牛源金黃色葡萄球菌耐藥性與耐藥基因圖譜的研究

常婧琦　劉璟璇

研究背景及路線

金黃色葡萄球菌是牛奶中常見的一種致病微生物，因此，能夠上市的牛奶產(chǎn)品中不允許檢出金黃色葡萄球菌。生鮮乳中金黃色葡萄球菌主要來源是奶牛場。雖然奶牛場會定時對奶牛本身和牛舍進(jìn)行消毒，但還是避免不了金黃色葡萄球菌對生鮮乳的污染，這主要是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌對牛場中使用的抗生素產(chǎn)生了耐藥性。經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知，金黃色葡萄球菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，奶?；既榉垦资墙瘘S色葡萄球菌污染生鮮乳最主要的原因，會引起牛奶的腐敗變質(zhì)。因此，想要控制牛奶的奶源質(zhì)量，就必須對金黃色葡萄球菌的耐藥性進(jìn)行研究。我們對北京某牛場的牛群進(jìn)行隨機(jī)取樣，對其中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了分離鑒定，以及耐藥性的基因分析，建立了多重耐藥性的耐藥基因圖譜，可以更快速、合理地對奶牛場的用藥進(jìn)行指導(dǎo)。研究技術(shù)路線見圖1。

實(shí)驗(yàn)過程

樣品采集

從北京某牛場牛群中隨機(jī)選擇奶牛48頭，分別收集乳頭涂抹樣品（見圖2）、牛乳樣品及糞便樣品等144份樣品，將其放入冰盒中冷藏，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存?zhèn)溆?。其中，乳房涂抹樣品：使用無菌拭子擦拭奶牛乳頭后置于無菌生理鹽水中保存，共采集48份；生鮮乳樣品：用溫水清洗奶牛乳房并使用75%酒精棉球?qū)θ轭^進(jìn)行消毒處理，然后收集第3把后的奶樣保存于無菌試劑瓶，共采集48份；糞便樣品：使用無菌手套從牛的肛門處采集新鮮糞便，分別裝入無菌藍(lán)蓋試劑瓶中保存，共采集48份。

菌種預(yù)培養(yǎng)

配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求進(jìn)行配置，再加入適量的蒸餾水。121℃20min高溫濕熱滅菌。在無菌室挑取平板上的菌落，放入滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

菌種分離純化

配制Baird Parker瓊脂培養(yǎng)基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求進(jìn)行配置，再加入適量的蒸餾水，121℃20min高溫濕熱滅菌，待溫度冷卻到50℃時，每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，用于金黃色葡萄球菌的選擇性分離培養(yǎng)。每個平板倒入大約20mL的培養(yǎng)基，加入已活化的液體培養(yǎng)基1 mL，放入培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

菌體鏡檢和鑒定

鏡檢采用革蘭氏染色法，一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等4個步驟。

鑒定時，用取樣棒挑取未知菌株的單菌落，懸浮于200 uL樣品緩沖液中，95℃處理25min，分別加入5 uL裂解液A和裂解液B，選用EcoRI酶切程序。用全自動微生物鑒定設(shè)備運(yùn)行約8h時后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出待測菌株的信息。

藥物敏感實(shí)驗(yàn)

使用比濁管對金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行標(biāo)定并校正。隨后將培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)瓊脂平板中，涂布均勻后貼上藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片將其與培養(yǎng)基表面貼牢，15min內(nèi)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后測量抑菌圈直徑。并對金黃色葡萄球菌的耐藥結(jié)果進(jìn)行歸類分析。

耐藥基因圖譜的建立

采用BioNumerics分析軟件對全自動微生物鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，得出金黃色葡萄球菌的耐藥基因圖譜。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)特性

Baird Parker培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后菌落為圓形，直徑1～2mm，顏色灰或黑色，周圍環(huán)暈約2～3mm。營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24h后菌落為圓形，直徑2～3mm，表面光滑、濕潤、邊緣完整，未見明顯環(huán)暈。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h后液體渾濁，靜止后底部有沉淀，輕搖后全部旋起溶解。

形態(tài)觀察

將提純培養(yǎng)的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢呈陽性結(jié)果。顯微鏡下菌株呈葡萄球狀排列，邊緣散落菌體呈短鏈狀存在，不存在鞭毛、芽孢、莢膜。金黃色葡萄球菌在Baird Parker培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后的形態(tài)見圖3。金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結(jié)果見圖4。

菌種鑒定結(jié)果

分別調(diào)取平板培養(yǎng)的單菌落，懸浮于40 uL緩沖液中，預(yù)熱后加入裂解液，選用EcoR I酶，在全自動微生物鑒定系統(tǒng)中自動運(yùn)行8h，自動酶切后得出雜交圖譜，將122株疑似金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的條帶型與鑒定數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)條帶型進(jìn)行比較，得出57株菌株為金黃色葡萄球菌，其檢出率為46.7%。

金黃色葡萄球菌的耐藥性

將從牛場取得的樣品中篩選出的57株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，分離得到53株菌株對多種藥物具有不同程度的耐受性，耐藥性的檢出率為92.9%，對氨芐西林和青霉素G耐藥的比率分別高達(dá)為78.9%和77.1%，而對克林霉素、紅霉素、氯霉素及四環(huán)素的耐藥性較低。

