酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)牛血清中磺胺類藥物殘留

蘇明明　肖姍姍　張瑜　王琦　曹際娟*

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局　遼寧大連　116100；2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局）

酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)牛血清中磺胺類藥物殘留

蘇明明1肖姍姍1張瑜2王琦2曹際娟1*

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局遼寧大連116100；2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局）

利用酶聯(lián)免疫試劑盒快速檢測(cè)牛血清中的磺胺二甲嘧啶的殘留量，方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-14.391x+93.317，R2=0.9996，IC50=8.3 ng/mL，線性范圍為0.9-75 ng/mL，檢測(cè)限為0.3 ng/mL。選擇酶聯(lián)免疫試劑盒中提供的MSU溶液直接提取，以2.5 ng/mL、15 ng/mL和20 ng/mL的濃度添加于空白牛血清樣品，回收率為72%-96.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.40%-7.41%。

磺胺二甲嘧啶；酶聯(lián)免疫檢測(cè)；牛血清

1　前言

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)藥物的總稱，是一類用以預(yù)防和治療微生物引起疾病的化學(xué)藥物［1］。SAs種類繁多，應(yīng)用較廣［2］，是國(guó)家允許限量使用的廣譜抗菌藥物，可被飼料生產(chǎn)者采用?；前范奏奏ぃ⊿ulfamethazine，SM2）廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，用以防治動(dòng)物呼吸道疾病、乳房炎和球蟲(chóng)病等疾病，也作為飼料添加劑使用，以提高飼料效率，降低畜禽的發(fā)病率和死亡率。近幾年供港澳活豬、活牛羊、活禽量連續(xù)加大，為確保供應(yīng)量，防止病蟲(chóng)害損傷活動(dòng)物，磺胺二甲嘧啶常常超量使用，導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性。SM2具有損害動(dòng)物機(jī)體組織及致癌性，對(duì)人類的身體健康產(chǎn)生很大危害。國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）和歐美等大多數(shù)國(guó)家規(guī)定食品和飼料中的磺胺類藥物總量及磺胺二甲嘧啶等單個(gè)磺胺類藥物的含量不得超過(guò)0.1 mg/kg［3-7］，日本規(guī)定食品中不得檢出磺胺類藥物。同時(shí)近年來(lái)國(guó)家對(duì)供港食品活動(dòng)物的通關(guān)速度有更高要求，有必要建立一種方法，在快速檢測(cè)活動(dòng)物體內(nèi)磺胺二甲嘧啶的殘留量［8］同時(shí)對(duì)活動(dòng)物不造成致命性損害，保證供貨商的利益。

磺胺類藥物檢測(cè)方法有多種，目前普遍采用的是反向高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）［9-12］，但是 HPLC和HPLC-MS前處理提取方法繁瑣［13-18］，操作時(shí)間長(zhǎng)，而且要取活動(dòng)物組織器官作為樣品，導(dǎo)致動(dòng)物死亡使供貨商成本增加。而酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）主要針對(duì)某種特定SAs及其主要代謝物，在不影響活動(dòng)物生命的前提下取少量血樣作為樣品，前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)方便快捷，在保證不損害活動(dòng)物的同時(shí)又能快速有效檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的磺胺二甲嘧啶，加快通關(guān)速度。本項(xiàng)目建立了ELISA測(cè)定牛血中的磺胺二甲嘧啶。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1試驗(yàn)樣品

牛血清：采自遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局隔離場(chǎng)。

2.1.2主要儀器

酶標(biāo)讀數(shù)儀（SUNRISE）：TECAN公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Biofugestratos）：Heraeus公司；漩渦振蕩器（MS2）：IKA公司；電子天平：Sartorious公司。

2.1.3試劑

牛血清、磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自 Sigma公司；進(jìn)口磺胺類藥物檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自德國(guó)R-biopharm 公司；磺胺類藥物酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、8 孔×12條酶標(biāo)板（包被有偶聯(lián)抗原）：美國(guó)柏爾生物技術(shù)公司；磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫試劑盒（2℃-8℃）、酶標(biāo)記物、磺胺二甲嘧啶抗體、底物液（A、B液）、終止液、洗滌液（濃縮液，試劑盒自帶）、緩沖液（濃縮液，試劑盒自帶）：購(gòu)自北京博奧泰科技有限公司；乙腈、乙酸乙酯、正己烷：均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Merck公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

2.2方法

2.2.1牛血清樣品前處理

取0.5mL血漿加入離心管中，離心（20℃-25℃，4000 r/min）10 min；取20 μL上清液，加入80 μL 1×樣品提取液F（試劑盒中自帶），混勻稀釋5倍后進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2吸光度值測(cè)定

