咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

鄭　宇，李　德，潘佳亮，高　利

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

鄭宇，李德，潘佳亮，高利

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

為研究咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響，探討其在中樞麻醉的作用機(jī)制。試驗(yàn)用15只健康山羊，3只為生理鹽水對(duì)照組，其余為試驗(yàn)組，試驗(yàn)組山羊肌肉注射14 mg/kg體重咪達(dá)唑侖。分別在給藥后誘導(dǎo)期、麻醉期、恢復(fù)Ⅰ期和恢復(fù)Ⅱ期4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每點(diǎn)剖殺3只山羊取腦組織，采用分光光度法測(cè)定不同腦區(qū)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。結(jié)果注射咪達(dá)唑侖能明顯抑制山羊大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，這種變化趨勢(shì)與山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖麻醉后行為學(xué)變化基本一致，海馬的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在整個(gè)麻醉過(guò)程中無(wú)明顯變化。表明咪達(dá)唑侖的麻醉作用可能與抑制山羊大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性相關(guān)。

Ca2+-Mg2+-ATP酶；山羊；咪達(dá)唑侖

Ca2+-Mg2+-ATP酶（又稱鈣泵），是細(xì)胞膜上一種重要的酶，在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Mg2+濃度穩(wěn)定，神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的傳導(dǎo)、心肌及其他肌肉的收縮、細(xì)胞的分泌和繁殖方面均有重要影響[1-2]。咪達(dá)唑侖（Midazolam、Dormicum）是苯二氮卓類麻醉劑，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、安眠、肌肉松弛、抗驚厥作用[3]。曾經(jīng)有過(guò)關(guān)于復(fù)合麻醉劑對(duì)豬Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響的相關(guān)報(bào)道，也有關(guān)于咪達(dá)唑侖對(duì)山羊中樞麻醉機(jī)制的研究，但到目前為止，咪達(dá)唑侖麻醉山羊時(shí)對(duì)山羊不同腦區(qū)的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響還沒(méi)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)山羊各個(gè)腦區(qū)進(jìn)行研究，以了解咪達(dá)唑侖麻醉山羊時(shí)各腦區(qū)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的情況，探討咪達(dá)唑侖對(duì)山羊麻醉的中樞機(jī)制及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)作用位點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物8月齡健康山羊15只（購(gòu)自哈爾濱郊區(qū)養(yǎng)殖戶，醫(yī)學(xué)檢查健康），體重13～15 kg，雌雄兼用（雌性7只，雄性8只），試驗(yàn)前在動(dòng)物舍喂養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。試驗(yàn)前12 h禁食禁水。

1.2儀器和藥品AvantiTM30Centrifuge高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自Japanese Beckman Company；BioTek EpochTM多體積分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司；咪達(dá)唑侖注射液，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供；ATP酶測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白含量測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3動(dòng)物分組及樣品采取15只山羊隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（生理鹽水組）3只、試驗(yàn)組12只，其中試驗(yàn)組按照給藥后測(cè)定時(shí)間分為麻醉誘導(dǎo)組（注藥后5 min）、麻醉組（翻正反射消失）、恢復(fù)Ⅰ組（翻正反射恢復(fù)時(shí)）、恢復(fù)Ⅱ組（翻正反射恢復(fù)后6 h）4個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只。對(duì)照組與麻醉組分別肌肉注射生理鹽水1.5 mL/kg體重，咪達(dá)唑侖14 mg/kg體重，于各時(shí)間點(diǎn)處死山羊開(kāi)顱，取腦組織，用4℃生理鹽水沖凈腦組織附著的血液，置于冰面上迅速分取雙側(cè)大腦皮層、小腦、丘腦、腦干和海馬。稱重后按1∶9（W/V）置入預(yù)冷的生理鹽水溶液中勻漿，然后3000 r/min（-4℃）高速離心10 min，取上清液。行為學(xué)變化分組標(biāo)準(zhǔn)按照師銘咸等[5]所述標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.4檢測(cè)方法采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，比色法測(cè)定ATP酶催化分解ATP生成的無(wú)機(jī)磷。

2　試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影響的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0 for Windows數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析，對(duì)照組與試驗(yàn)組變量間簡(jiǎn)單相關(guān)分析采用直線相關(guān)回歸分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。應(yīng)用Micro?soft Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

