粘性絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs區(qū)克隆與表達(dá)分析

代軍飛，?！′h，鐘　琦，吳慧昊

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730030)

?

粘性絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs區(qū)克隆與表達(dá)分析

代軍飛1，2，牛鋒2*，鐘琦1，吳慧昊2

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730030)

以粘性絲孢酵母BG基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用PCR方法克隆出BG基因的部分CDs區(qū)片段，并用RT-PCR方法分析了BG在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：克隆擴(kuò)增獲得長(zhǎng)為570 bp，編碼189個(gè)氨基酸的部分CDs區(qū)片段.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析粘性絲孢酵母BG基因在不同pH、C/N、溫度以及培養(yǎng)時(shí)間下的表達(dá)量.結(jié)果顯示培養(yǎng)溫度、pH、C/N對(duì)粘性絲孢酵母BG基因表達(dá)量無顯著性影響.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其具有顯著性影響，呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第3 d時(shí)表達(dá)量最高且極顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)期.此研究為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ).

粘性絲孢酵母； β-葡萄糖苷酶；CDs克隆；表達(dá)分析

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)作為糖苷水解酶家族成員，屬于纖維素水解酶系，主要參與水解位于末端非還原性，即糖基原子團(tuán)同芳基或烷基間的β-D-糖苷鍵生成葡萄糖，如β-葡萄糖苷和β-半乳糖苷，對(duì)于木糖及果糖苷也具有一定作用.β-葡萄糖苷酶最初由Liebig和Wohler在苦杏仁中分離得到，1977年sternberg等人提出β-葡萄糖苷酶可減少纖維二糖抑制纖維素酶作用提高水解活性，隨后對(duì)于β-葡萄糖苷酶的研究備受關(guān)注[1,2].許多研究表明，微生物的纖維素酶主要包括β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶組成.由于不同來源的酶具有不同的性質(zhì)，即使同一菌株也可分離純化出多種不同性質(zhì)的β-葡萄糖苷酶，其核苷酸同源關(guān)系也相對(duì)較遠(yuǎn).2001年有人在Asperglllus tubingenis分離出四種不同分子量和等電點(diǎn)等性質(zhì)的β-葡萄糖苷酶[3].水解纖維素產(chǎn)生的糖類能夠被發(fā)酵絲孢酵母利用合成微生物油脂.本試驗(yàn)旨在通過研究β-葡萄糖苷酶為發(fā)酵絲孢酵母高效利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)微生物油脂奠定一定的基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料與試劑

粘性絲孢酵母(EAM-AC16)為本實(shí)驗(yàn)室篩選、誘導(dǎo)得到的高產(chǎn)油酵母、克隆載體pMD19T克隆載體、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Taq酶與反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM II購(gòu)自大連寶生物公司.

1.2方法

1.2.1總RNA提取

液氮研磨預(yù)處理粘性絲孢酵母，根據(jù)Trizol法提取酵母總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

1.2.2引物設(shè)計(jì)

在Genbank上搜索β-葡萄糖苷酶，篩選出6個(gè)與粘性絲孢酵母親緣關(guān)系較近的物種.毛孢子菌屬：KLT42641.1，新型隱球菌grubii H99：XP_012053297.1，新型隱球菌：AAW47222.2，加特隱球菌：KGB79281.1，紅酵母菌：KPV74362.1，法夫酵母：CDZ96384.1的β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列，使用ClustalX對(duì)上述氨基酸進(jìn)行比對(duì).通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)有5處區(qū)域序列相對(duì)保守.選用與粘性絲孢酵母親緣關(guān)系較近的毛孢子菌屬核苷酸序列同時(shí)參照釀酒酵母密碼子偏好性設(shè)計(jì)引物(表1).PCR擴(kuò)增出目的基因片段.

