pColdTMTF載體原核表達FocA可溶性蛋白的研究

曾發(fā)姣，舒 燕，繆 東，胡新旭，曾 艷

pColdTMTF載體原核表達FocA可溶性蛋白的研究

曾發(fā)姣，舒 燕，繆 東，胡新旭，曾 艷

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

為了較好地表達和純化尿道致病性大腸桿菌F1C菌毛主要亞單位FocA蛋白，研究以pColdTMTF為載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中原核表達F1C菌毛主要亞單位FocA，驗證表達的蛋白是否為可溶性蛋白，并對focA基因表達的最佳條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：目的基因focA在pCold表達系統(tǒng)中于15℃下誘導24 h蛋白表達量最高，IPTG濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)都能表達目的基因，且不同濃度對目的蛋白表達量無明顯差異；表達出來的FocA蛋白為可溶性蛋白。

大腸桿菌；F1C菌毛；FocA；原核表達

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.07.004

菌毛能夠介導細菌對特異性宿主細胞的粘附，這對細菌感染和定植具有重要意義［1］。尿道致病性大腸桿菌是引起人類泌尿器官感染的大腸桿菌的總稱。尿道致病性大腸桿菌菌毛依其血凝特性可以分為3類：第一類是對人紅細胞凝集具有甘露糖抗性，如P、M、S菌毛［2］；第二類是對豚鼠紅細胞凝集具有甘露糖敏感性，如1型菌毛［3］；第三類菌毛不具有血凝特性，如F1C菌毛。雖然F1C菌毛不具有血凝特性，但它在尿道致病性大腸桿菌粘附過程中是有一定的作用的。Virkola等研究表明F1C菌毛能夠特異性粘附人腎集合管和遠端小管。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)參與形成F1C菌毛的foc基因簇包括6個基因：focA、focC、focD、focG、focH和focI。其中，focA編碼主要菌毛亞單位，大小約為17 kD。F1C菌毛由大約1 000個主要結(jié)構(gòu)亞單位—FocA蛋白聚合在細菌表面而成。

重組蛋白在大腸桿菌中的表達一般可以分為可溶性表達和非可溶性表達。根據(jù)重組蛋白表達場所不同，可溶性表達又包括細胞外可溶性表達和細胞內(nèi)可溶性表達。非可溶性表達都是指的細胞內(nèi)表達，表達產(chǎn)物為包涵體［4］。因目的外源基因在大腸桿菌中進行高效表達之后，雖然存在于細胞質(zhì)中，但往往是以包涵體的形式存在，無糖基，沒有生物活性［5-7］。雖然形成的包涵體可有效的避免表達產(chǎn)物被細菌蛋白酶所降解和表達的重組蛋白對細胞的毒性作用，但要對包涵體進行分離純化，需要對包涵體進行變復性處理。且包涵體溶解、復性是個問題，而且復性后，其蛋白活性遠遠不如天然蛋白活性。針對在大腸桿菌中表達重組蛋白時容易遇到的問題，我們嘗試運用高效冷凍表達載體pColdTMTF載體來解決這一問題。研究以pColdTMTF為載體，在大腸桿菌中原核表達F1C菌毛主要亞單位FocA，驗證表達的蛋白是否為可溶性蛋白，并對focA基因表達的最佳條件進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和載體 工程菌Ecoli DH5α、BL21（DE3）均由湖南省微生物研究院保存?？寺≥d體pMD18-T Simple 載體購自大連寶生物工程有限公司。表達載體pET-22b（+）vector、pColdTMTF載體由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TIANgel Midi Purification Kit（北京天根生物有限公司）；Expand High FidelityPLUS PCRSystem、dNTP（Roche公司）；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、溶菌酶、DL2 000、λHindⅢ DNA Marker（Takara公司）；標準低分子量蛋白（Fermentas公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）、二巰基蘇糖醇（DTT）、丙烯酰胺（Sigma公司）；氨芐青霉素、IPTG、Triton X-100、N-四甲基乙二胺（TEMED）（上海生物工程公司）。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 P×2 Thermal Cycler PCR儀（Thermo fisher scientific），臺式離心機（Eppendorf），臺式冷凍離心機（Beckman公司），SDS-PAGE電泳儀及轉(zhuǎn)印裝置（Bio-Red），分光光度計（Eppendorf）、數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)JD-801（捷達公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 參照已發(fā)表的E.coli的F1C菌毛主要亞單位基因focA基因序列，設(shè)計引物，上游引物，引入NdeI酶切位點，下游引物引入BamH I酶切位點。