金黃色葡萄球菌耐藥基因圖譜

使用BioNumerics生物軟件對鑒定結(jié)果的圖譜進(jìn)行分析處理，建立金黃色葡萄球菌多重耐藥性的耐藥基因圖譜（見圖5）。由圖譜可知，5耐菌株圖譜為金黃色葡萄球菌對氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素、氯霉素耐藥的基因圖譜，4耐菌株圖譜為金黃色葡萄球菌對氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素耐藥的基因圖譜，3耐菌株為金黃色葡萄球菌對氨芐西林、青霉素G、氯霉素耐藥的基因圖譜；2耐（a）菌株為金黃色葡萄球菌對氨芐西林、青霉素G耐藥的基因圖譜；2耐（b）菌株為金黃色葡萄球菌對氨芐西林、四環(huán)素耐藥的基因圖譜；2耐（c）為金黃色葡萄球菌對四環(huán)素、頭孢哌酮耐藥的基因圖譜；1耐菌株為金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥的基因圖譜；0耐菌株無明顯耐藥性。通過金黃色葡萄球菌多重耐藥性的耐藥基因圖譜可以更簡捷分辨出從奶牛場分離出的金黃色葡萄球菌的耐藥情況，可以更快速、合理地指導(dǎo)奶牛場對奶牛的合理用藥。

討論與結(jié)論

討論

目前，尋找奶牛乳房炎發(fā)病原因最常用的方法是病原菌的分離鑒定，以往的研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，本文使用全自動微生物鑒定系統(tǒng)針對從奶牛乳頭涂抹點(diǎn)、牛乳、糞便等樣品分離純化的疑似122株菌株進(jìn)行了快速鑒定，鑒定出57株為金黃色葡萄球菌，其檢出率為46.7%，說明金黃色葡萄球菌是該奶牛場存在的主要致病微生物。目前治療奶牛乳房炎的常用方法是使用抗生素，但大量抗生素的使用會使金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性，因此，針對分離純化鑒定得到的57株菌株分別進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，53株菌株對多種藥物具有不同程度的耐受性，耐藥性檢出率為92.9%，其中51株菌株具有多重耐藥性，主要集中在4耐和5耐，占總菌株的64.9%，而對氨芐西林和青霉素G耐藥的比率分別高達(dá)78.9%和77.1%，對克林霉素、紅霉素、氯霉素及四環(huán)素的耐藥性較低，說明該牛場的奶牛近期發(fā)生過乳房炎疾病且波及范圍較大，在此期間使用了大量的抗生素藥物，特別是青霉素類的抗生素。因此，建議奶牛場不要經(jīng)?；騿为?dú)使用含氨芐西林和青霉素的抗生素。

另外，對于奶牛乳房炎，除藥物防治外，還應(yīng)以預(yù)防為主，因此建議該牛場注意加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、注重?cái)D奶衛(wèi)生、平衡日糧、并進(jìn)行定期檢測，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，從根本上降低乳房炎的發(fā)病率。此外，還要加強(qiáng)干奶期的預(yù)防，干奶期是奶牛泌乳周期的一個重要階段，是對奶牛機(jī)體和乳房健康的重要調(diào)整期，也是控制和治療乳房炎發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，在此階段，藥物可以長時間作用于乳房，對降低下一泌乳期乳房炎發(fā)病率具有顯著作用。

結(jié)論

本研究通過對從北京某牛場采集的乳頭涂抹樣品、牛乳樣品及糞便樣品等144份樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離純化，得到122株疑似金黃色葡萄球菌菌株，使用全自動微生物鑒定系統(tǒng)快速確定了57株金黃色葡萄球菌，其檢出率為46.7%。耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其中53株菌株對多種藥物具有不同程度的耐受性，耐藥性檢出率為92.9%，而其中51株菌株具有多重耐藥性，主要集中在4耐和5耐，占總菌株的64.9%。根據(jù)全自動微生物鑒定系統(tǒng)的結(jié)果圖譜，使用BioNumerics生物軟件進(jìn)行圖譜的分析處理，建立了金黃色葡萄球菌多重耐藥性的耐藥基因圖譜。因此，建議該奶牛場不要經(jīng)?；騿为?dú)使用含氨芐西林和青霉素的抗生素，而改用其他類抗生素，該實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果可用于指導(dǎo)奶牛場合理用藥，以降低金黃色葡萄球菌的耐藥性，保證生鮮乳的質(zhì)量安全。

創(chuàng)新點(diǎn)

◇全自動微生物鑒定系統(tǒng)用于快速鑒定金黃色葡萄球縮短了鑒定時間，分析了奶牛場金黃色葡萄球菌的耐藥情況，可快速調(diào)整奶牛場用藥。

專家評語

該項(xiàng)目通過金黃色葡萄球菌的采集鑒定及其多重耐藥性研究，建立了金黃色葡萄球菌耐藥基因圖譜。研究手段先進(jìn)，具有較強(qiáng)的科學(xué)性.實(shí)用性和完整性。建議加強(qiáng)科學(xué)文獻(xiàn)的學(xué)習(xí)，進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，提高研究深度。