1.2.3qRT-PCR表達(dá)分析

在相對(duì)定量檢測(cè)中，為比較不同樣本mRNA之間的表達(dá)量差異，需要各個(gè)樣本RNA濃度、質(zhì)量、目的基因擴(kuò)增效率相同，但樣本的不同導(dǎo)致這些條件不可能相同，因此需要合適的內(nèi)參基因來消除樣本不同所造成的差異[4].本實(shí)驗(yàn)選用26S作為內(nèi)參基因(參照王致鵬[5])，引物序列見表1.

表1引物序列

圖1　cDNA為模板梯度PCR電泳

圖2　粘性絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs區(qū)編碼蛋白序列

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1β-葡萄糖苷酶基因部分CDs區(qū)克隆

通過反轉(zhuǎn)錄得到粘性絲孢酵母的cDNA.根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增得到糖苷水解酶基因部分序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 ，結(jié)果顯示在550～600 bp處有一條清晰明亮的條帶(圖1)，符合預(yù)測(cè)PCR產(chǎn)物大小.測(cè)序結(jié)果與編碼蛋白結(jié)果如圖2，序列長(zhǎng)570 bp，編碼189個(gè)氨基酸.同NCBI上所下載其他物種β-葡萄糖苷酶利用Clustal X比對(duì)，克隆序列編碼蛋白序列比對(duì)結(jié)果見圖3.

圖3　β-葡萄糖苷酶cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種β-葡萄糖苷酶氨基酸序列多重比對(duì)

注：gi|831333084|(毛孢子菌屬)；gi|820655986|(測(cè)序結(jié)果氨基酸序列)； gi|953359472|(新生隱球菌neoformans JEC21)gi|799346173|(新生隱球菌grubii H99)；gi|686628345|(加特隱球菌R265)；gi|939612339|(紅酵母菌WP1)；gi|820655985|(法夫酵母).

2.2不同培養(yǎng)條件下β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)分析

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)結(jié)合SPSS軟件對(duì)發(fā)酵絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、碳氮比進(jìn)行差異表達(dá)分析，由圖4熔解曲線可知，內(nèi)參及目標(biāo)基因均只具有單一信號(hào)峰，說明內(nèi)參與β-葡萄糖苷酶基因沒有非特異性擴(kuò)增與引物二聚體.

對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期1 d、3 d、3.5 d和4 d的發(fā)酵絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行表達(dá)量分析，以培養(yǎng)3.5的β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量作為內(nèi)對(duì)照，結(jié)果如圖5所示.β-葡萄糖苷酶基因在四種不同培養(yǎng)時(shí)期均有表達(dá)，但表達(dá)量具有明顯差異.在培養(yǎng)3 d時(shí)基因表達(dá)量最高，并顯著高于其他時(shí)期.培養(yǎng)3.5 d基因表達(dá)量較第3 d時(shí)顯著減少，但顯著高于第1 d與第4 d，第4 d表達(dá)量最低.

不同培養(yǎng)溫度下對(duì)培養(yǎng)3 d的發(fā)酵絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行表達(dá)量分析，以30 ℃下培養(yǎng)3 d的β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量作為內(nèi)對(duì)照，結(jié)果如圖5所示.培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，基因表達(dá)量最高，其后依次為28 ℃、35 ℃、25 ℃.培養(yǎng)溫度在20～30 ℃時(shí)，β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量隨著溫度的升高而增加，在超過30 ℃后，隨溫度的增加而減少.雖然基因的表達(dá)量發(fā)生變化，但無顯著性差異.

不同碳氮比條件下，以26S為內(nèi)參，碳氮比2︰1時(shí)基因表達(dá)量為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行差異表達(dá)分析.結(jié)果顯示，培養(yǎng)3 d的發(fā)酵絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)C/N為10︰1時(shí)最大，碳氮比為2︰1時(shí)次之，碳氮比為0.5︰1時(shí)β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量最少.根據(jù)SPSS軟件分析結(jié)果顯示,不同碳氮比培養(yǎng)條件下β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量差異不顯著.