3　試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1咪達(dá)唑侖麻醉下山羊行為學(xué)變化試驗(yàn)組山羊注藥后表現(xiàn)逐漸安靜，行動(dòng)遲緩，共濟(jì)失調(diào)，趴臥不動(dòng)，最后翻正反射消失。翻正反射平均消失時(shí)間為8.46±2.67 min。在麻醉期間，山羊眼半閉，眼球向內(nèi)下方翻轉(zhuǎn)，對(duì)光反射存在。眼瞼反射、角膜反射明顯減弱，肛門(mén)反射存在，較少出現(xiàn)流涎。翻正反射恢復(fù)的平均時(shí)間為45.68±4.52 min；而對(duì)照組無(wú)明顯行為學(xué)變化。

3.2咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)山羊腦組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影響的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)山羊不同腦區(qū)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響?。╪=3，±SD）

表1　咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)山羊不同腦區(qū)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響?。╪=3，±SD）

**：與對(duì)照組比較P<0.01，差異極顯著；*：與對(duì)照組比較P<0.05，差異顯著；▲▲：與麻醉期比較P<0.01，差異極顯著；▲：與對(duì)照組比較P<0.05，差異顯著

大腦　海馬　丘腦　小腦　腦干對(duì)照組　5.37±0.36　4.17±0.16　5.18±0.52　3.87±0.69　4.14±0.50誘導(dǎo)期　4.57±0.76　4.05±0.44　4.29±0.65*　2.78±0.84*　3.46±0.45▲▲麻醉期　3.94±0.53*　3.49±0.34　3.56±0.32**　2.15±0.14**　2.16±0.27**恢復(fù)Ⅰ期　4.21±0.37*　3.67±0.75　4.77±0.22▲▲　3.27±0.34▲　3.04±0.18*▲恢復(fù)Ⅱ期　4.67±0.62　4.09±0.42　5.16±0.38▲▲　3.50±0.35▲　3.92±0.63▲▲

如表1所示，在咪達(dá)唑侖麻醉過(guò)程中，山羊海馬區(qū)域的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性無(wú)明顯變化。大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯受到抑制。在誘導(dǎo)期，大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與對(duì)照組比較，分別降低14.9%（P> 0.05）、17.2%（P<0.05）、28.2%（P<0.05）和16.4%（P> 0.05），差異不顯著或顯著。麻醉期大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均受到明顯抑制，與對(duì)照組比較，分別降低26.6%（P<0.05）、31.3%（P< 0.01）、44.4%（P<0.01）和47.8%（P<0.01），差異顯著或極顯著?；謴?fù)I期丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯恢復(fù)，與麻醉期比較，分別升高34.0%（P<0.01）、52.1%（P<0.05）和40.7%（P<0.05），差異顯著或極顯著，大腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性仍受到明顯抑制，與對(duì)照組比較差異顯著（P< 0.05），恢復(fù)II期上述腦區(qū)的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性基本恢復(fù)到對(duì)照組水平，大腦的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與麻醉期比較差異不顯著（P>0.05），小腦的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與麻醉期比較差異顯著（P<0.05），丘腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與麻醉期比較差異極顯著（P<0.01）。大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化趨勢(shì)與山羊行為學(xué)變化相平行（基本吻合），海馬的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化趨勢(shì)與山羊行為學(xué)變化相比較，沒(méi)有規(guī)律。