Up-FocA：3'-CGCCATATGAAGTTAAAATTCAT CTCCATGGCTGTA-5'

Lo-FocA：3'-CAGGGATCCCTGGTACTGAACTT TAAAGGTG-5'

1.2.2 focA基因的擴增 （1）制備PCR模板DNA。用煮沸裂解法制備PCR模板。取1 mL 37℃過夜振搖細菌培養(yǎng)物離心，沉淀用滅菌超純水洗一次，離心去上清，用200 μL滅菌超純水懸浮沉淀，煮沸10 min，10 000 r/min離心2 min，取上清作為PCR模板。（2） PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL；上下游引物各0.5 μL；Expand High Fidelity Enzyme（3.5 U/μL）0.5 μL；10×PCR buffer（with Mg2+）2.5 μL；滅菌去離子水17.5 μL。（3）PCR反應(yīng)程序。94℃ 4 min；94℃ 50 s；53℃ 50 s；72℃ 50 s，25個循環(huán)；72℃ 10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴乙淀染色后，紫外燈下觀察并拍照。

1.2.3 pColdTMTF-focA重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達（1）PCR產(chǎn)物的純化與重組質(zhì)粒pMD18-T-focA的構(gòu)建及重組質(zhì)粒酶切鑒定。用TIANgel Midi Purification Kit試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收，參照說明書進行具體操作。將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-Tsimple 用T4 DNA連接酶，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，用氨芐青霉素抗性平板和限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選鑒定陽性克隆。從氨芐抗性LB平板上挑取假定陽性菌落，用堿裂解法提取質(zhì)粒。取質(zhì)粒進行單酶切和雙酶切，根據(jù)是否出現(xiàn)與預計大小相符的目的片段來確定目的基因是否已插入到pMD18-T vector。（2）重組質(zhì)粒pColdTMTF-focA的構(gòu)建及重組質(zhì)粒酶切鑒定。用NdeI和BamHI雙酶切消化focA-pMD18-T，用TIANgel Midi Purification Kit試劑盒回收FocA片段；載體pColdTMTF的NdeI和BamHI的雙酶切產(chǎn)物，經(jīng)苯酚/氯仿抽提純化后，與focA片段在4℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。用氨芐青霉素抗性LB平板和限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選鑒定陽性克隆。根據(jù)是否出現(xiàn)與預計大小相符的目的片段來確定目的基因是否已插入到pColdTMTF載體。（3）序列測定。取陽性重組菌穿刺半固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)后，寄上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 focA基因在pColdTMTF-focA載體中的原核表達 focA基因在大腸桿菌中的原核表達參照文獻進行［8］：將提取的重組質(zhì)粒focA-pColdTMTF轉(zhuǎn)化到BL21 （DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單個菌落接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB中37℃培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物以1%的接種量于37℃擴大培養(yǎng)至OD600=0.4～0.5時，15℃靜置30 min后，加入IPTG誘導，終濃度分別為0.1、0.4、0.7、1.0 mmoL/L，15℃誘導培養(yǎng)24 h。離心收集菌體，用滅菌超純水洗滌沉淀后，超聲波裂解，4℃12 000 r/min離心5 min，分別取上清和沉淀制樣進行SDS-PAGE電泳，比較不同濃度IPTG誘導對focA基因表達的影響，SDS-PAGE參照文獻進行［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖1所示。利用設(shè)計的引物以菌株E.coli1613基因組DNA為模板成功地擴增出了特異性目的條帶，其大小與預計的540 bp相一致。