在初始pH分別為5、5.5、6、6.5的種子培養(yǎng)基中，以26S作為內(nèi)參基因，pH為6.5時(shí)培養(yǎng)3 d的β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量作為內(nèi)對(duì)照.對(duì)不同pH下培養(yǎng)3 d的發(fā)酵絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行表達(dá)量差異性分析.結(jié)果顯示pH為5.5時(shí)，基因表達(dá)量最高.在pH為5與6時(shí)表達(dá)量與內(nèi)對(duì)照組表達(dá)量相差不大.根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析pH為5與5.5時(shí)，培養(yǎng)3 d的酵母菌基因表達(dá)量差異不顯著.

圖4　β-葡萄糖苷酶基因熔解曲線與擴(kuò)增曲線

圖5　不同培養(yǎng)時(shí)期、溫度、碳氮比、pH下β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量

3　分析與討論

3.1β-葡萄糖苷酶基因部分CDs區(qū)克隆

目前,獲得β-葡萄糖苷酶基因最有效的手段就是利用序列的篩選定位分析[6].2000年Dan等人純化了黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因，測(cè)得N端氨基酸序列后設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆得到基因序列，現(xiàn)今黑曲霉的兩個(gè)β-葡萄糖苷酶基因bgl1和bgl2序列已全部獲得[7].然而,對(duì)于粘性絲孢酵母研究較少.目前僅有少數(shù)幾個(gè)基因部分序列被克隆出來.本實(shí)驗(yàn)利用不同物種β-葡萄糖苷酶氨基酸序列保守區(qū)域，以及同屬β-葡萄糖苷酶親緣關(guān)系相對(duì)較近，結(jié)合毛孢子菌屬β-葡萄糖苷酶基因和釀酒酵母密碼子偏好性設(shè)計(jì)引物，首次克隆出粘性絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs區(qū).經(jīng)過BLASTX比對(duì)分析，發(fā)酵絲孢酵母β-葡萄糖苷酶基因序列與毛孢子菌屬的β-葡萄糖苷酶基因相似度相對(duì)較高，同隱球菌屬同源關(guān)系次之.研究表明同屬β-葡萄糖苷酶基因在核苷酸來源、氨基酸序列和產(chǎn)物酶學(xué)性質(zhì)等方面相似性均較高，但來自不同屬的β-葡萄糖苷酶基因同源性極低[8，9].因此可以說明,克隆的目的基因?yàn)棣?葡萄糖苷酶基因部分在CDs區(qū).

3.2不同培養(yǎng)條件下β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)分析

環(huán)境是影響基因表達(dá)的重要因素之一，即使同種微生物在不同環(huán)境中也表現(xiàn)出不同的理化性質(zhì).對(duì)酵母而言，培養(yǎng)時(shí)間、溫度、碳氮比、pH是影響其生長(zhǎng)的主要環(huán)境因素.本試驗(yàn)研究了不同pH、C/N、溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BG基因表達(dá)量的影響.結(jié)果顯示pH、C/N、溫度對(duì)其表達(dá)量影響不顯著.與張玉芳[10]等人的研究結(jié)果相似，可作為研究粘性絲孢酵母在相同培養(yǎng)時(shí)期下相對(duì)定量的內(nèi)參候選基因之一.余培鎧[11]就曾以BG基因作為研究太瑞斯梭孢殼霉糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的候選內(nèi)參基因；在不同培養(yǎng)時(shí)期BG基因的表達(dá)量具有顯著性差異.在培養(yǎng)前期基因表達(dá)量顯著增大隨后下降.隋飛飛[12]在研究樺褐孔菌葡萄糖苷酶時(shí)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量在菌核發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)量也呈此種趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相似，說明BG基因表達(dá)量與酵母生長(zhǎng)時(shí)期顯著相關(guān).

綜上所述溫度、pH、碳氮比、培養(yǎng)時(shí)間四個(gè)考察因素中，培養(yǎng)時(shí)間是影響基因β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量的關(guān)鍵因素.

