文蛤抗腫瘤蛋白M ere15的表達(dá)純化及鑒定

喬淦

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島　266042）

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文蛤抗腫瘤蛋白M ere15的表達(dá)純化及鑒定

喬淦

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

抗腫瘤蛋白Mere15是從海洋生物文蛤中獲得的抗腫瘤多肽。前期研究表明，Mere15具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤活性，但其在文蛤體液中含量極低。利用簡(jiǎn)并引物技術(shù)克隆了Mere15的全基因序列，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)。利用親和層析技術(shù)純化目的蛋白，經(jīng)透析除去鹽和超濾濃縮，獲得Mere融合蛋白，SDS-PAGE分析表明，目的蛋白分子量為33 kDa。MTT結(jié)果表明，目的蛋白對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，為海洋抗腫瘤蛋白研究提供了新的思路，對(duì)抗腫瘤新藥Mere15的開(kāi)發(fā)應(yīng)用也有一定的價(jià)值。

文蛤；抗腫瘤多肽；重組表達(dá)；細(xì)胞毒活性

文蛤（Meretrix meretrix） 作為一味傳統(tǒng)中藥，在《傷寒雜病論》及《百草綱目》等記載文蛤具有活血化瘀、防寒止痛的功效。目前，從文蛤分離的化合物有多糖、糖肽、脂質(zhì)、?；撬?、多肽等［1-7］；文蛤提取物具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗炎、增強(qiáng)免疫等生物活性［2，8-17］。文蛤多肽類的抗癌活性研究中，范成成等人［18］提取的一種文蛤多肽Mer2具有廣譜的癌細(xì)胞抑制活性，調(diào)控癌細(xì)胞的凋亡、抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)前期分離的1種文蛤多肽Mere15［19］，通過(guò)多通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡文蛤多肽抑制腫瘤細(xì)胞微管蛋白聚合。Mere15可以抑制微管蛋白的聚合，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期的正常發(fā)生，在多肽作用下肺癌細(xì)胞在G2/M時(shí)期停滯，抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)Mere15多肽進(jìn)行Edama降解法測(cè)序，測(cè)得一段序列。通過(guò)簡(jiǎn)并引物技術(shù)克隆了Mere15相關(guān)基因，構(gòu)建工程菌，表達(dá)Mere15融合多肽，并研究了其對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

1　材料與方法

1.1材料

文蛤，購(gòu)買自青島河套海洋漁業(yè)發(fā)展有限公司；克隆載體Puc-19和表達(dá)載體Pet-28a，均購(gòu)買自大連Takara公司；感受態(tài)菌株Top10和表達(dá)菌株BL21，均購(gòu)買自全式金生物公司；總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Fast HiFidelity PCR Kit聚合酶、膠回收試劑盒，均購(gòu)買自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶，均購(gòu)買自NEB；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑，均購(gòu)買自Takara公司；PVDF膜，購(gòu)自Milipore；抗-His抗體、羊抗鼠二抗及DNA Mark2000，均購(gòu)買自碧云天生物技術(shù)有限公司；5 mLNi-NTA His Bind column，購(gòu)買自GE公司；透析袋，購(gòu)買自Sigama公司；其他常用化學(xué)用品均購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2方法

1.2.1抗腫瘤多肽Mere15基因克隆

Mere15 N端序列測(cè)定采用Edama降解法，由上海生工公司完成。文蛤總RNA提取，使用1 mL TRIZOL buffer處理文蛤組織，然后離心分離，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，最終使用TE buffer重懸RNA。以RNA模板合成cDNA，反應(yīng)體系參數(shù)按照反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)條件為42℃，15 min；85℃，30 s終止試驗(yàn)。Mere15基因合成使用簡(jiǎn)并引物技術(shù)，根據(jù)Mere15多肽序列比對(duì)分析結(jié)果，使用CODEHOP軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物［20-21］。

M1：5'CGCCGAATTCATGGTNGTNTGYCCNGAY G3'；

M2：5'CCGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'

（R=A+G；Y=T+C；N=A+T+C+G；）

引物由上海生工合成，EcoRI及HindIII雙酶作為酶切設(shè)計(jì)用于載體構(gòu)建。Mere15基因克隆以cDNA為模板，反應(yīng)體系按照PCR反應(yīng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，反應(yīng)條件按照Perkin Elmer的方法：94℃，2 min；94℃，15 s，58℃，10 s，68℃，30 s，共35個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min，獲得Mere15基因全長(zhǎng)序列。將獲得條帶經(jīng)膠回收，純化得到目的基因片段。

1.2.2表達(dá)載體構(gòu)建

將目的基因與T載體（PUC19-Mere15），試驗(yàn)方法按照載體說(shuō)明書(shū)操作。構(gòu)建好的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，采用膠回收的方法純化PUC18-Mere15質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證后將目的基因插入表達(dá)載體PET28，獲得表達(dá)載體成PET28-Mere15。

