fù)配后,在4%的添加量下,PPI酶解物對(duì) MP 的 G′、G″、表觀黏度、凝膠強(qiáng)度、彈性、回復(fù)性及黏結(jié)性等均有促進(jìn)作用,其中,PPI中性蛋白酶酶解物對(duì)MP的流變學(xué)性質(zhì)的改善作用優(yōu)于堿性蛋白酶酶解物、木瓜蛋白酶酶解物及PPI,主要體現(xiàn)在對(duì)G′及凝膠彈性的影響上;3種PPI酶解物均能增強(qiáng)MP的凝膠強(qiáng)度(增幅在9.7%~54.13%)及質(zhì)構(gòu)特性,與流變學(xué)變化相一致。說(shuō)明PPI經(jīng)過(guò)酶解后能有效改善MP的蛋白特性,為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ),對(duì)實(shí)際生產(chǎn)加工具有重要的實(shí)際意義。

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