HPLC法同時測定清心明目上清片中梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量

翟媛媛 ，師永清

(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

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HPLC法同時測定清心明目上清片中梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量

翟媛媛 ，師永清*

(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

目的：建立HPLC同時測定清心明目上清片中四種成分(梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿)含量的方法.方法： 色譜柱.AglientTC-C18(4.6mm×250mm,5μm) ,流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序依次為.0～10 min 18%B，10～12 min 20%～30%B，12～14 min30%～16%B，14～20 min 16%～28%B，20～30 min 28%～65%B,30～40 min 65%～80%B，流速0.9 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測波長分別為238 nm(梔子苷和連翹苷)、275 nm(黃芩苷和鹽酸小檗堿).結(jié)果： 梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿分別在0.031 1～0.622 2 μg (r=0.999 6),0.533 3～8.000 μg(r=0.999 6),0.080 0～1.600 0 μg(r=0.999 5)，0.115 6～1.155 6 μg(r=0.999 4)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為98.4%、98.3%、97.1%、98.2%.結(jié)論：本法操作簡便、精密度高、重現(xiàn)性好，適用于同時測定清心明目上清片中梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量.

清心明目上清片；高效液相色譜；梔子苷；連翹苷；黃芩苷；鹽酸小檗堿；含量測定

中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制研究中很重要的研究內(nèi)容是中成藥多指標(biāo)有效成分的含量測定，這種測定法可以全面控制藥品質(zhì)量和保障用藥安全.清心明目上清片收載于部委頒布標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》，由黃連、黃芩、連翹、熟大黃、梔子、赤芍等21味中藥組成[1].這種藥具有清熱散風(fēng)，明目止痛作用，臨床上用于焦火勝引起的暴發(fā)火眼， 紅腫痛癢，熱淚昏花,云翳遮睛，頭痛目眩，煩躁口渴,大便燥結(jié)等癥[2～3].本文參照相關(guān)文獻(xiàn)[3～7]，采用 HPLC 法同時測定清心明目上清片中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量.該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了科學(xué)依據(jù).

1　儀器與試劑

Agilennt1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，AB204-S型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，AS3120型雙頻數(shù)控超聲破清洗儀(天津奧特賽斯恩斯儀器有限公司)，DFT-200型萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，Advanced-I-24L型艾柯實驗室超純水機(成都艾柯水處理有限公司).

梔子苷(批號：110749-200410)、黃芩苷(批號：110715-201016)、連翹苷(批號：110821-200305)、鹽酸小檗堿(批號：110731-200609)，均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈(色譜純 ，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；甲醇(分析純 ，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；磷酸(分析純， 煙臺市雙雙化工有限公司)；清新明目上清片(太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司；批號：12070005、12100008、55110003).水為超純水，其他試劑均為分析純.

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：AglientTC-C18, 流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序依次為：0～10 min 18%B，10～12 min 20%～30%B，12～14 min 30%～16%B，14～20 min 16%～28%B，20～30 min 28%～65%B,30～40 min 65%～80%B，流速0.9 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測波長分別為238 nm(梔子苷和連翹苷)、275 nm(黃芩苷和鹽酸小檗堿).

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備

精密稱取減壓至恒重的梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿的對照品適量分別置于5 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，放冷至室溫，加甲醇定容，搖勻.制成梔子苷、黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿濃度分別為0.14 g·L-1、0.2 g·L-1、0.36 g·L-1、1.04 g·L-1的對照品儲備液.分別精密吸取上述對照品儲備液1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、0.5 mL，混合均勻，即得含梔子苷、黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿分別為0.0311 g·L-1、0.0533 g·L-1、0.1556 g·L-1、0.1156 g·L-1的對照品混合溶液，用0.45 nm的微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用.

2.2.2樣品溶液的制備

取清心明目上清片5片，除去糖衣，置研缽中研細(xì)，取粉末約0.5 g，精密稱定.置50 mL容量瓶中，加甲醇45 mL，超聲提取1 h，放冷至室溫，甲醇定容，靜置10 min.取其上清液，用0.45 nm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用.

2.2.3陰性樣品溶液的制備

圖1　混合對照品(A)、樣品(B)，陰性對照缺黃芩(C)，缺連翹(D)，缺鹽酸小檗堿(E)，缺梔子(F)在238 nm處的色譜圖

按清心明目上清片處方比例與制備工藝，分別制備梔子苷、黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿陰性樣品，按“2.2.2”下方法制備各陰性樣品溶液.