圖1　F1C菌毛focA基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

focA-pMD18-T重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI雙酶切的產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約2.7 kb和540 bp兩個條帶，初步證明此質(zhì)粒為含有目的基因的重組質(zhì)粒（圖2）；pColdTMTF-FocA用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI雙酶切的產(chǎn)物分別約為5.7 kb和540 bp（圖3）

2.3 序列測定結(jié)果分析

測序結(jié)果顯示，試驗所克隆的focA序列與已登錄NCBI的focA基因序列相一致，同時也進一步驗證了該試驗重組表達質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。

圖2　重組質(zhì)粒focA-pMD18-T的酶切圖譜

圖3　重組質(zhì)粒pColdTMTF-focA的酶切圖譜

2.4 重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物分析

用重組質(zhì)粒pColdTMTF-focA轉(zhuǎn)化E.coli BL21 （DE3）感受態(tài)細胞，獲得pCold-focA-BL21（DE3）重組菌；分別用0.1、0.4、0.7、1.0 mmol/L的IPTG誘導重組菌，發(fā)現(xiàn)不同濃度IPTG誘導，重組菌的蛋白表達量差別不大（圖4）。

圖4　SDS-PAGE電泳分析

IPTG誘導后取菌體裂解物進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導的重組菌菌體裂解物比未經(jīng)誘導的明顯多出一條分子量約為66 kD的特異條帶（標簽TF為48 kD，見圖4）。超聲波裂解菌體，發(fā)現(xiàn)蛋白存在于上清當中，即FocA蛋白在pColdTMTF-focA重組質(zhì)粒中表達后以可溶性融合蛋白的形式存在（見圖5）。

圖5　SDS-PAGE電泳分析

3 討 論

外源基因在大腸桿菌中原核表達，表達的蛋白往往以不溶的無活性包涵體形式存在。包涵體形成的原因很多，一般是由于蛋白合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行正確的折疊，或二硫鍵不能正確的配對，從而導致蛋白的非特異性結(jié)合，目的蛋白卻無法達到足夠的溶解度等［10］。與可溶性蛋白相比，包涵體具雖然有不易破碎、抗酸堿、抗酶解、產(chǎn)量較大等特點［11］，但重組蛋白以包涵體形式表達，將喪失了其生物活性。因此，必須對包涵體進行復性，才能得到具有正確空間構(gòu)象的蛋白，而體外復性蛋白質(zhì)的效率較低，且復性后蛋白的活性遠遠不及天然蛋白。

為探尋focA基因表達的最佳條件，試驗使用pCold表達系統(tǒng)表達FocA蛋白，通過對不同IPTG濃度誘導條件下重組菌蛋白表達進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)目的基因在pCold表達系統(tǒng)中于15℃下誘導24 h蛋白表達量最高，IPTG濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)都能表達目的基因，其中IPTG誘導濃度在0.1、0.4、0.7 和1.0 mmol/L時，目的蛋白表達量無明顯差異。超聲波裂解誘導后的重組菌菌液，目的蛋白存在于上清中，說明該重組蛋白是以可溶性形式存在。之前利用pET表達系統(tǒng)在37℃條件下加IPTG誘導，不表達FocA蛋白；而focA-pET22b（+）重組質(zhì)粒經(jīng)30℃在0.1～1.0 mmol/L IPTG誘導范圍內(nèi)都能表達目的基因，但目的蛋白是以包涵體形式存在。