將試劑盒于室溫 （20℃-25℃）平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均需搖勻。將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2個(gè)孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在位置。在各微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的試樣20 μL，然后加入酶標(biāo)記物50 μL，再加入磺胺二甲嘧啶抗體80 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，室溫環(huán)境中反應(yīng)1 h；取出酶標(biāo)板，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入洗滌液工作液250 μL，洗板4-5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干；每孔加入底物液A 50μL和底物液B 50μL，輕輕振蕩混勻，室溫環(huán)境中避光顯色30 min，加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻。設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處，測(cè)定每孔吸光度值。

3　結(jié)果

3.1線性范圍及線性方程

用試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定曲線，濃度分別為0.5、1.5、5、15、20、50 ng/mL，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)圖1。

圖1　磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)液或樣品吸光度值與其濃度的函數(shù)關(guān)系為：y=-14.391x+93.317，R2=0.9996。

布板：實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)時(shí)樣品的分布，見(jiàn)表1與表2；表1中P1-P6為試劑盒中所自帶的標(biāo)準(zhǔn)品，P7、P8為實(shí)驗(yàn)室人為配制的標(biāo)準(zhǔn)品。

表1　標(biāo)準(zhǔn)品布板圖

表2　表1對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（單位：ng/mL）

3.2回收率驗(yàn)證

在牛血清的空白樣品中分別添加 2.5、15、20 ng/mL 3個(gè)水平的磺胺二甲嘧啶，按照上述處理方法進(jìn)行分析，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　牛血清樣本間精密度及回收率的檢驗(yàn)結(jié)果

表3顯示，加標(biāo)回收率為72%-96.6%，符合60%-110%的規(guī)定；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.40%-7.41%，即方法的準(zhǔn)確率也在規(guī)定的范圍之內(nèi)。由此可見(jiàn)，該檢測(cè)方法能充分滿足要求。

3.3檢出限

12個(gè)自配0.5 ng/mL磺胺標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定濃度均值為0.5056 ng/mL，結(jié)果顯示檢出數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常接近，說(shuō)明用此試劑盒檢測(cè)結(jié)果制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限均符合衛(wèi)生部規(guī)定。因此，依據(jù)此試劑盒提供血清樣品的檢出限為2.5 ng/mL。

3.4不同磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率

交叉反應(yīng)率是反映抗原抗體特異性好壞的指標(biāo)，交叉反應(yīng)率越高，說(shuō)明特異性越差；反之，則表明特異性越好。一般交叉反應(yīng)率的測(cè)試操作和計(jì)算如下：

按一定濃度配制待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品和相似藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用待測(cè)物抗原或者抗體包被酶標(biāo)板，配制一定濃度抗體或者酶標(biāo)記抗原，進(jìn)行ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，最后對(duì)比兩組曲線，分別計(jì)算B/B0百分比（即每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值與0標(biāo)OD值的百分比），找出IC50點(diǎn) （即抑制率B/B0在50%時(shí)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度），用待測(cè)藥物的IC50濃度除上相似物的IC50濃度，得到的百分比就是待測(cè)藥物與其相似藥物的交叉反應(yīng)率。

計(jì)算公式：S=Y/Z×100%

式中：S-交叉反應(yīng)率；Y-待測(cè)物IC50濃度；Z-相似物IC50濃度。

以磺胺喹噁啉93%的交叉反應(yīng)率為例：用磺胺類試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品和磺胺喹噁啉藥物分別配制6個(gè)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在磺胺類試劑盒的酶標(biāo)板和抗體上進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)試出兩組曲線的IC50點(diǎn)，然后計(jì)算出交叉反應(yīng)率。

表4　磺胺類物質(zhì)交叉反應(yīng)率

4　結(jié)論

相比于其他基于抗原抗體反應(yīng)免疫分析法，ELISA檢測(cè)靈敏度高、方法簡(jiǎn)單、配套技術(shù)成熟，可以滿足現(xiàn)有痕量檢測(cè)技術(shù)的要求。此方法能實(shí)際結(jié)合供港澳活動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫特點(diǎn)，既能保證動(dòng)物不受損害，又能減少供貨商損失。與液質(zhì)聯(lián)用方法相比，該檢測(cè)方法制備較為簡(jiǎn)單、快速，分析技術(shù)利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合，具有耗時(shí)少、靈敏度高。此方法是快速篩選方法，一旦出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，可采用LC-MS-MS或者GCMS-MS進(jìn)行進(jìn)一步定性分析。

［1］周寧娟，薛罡，劉亞男，等.固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定水中磺胺嘧啶［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，33（6E）：544-546.