4　結(jié)論

首次克隆粘性絲孢酵母BG基因部分CDs區(qū)長(zhǎng)570 bp，編碼189個(gè)氨基酸的序列，并對(duì)其不同培養(yǎng)條件下差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示pH、碳氮比、溫度與培養(yǎng)時(shí)間四個(gè)考察因素中，培養(yǎng)時(shí)間是影響基因β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量的關(guān)鍵因素，為進(jìn)一步研究粘性絲孢酵母β-葡萄糖苷酶奠定基礎(chǔ).

[1] Wohler F, Liebig J. Ueber die bildung des bittermandelols[J]. Ann pharm, 1836, 22: 1-24.

[2] 沈志揚(yáng). 黑曲霉中纖維素酶的分離純化與表征及其動(dòng)力學(xué)作用機(jī)制[D].福建: 福州大學(xué)，2002.

[3] Decker C, Visser J, Schreier P. β-glucosidase multiplicity from Aspergillus tubingensis CBS 643.92: Purification and characterization of four β-glucosidase and their differentiation with respect to substrate specificity, glucose inhibition and acid tolerance[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 55(2): 157-163.

[4] 陳妍.八眉豬皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)及生脂基因組織表達(dá)[D].蘭州：西北民族大學(xué),2014.

[5] 王致鵬. 產(chǎn)油酵母菌合成生物油脂的研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué), 2014.

[6] 趙云. β-葡萄糖苷酶的分子生物學(xué)研究[D].北京:北京師范大學(xué),2004.

[7] Dan S, Marton I, Dekel M , et al. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase[J].J Biol Chem, 2000, 275(7): 4973-4980.

[8] Dion M, Fourage L, Hallet JN, et al. Cloning and expression of a beta-glucosidade gene from Thermus thermophilus. Sequence and biochemical characterization of the encoded enzyme[J]. Glycoconj J, 1999, 16(1): 27-37.

[9] 袁曉華. β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化及β-葡萄糖苷酶應(yīng)用研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2009.

[10] 張玉芳, 趙麗娟, 曾幼玲, 等. 基因表達(dá)研究中內(nèi)參基因的選擇與應(yīng)用[J].植物生理學(xué)報(bào),2014,50(8): 1119-1125.

[11] 余培鎧.太瑞斯梭孢殼霉糖代謝酶基因表達(dá)研究及組成型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建[D].深圳:深圳大學(xué), 2015.

[12] 隋飛飛,陳艷秋.樺褐孔菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆與定量表達(dá)分析[J].食用菌學(xué)報(bào)，2015, 22(3): 1-6.

【Abstract】秀BG(β-glucosidase) of Trichosporon mucoides was used as research subject., The partial CDs of 秀BG gene was cloned by polymerase chain reaction (PCR) from Trichosporon mucoides. 秀BG mRNA gene was examined in different culture conditions by RT-PCR. Results showed that the partial CDs of 秀BG gene was 570bp, which encoded 189 amino acids. 秀BG gene was analyzed in different pH, carbon and nitrogen ratio(C/N), temperature and time by RT-PCR. Temperature, pH and C/N had no significant effect on the expression of 秀BG gene in Trichosporon mucoides. whereas time was different from them. The expression level in 3d was significantly higher than that in other culture phase, and was decreased after increasing. This finding may provide basic data for further studying the role of β-glucosidase gene in Trichosporon mucoides.

Cloning and expression analysis of the partial CDs of β-glucosidase gene in Trichosporon mucoides

DAI Jun-fei1,2, NIU Feng2, ZHONG Qi1, WU Hui-hao2

(1.College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030;2.Science Experimental Center, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030)

Trichosporon mucoides; β-glucosidase;clone;expression

2016-02-20

降脂菌的篩選鑒定和開發(fā)利用(XBMU-2011-BC-40).

*

代軍飛(1989—)，男(滿族)，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與微生物營(yíng)養(yǎng)方面的研究

Q786；S828

A

1009-2102(2016)01-0033-05