4　討論

Ca2+-Mg2+-ATP酶，也稱Ca2+泵或Ca2+-ATP酶。中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)除通過(guò)各型Ca2+通道外，主要是通過(guò)Ca2+-ATP酶和Na+/Ca2+這兩個(gè)機(jī)理維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)[2]。Ca2+在神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮、細(xì)胞分泌和增殖、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞老化等許多細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中都有調(diào)節(jié)作用。腦細(xì)胞膜上存在的Ca2+-Mg2+-ATP酶能不斷將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+逆電化學(xué)梯度泵出至細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度保持穩(wěn)定狀態(tài)，維持正常的細(xì)胞功能[5]。細(xì)胞的多種功能都依賴于細(xì)胞內(nèi)外極高的Ca2+濃度差存在（胞外Ca2+濃度大約比胞內(nèi)高出10 000倍），一旦這種濃度差減低，細(xì)胞就會(huì)受到功能性損傷，甚至引起死亡。Ca2+-Mg2+-ATP酶能夠直接利用ATP為能源，逆濃度梯度主動(dòng)的把細(xì)胞內(nèi)液的Ca2+泵出膜外，以維持胞內(nèi)Ca2+的低穩(wěn)態(tài)，從而保證神經(jīng)細(xì)胞的正常興奮性[6]。有研究表明，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低必然影響胞漿和胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+的蓄積[Ca2+]i升高，從而影響神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生與興奮性傳導(dǎo)，產(chǎn)生一定的中樞抑制效應(yīng)[7]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，肌肉注射咪達(dá)唑侖后，隨著翻正反射的消失，山羊大腦、丘腦、小腦和腦干內(nèi)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均受到明顯抑制，待翻正反射恢復(fù)并能自由走動(dòng)后，上述腦區(qū)內(nèi)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性基本恢復(fù)到正常水平，這種變化趨勢(shì)與山羊的行為學(xué)變化相平行。而在麻醉過(guò)程中，山羊海馬內(nèi)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，未發(fā)生明顯變化。分析試驗(yàn)結(jié)果推斷，大腦、丘腦、小腦和腦干內(nèi)Ca2+-Mg2+-ATP酶可能是咪達(dá)唑侖全麻作用的靶位之一，且咪達(dá)唑侖全麻作用可能與抑制這些腦區(qū)內(nèi)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性相關(guān)。

Buljbasic N等研究發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖對(duì)犬心肌細(xì)胞K+通道中的ICa產(chǎn)生一個(gè)劑量依賴性抑制[8]。這一研究表明，咪達(dá)唑侖可以抑制胞內(nèi)游離Ca2+泵出胞外，這可能是由于Ca2+，Mg2+-ATP酶活性受到抑制的結(jié)果，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

5　結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，咪達(dá)唑侖可抑制山羊大腦、丘腦、小腦和腦干內(nèi)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。山羊上述腦區(qū)的Ca2+-Mg2+-ATP酶可能是咪達(dá)唑侖全麻作用的靶位之一。

[1]李海英，趙娟，李海生.Na+、K+-ATP酶和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性影響因素的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17 （9）：1449

[2]Duke A M，Hopkins P M，Ds S.Mg2+dependence of halothane-in?duced Ca2+release from the sarcoplasmic reticulum in rat skeletal muscle[J].Journal of Physiology，2003，551（2）：447-454.

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[4]師銘咸，劉子睿，張宇，等.咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（1）：109-111.

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[8]Buljubasic N，Marijic J，Berczi V，et al.Differential effects of etomidate，propofol，and midazolam on calcium and potassium channel currents in canine myocardial cells[J].Anesthesiology，1996，85（5）：1092-1099.

Effect of midazolam on Ca2+-Mg2+-ATP enzymeactivity in different encephalic regions of goats

ZHENG Yu，LI De，PAN Jia-liang，GAO Li
（College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of midazolam on Ca2+-Mg2+-ATP enzyme activity in different brain regions of goats and to ex?plore its central mechanism，we used 15 healthy goats with three of them as saline control group and the rest as experimental group.The goats in experimental group were intramuscular injected with 14 mg/kg midazolam.Goats in experimental group were ex?ecuted in induction period，anesthesia period，recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II after in?duction，respectively，and there brain tissues were taken immediately.Spectrophotometric method was used to determine the activi?ty of Ca2+-Mg2+-ATP in different brain regions of goats.midazolam significantly inhibited Ca2+-Mg2+-ATP activity in goats’cere?brum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem，but there were no significant changes of Ca2+-Mg2+-ATP activity in the hip?pocampus.The results indicate that the narcotic effect of midazolam may be related to the inhibition of Ca2+-Mg2+-ATP activity in goats’cerebrum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem.

midazolam；Ca2+-Mg2+-ATP enzyme；goat.

GAO Li

S858.27

A

0529-6005（2016）07-0016-03

2015-06-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372491）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C2011B）；黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（12531016）

鄭宇（1990-），女，碩士，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)，E-mail：1226733062@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com