［2］曾小明，梁豐，司士輝，等.Ti基電極上光化學(xué)沉積Hg用于吸附溶出伏安法測(cè)定磺胺嘧啶 ［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28（3）：326-329.

［3］Horie M，Kobayashi H，Ishii R.Simple and rapid microbiological method for determination of residual antibacterials in meat ［J］.Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2008，493：168-176.

［4］Lee H J，Lee M H，Ryu P D.Enzyme-linked immunosorbent assay for screening the plasma residues of tetracycline antibiotics in pigs［J］.J Vet Med Sci，2001，635：553-556.

［5］S rensen L K，Rasmussen B M，Boison J O.Simultaneous determination of six penicillins in cows raw milk by a multiresidue high-performance liquid chromatographic method［J］.J Chromatogr B Biomed Sci App，1997，6942：383-391.

［6］Mart nez-Huelamo，M Jim nez-Gmez，E Hermo M P.Determination of penicillins in milk using LCUV LC-MS and LC-MS/ MS［J］.J Sep Sci，2009，32（14）：2385-2393.

［7］左志輝，高立勤，唐素芳.固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)定量檢測(cè)蜂蜜中28種抗生素類藥物殘留的研究 ［J］.藥物分析雜志，2009，297：1196-1201.

［8］王晶，王林，黃曉蓉.食品安全快速檢測(cè)技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002，41-56.

［9］劉宏英.高效液相色譜法測(cè)定聯(lián)磺甲氧芐啶片中磺胺嘧啶含量［J］.藥物鑒定，2007，16（24）：29.

［10］汪潔，魏然.反相高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方磺胺嘧啶滴鼻液中磺胺嘧啶和鹽酸麻黃堿含量［J］.中南藥學(xué)，2006，4（6）：421-423.

［11］金明，周圍，劉紅衛(wèi)，等.超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定牛肝中七種磺胺類藥物［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2009，28（2）：16-20.

［12］崔曉君，武小鷹，徐立恒，等.固相萃取-高效液相色譜測(cè)定奶粉中磺胺類抗生素殘留［J］.食品科技，2010，35（2）：235-236.

［13］Ibez M，Guerrero C，Sancho J V.Screening of antibiotics in surface and wastewater samples by ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2009，121612：2529-2539.

［14］LeeH，LeeJS，LeeHS.Simultaneousdeterminationof ampicillin and metampicillin in biological fluids using highperformance liquid chromatography with column switching［J］.J Chromatogr B Biomed Appl，1995，6642：335-340.

［15］Heller D N，Smith M L，Chiesa O A.LC/MS/MS measurement of penicillin G in bovine plasma urine and biopsy samples taken from kidneys of standing animals［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，8301：91-99.

［16］Ishida M，Kobayashi K，Awata N.Simple highperformance liquid chromatographydeterminationofampicillininhumanserum using solid-phase extraction disk cartridges［J］.J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1999，727（1-2）：245-248.

［17］劉偉，沈敏，卓先義，等.反相高效液相色譜法測(cè)定全血中青霉素類藥［J］.法醫(yī)學(xué)雜志1999，151：19-20.

［18］李牧，廖林川，顏有儀，等.血液和尿液中多種頭孢菌素的HPLC分析［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2009，256：437-439.

The Detection of Sulfa Drug Residues Using ELISA for Bovine Serum

SU Mingming1，XIAO Shanshan1，ZHANG Yu2，WANG Qi2，CAO Jijuan1*
（1.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian，Liaoning，116001；2.Dalian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Based on anti-sulfamethazine monoclonal antibody，an ELISA method to detect sulfamethazine in cow serum is established.The formula was y=-14.391x+93.317，R2=0.9996，and the 50%in hibition concentration（IC50）was 8.3 ng/mL with the limit of detection of 0.3 ng/mL.The linear detecting range of calibrationcurve was from 0.9 ng/mL to 75 ng/mL.When the spiked concentrations of sulfamethazine were 2.5 μg/kg，15 μg/kg，and 20 μg/kg in blank feed，there covery was 72%-96.6%with coefficients of variation of 4.40%-7.41%.

Sulfamethazine；ELISA；Serum

S859.84

E-mail：meng8135@163.com；*通訊作者E-mail：caojijuanlnciq@163.com

國(guó)家質(zhì)檢總局出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目（2013B312）

2015-09-17