要使外源性蛋白在大腸桿菌中可溶性表達，可以從宿主與載體的選擇、不同的培養(yǎng)條件、誘導方法等方面來進行探索。pCold表達載體采用了CspA啟動子，誘導溫度在15～37℃之間，其中以15℃誘導效果最佳；在低溫誘導條件下，其他細胞蛋白的表達受到抑制，細菌生長變得緩慢。這使得目的蛋白的表達量和純度得到增加，可以達到細胞蛋白的 60%。與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，其可溶性目的蛋白的表達量也大大增加。通過基因工程改造，目的蛋白在大腸桿菌中實現(xiàn)了可溶性表達，使得蛋白純化將不再需要對包涵體進行變性、復性等操作，大大簡化了表達程序和試驗步驟，節(jié)省了試驗時間，為目的蛋白的高效利用打下了基礎(chǔ)。

［1］ Manfred O，Heinz H，Klaus J，et al. Gene clusters for S fimbrial adhesin（sfa） and F1C fimbriae（foc）of Escherichia coli: comparative aspects of structure and function［J］. Journal of Bacteriology，1988，170：3983-3990.

［2］ Vaisanen-Rhen V，Elo J，Vilsinen E，et al. P-fimbriated clones among uropathogenic Escherichia coli strains［J］. Immun，1984，43：149-155.

［3］ Nico R，Ron K，Hans V V，et al. F1C fimbriae of a uropathogenic Escherichia coli strain：genetic and functional organization of the foc gene cluster and identification of minor subunits［J］. Journal of Bacteriology，1990，172：1114-1120.

［4］ 王海林，高向陽. 包涵體純化技術(shù)［J］. 生物技術(shù)通報，2007，（1）：78-79.

［5］ 翁偉平. GST-LRF融合蛋白純化及單克隆抗體的制備［D］. 楊陵：西北農(nóng)林科技大學，2008.

［6］ 張 喆，李 健，王 蕓，等. 中國對蝦細胞色素P450基因CYP4原核表達條件優(yōu)化［J］. 海洋科學，2011，35（9）：49-55.

［7］ 王倩囡. 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H15 ES抗原基因的原核表達及重組蛋白間接ELISA方法的建立［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2009.

［8］ 舒 燕. 金黃色葡萄球菌Fe攝取調(diào)節(jié)蛋白SirA的原核表達及其功能的初步研究［D］. 揚州：揚州大學，2011.

［9］ 劉俊斌. 987P菌毛蛋白FasG基因的克隆、表達及其單克隆抗體的制備［D］. 揚州：揚州大學，2006.

［10］ Palmer I，Wingfield P T. Preparation and extraction of insoluble（inclusion body）proteins from Escherichia coli［J］. Current Protocols In Protein Science，2004，16（4）：131-143.

［11］ 鄺愛麗，陳圓圓，彭志峰，等. 包涵體的形成原因及處理方法［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2009，（1）：62-63.

（責任編輯：成 平）

Prokaryotic Expression of Soluble FocA Protein with pColdTMTF Vector

ZENG Fa-jiao，SHU Yan， MIAO Dong，HU Xin-xu，ZENG Yan
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to express and purify F1C fimbriae mainly subunit FocA protein from uropathogenic Escherichia coli， this experiment expressed FocA protein in Escherichia coli BL21 （DE3） with pColdTMTF vector， verifiedits solublility， and optimized focA gene expression condition. The results showed that focA protein expression reached the highest in pCold expression system by IPTG induced for 24 h under 15℃， and there were no significant difference in expression under 0.1-1.0 mmol/L IPTG conditions. Moreover it was found that the target protein FocA-TF was soluble.

Escherichia coli； F1C fimbriae； FocA； prokaryotic expression

Q786

A

1006-060X（2016）07-0012-03

2016-04-22

湖南省自然科學基金資助項目（14JJ4070）

曾發(fā)姣（1980-），女，湖南茶陵縣人，經(jīng)濟師，主要從事動物健康養(yǎng)殖、動物微生態(tài)制劑研究。

曾 艷