2.3專屬性檢驗

分別吸取對照品混合溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”下色譜條件進(jìn)樣，在238 nm 處檢測，色譜圖見圖1.結(jié)果,樣品溶液和對照品溶液色譜圖上有一保留時間相同的特征峰, 保留時間分別為6.4、16.5、21.7、32.4，而陰性樣品溶液在此保留時間無此特征峰，說明此方法專屬性良好.拖尾因子分別為0.98、0.95、1.05、1.02.

2.4精密度試驗

精密量取對照品混合溶液，按“2.1”下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5 次，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜圖.結(jié)果梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的RSD分別為0.5%、1.2%、0.7%、0.3%、0.6%，說明儀器精密度良好.

2.5線性關(guān)系考察

精密量取對照品混合溶液，按“2.1”下色譜條件，自動進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL，記錄峰面積.以對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的回歸方程分別為:Y=1223.3X+12.429(r=0.999 6)，Y=202.06X-44.868(r=0.999 6)，Y=3005.3X-39.638(r=0.999 5)，Y=1880.2X+21.985(r=0.999 4).線性范圍分別為0.031 1～0.622 2 μg，0.533 3～8.000 0 μg，0.080 0～1.600 0 μg，0.115 6～1.155 6 μg，線性關(guān)系良好.

2.6重復(fù)性檢查

取同一批號(12100008)清新明目上清片樣品6份，每份約0.5 g ，精密稱定，按“2.2.2”下方法制備樣品溶液，按“2.1”下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜圖.結(jié)果梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量平均值分別為2.656、17.054、15.934、2.090.RSD分別為1.8%、1.7%、1.7%、1.8%，表明方法重復(fù)性良好.

2.7穩(wěn)定性檢查

取同一批號(12100008)樣品的供試品溶液，室溫放置，每隔2 h進(jìn)樣一次，共10 h，按“2.1”下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，結(jié)果梔子苷、連翹苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的RSD分別為1.5%、1.1%、1.5%、0.8%，說明樣品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.8加樣回收率試驗

表1清心明目上清片中梔子苷、連翹苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿含量測定(n=3)

精密稱取同一批號樣品( 批號12100008 ) 約0.5 g，按“2.2.2”下方法制備樣品溶液，按“2.1”下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL.記錄峰面積，得梔子苷、連翹苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的回收率為98.4%、98.3%、97.1%、98.2%，RSD分別為1.1%、1.3%、1.5%、1.7%.

2.9樣品含量測定

取3種不同批號的樣品，每批各3份，按“2. 2. 2”下方法分別制備各樣品溶液，按“2. 1”下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，結(jié)果見表1.

3　討論

3.1提取溶劑、提取方法及提取時間的選擇

試驗中，提取溶劑分別比較了過甲醇(50%)，甲醇(85%)、甲醇(65%)、純甲醇，其中甲醇提取雜質(zhì)峰較少，被測成分峰面積較大，因此選用甲醇作為提取.比較溶劑用量分別為30 mL、50 mL、100 mL，發(fā)現(xiàn)50 mL提取效果好，因此應(yīng)將溶劑用量為50 mL.比較了超聲提取時間為30、60、80 min，各被測成分提取量大致相同，因此選擇超聲提取30 min.

3.2流動相的選擇

試驗中以一定比例的甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-甲醇-水等作為流動相，均采用梯度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相時，各組分峰形較好，分離度高，基線較穩(wěn)定，因此選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相.

3.3檢測波長的選擇

試驗中根據(jù)二極管陣列檢測器(PAD)得到的紫外吸收光譜圖輔助成分定性和選擇的各被測組分的檢測波長，可知梔子苷和連翹苷在238 nm處有最大吸收.黃芩苷和鹽酸小檗堿在275 nm處有最大吸收.故本試驗采用雙波長法，檢測波長分別為238 nm(梔子苷和連翹苷)，275 nm(黃芩苷和鹽酸小檗堿).

3.4小結(jié)

本文建立了HPLC同時測定清心明目上清片中梔子苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的方法.該方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，且在各組分最大吸收波長處分別測定其含量，該方法顯著提高了檢測靈敏度，為其內(nèi)在質(zhì)量的控制提供了科學(xué)依據(jù).

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2016-02-20

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翟媛媛(1996—)，女，河南南陽人.

[O611.5]；R286

A

1009-2102(2016)01-0013-05