1.2.3Mere15融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化

使用Ni離子親和柱（GE，Ni-NTA His Bind column）純化Mere15融合蛋白。PET28-Mere15質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，接種重組子在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)過(guò)夜。接種陽(yáng)性重組子至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期（OD=0.8）左右，使用1 m MIPTG，37℃，220 r/min誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，4 h后高速離心收集菌體。使用100 mLLysis buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH值8.0） 重懸菌體，加入1 mmol/L苯甲基磺醯化氟、1%NP40及適量溶菌酶，進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞（工作2 s，暫停1 s），至細(xì)胞完全破碎，然后高速離心（12 000 r/min，10 min），取上清。經(jīng)Ni離子親和柱親和純化，上樣過(guò)程中收集穿透液（如圖2 A1），后使用15 mL Washing buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脫并收集雜蛋白（如圖2 A2）。使用20mL Elution buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脫并收集目的蛋白（如圖2 A3），然后使用SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)純化。

1.2.4Mere15融合蛋白鑒定

取適量目的蛋白，使用15%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜，后使用5%小牛血清封閉PVDF膜1 h后，加入適量HIS抗體稀釋液（1∶1 000），4℃層析柜中孵育過(guò)夜，TBST（19 mmol/L Tris-HCl，2.7 mmol/L KCl，137 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20，pH值8.0）緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次5 min，然后加入適量過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h后，使用TBST漂洗膜3次，每次5 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光的方法檢測(cè)融合蛋白印跡。

1.2.5MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞A549及PNC28，然后細(xì)胞密度稀釋至2×104個(gè)，按照每孔190 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h；然后加入10 μL的重組蛋白，按照20，40，80，160 μg/mL的最終濃度加入各孔，空白組加入10 μL培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），水平振蕩10 min；然后使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔于570 nm處吸光度，每組取平均值計(jì)算多肽對(duì)細(xì)胞的抑制活性。

2　結(jié)果與分析

2.1目的基因鑒定

分子印跡檢測(cè)見(jiàn)圖1。

圖1　分子印跡檢測(cè)

使用簡(jiǎn)并引物技術(shù)擴(kuò)增目的基因，根據(jù)Mere多肽的N端序列，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)得到Mere同源蛋白序列，然后根據(jù)簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則克隆目的基因。目的基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1 A所示，目的基因片段在850 bp左右，通過(guò)比對(duì)PET-Mere15序列與Mere15蛋白測(cè)序結(jié)果，確定其序列一致，重組子構(gòu)建符合設(shè)計(jì)。PUC19-Mere15載體的雙酶切如圖1 B，表達(dá)載體PET28-Mere15的雙酶切凝膠如圖1 C，目的基因在850 bp左右，和克隆基因的分子大小一致，符合預(yù)測(cè)值。而天然分離的Mere15分子大小在15 kDa左右，融合的大小則為33 kDa。理論上，融合蛋白只增加了6個(gè)組氨酸標(biāo)簽并沒(méi)有改變蛋白序列，蛋白之間差異可能是Mere15 RNA剪接發(fā)生而產(chǎn)生分子量不同的蛋白。

2.2Mere15多肽表達(dá)純化

蛋白純化系統(tǒng)純化過(guò)程1，2，3樣品吸光度見(jiàn)圖2，3樣品SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖3，免疫印跡蛋白見(jiàn)圖4。

圖2　蛋白純化系統(tǒng)純化過(guò)程1，2，3樣品吸光度

圖3　3樣品SD S-PAG E結(jié)果

圖4　免疫印跡蛋白

結(jié)果表明，目的蛋白主要存在于包涵體中，超聲破碎包涵體以獲得目的蛋白。使用Ni離子柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行親和純化，蛋白純化流程如圖2，其中穿透液（1）、雜蛋白洗脫液（2）、目的蛋白洗脫液（3）。由圖3可知，目的蛋白的分子大小在33 kDa左右，和預(yù)計(jì)結(jié)果一致。從結(jié)果中可以看出，目的組分中有少許雜蛋白，但目的產(chǎn)物純度為95%以上，雜蛋白對(duì)蛋白影響較小，目的蛋白可以用于細(xì)胞活性測(cè)定。由圖4可知，在33 kDa大小左右有1條明顯印跡條帶，說(shuō)明有融合蛋白成功表達(dá)。使用超濾設(shè)備對(duì)目的蛋白濃縮除鹽，最終使用PBS緩沖溶液稀釋Mere15融合蛋白至5 mg/mL。

2.3重組蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

24 h后A549細(xì)胞形態(tài)變化見(jiàn)圖5，24 h后PNC28細(xì)胞形態(tài)變化見(jiàn)圖6。

圖5　24 h后A549細(xì)胞形態(tài)變化

圖6　24 h后PN C 28細(xì)胞形態(tài)變化

采用MTT法測(cè)定了重組蛋白對(duì)A549及PNC28生長(zhǎng)的抑制作用，蛋白多肽對(duì)2種細(xì)胞的抑制活性在160 μg/mL質(zhì)量濃度下抑制率分別為43.7%，44.6%。在多肽處理24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)如圖5和圖6，空白組的細(xì)胞形態(tài)呈緊密排列，狀態(tài)良好，而隨著蛋白質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)了變化，多肽質(zhì)量濃度越高細(xì)胞狀態(tài)變化越大。細(xì)胞由規(guī)則的形態(tài)逐漸變化為體積縮小直至成為細(xì)胞碎片，細(xì)胞胞漿固縮并出現(xiàn)明顯的空泡狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞之間的空隙逐漸增大，貼壁能力變?nèi)?，呈現(xiàn)一定的凋亡特征，說(shuō)明多肽對(duì)癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。多肽的抑制活性隨著蛋白質(zhì)量濃度梯度增加，說(shuō)明藥物活性和多肽質(zhì)量濃度有較強(qiáng)的依賴關(guān)系。

3　討論

多肽生物活性的研究中，多數(shù)多肽表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，如趙進(jìn)［22］發(fā)現(xiàn)的海鞘多肽CS5931，通過(guò)作用于細(xì)胞表面的烯醇化酶（Enolase） 相互作用，抑制Enolase的活性，從而抑制癌細(xì)胞的正常代謝功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。阮之平等人［23］分離出一種蟾蜍多肽的試驗(yàn)表明，蟾蜍活性多肽可能通過(guò)下調(diào)周期相關(guān)基因cyclin B，CDK1的表達(dá)阻滯腫瘤細(xì)胞周期于G2/M期檢查點(diǎn)。對(duì)凋亡誘導(dǎo)的作用可能與凋亡相關(guān)基因Survivin，Caspase-3表達(dá)和bcl/bak表達(dá)的比值上調(diào)有關(guān)。另外，莊海峰等人［24］分離的一種蝎毒多肽對(duì)急性淋巴癌細(xì)胞的研究中，結(jié)果表明蝎毒多肽可有效抑制HL-60細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是多肽參與HL-60細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)調(diào)控，抑制Bcl-2基因的表達(dá)有關(guān)。

Mere15是一種從文蛤分離天然多肽，在前期研究中文蛤多肽具有靶向調(diào)控肺癌細(xì)胞凋亡的作用，在Mere15多肽處理癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期停滯在G2/M期，阻滯細(xì)胞周期的正常發(fā)生，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白p21的表達(dá)及抑制微管蛋白的聚合，從而抑制細(xì)胞正常代謝及有絲分裂功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本試驗(yàn)中克隆的Mere15相關(guān)基因約為使用原核表達(dá)的方法得到Mere15的融合蛋白，Mere融合蛋白大小約為33 kDa左右，與分離的天然文蛤蛋白Mere15分子量有一定差異，分離的 Mere多肽在45 μg/mL的抑制活性為77%，而表達(dá)的融合蛋白細(xì)胞活性（43.6%）降低，產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的原因可能是融合蛋白的分子量較大，蛋白的結(jié)構(gòu)改變掩蓋了蛋白的活性位點(diǎn)。天然多肽可能是由融合多肽基因剪接而得到的一種小分子多肽。目前的試驗(yàn)表明，大分子Mere15融合多肽具有一定的抑癌活性，下一階段將對(duì)融合蛋白的基因截取小片段后再融合表達(dá)，通過(guò)研究小片段多肽活性及機(jī)制，尋找抗癌藥物的新靶點(diǎn)。

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Cloning Experession and Cytotoxicity of Antitumor Protein from Meretrix Meretrix

QIAO Gan
（Colege of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao，Shandong 266042，China）

In the precious study，an antitumor protein，called Mere15 is isolated form Meretrix meretrix.The polypeptide could effectively inhibit the cancer proliferation both in vitro and in vivo.However，the content of the polypeptide in the species is very low.In the present study，the cDNA sequence is cloned and the polypeptide is expressed in E.coli.The antitumor protein is purified to homogeneity with molecular 33 kDa.MTT assay revealed that the recombinant protein displayed potent cytotoxicity to several cancer cells.The study develop an novel strategy for the production of antitumor protein from marine organisms，and the work is also important for developing Mere15 as an novel anticancer agent.

Meretrix meretrix；anticancer protein；cloning and expression；cytotoxicity

G420

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.013

1671-9646（2016）07a-0044-04

2016-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（81573457）。

喬淦（1989— ），男，碩士，研究方向?yàn)樯锼幬铩?/p>