自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和叉頭框蛋白O1在胃癌組織中的表達(dá)及其意義

陸會(huì)飛，牛小平*，沈浩，張偉（.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽　蕪湖400；.病理科）

自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和叉頭框蛋白O1在胃癌組織中的表達(dá)及其意義

陸會(huì)飛1，牛小平1*，沈浩1，張偉2
（1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽蕪湖241001；2.病理科）

目的：探討自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3）和叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）在胃癌組織中的表達(dá)及其意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測29例胃癌組織和癌旁正常組織中自噬相關(guān)基因LC3和FoxO1的表達(dá)情況，分析自噬相關(guān)基因表達(dá)水平與臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果：免疫組化結(jié)果提示LC3蛋白、FoxO1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織（P＜0.01）。LC3蛋白表達(dá)水平與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、侵及胃壁深度明顯相關(guān)，與患者的性別、年齡、胃癌發(fā)生部位及大小無明顯相關(guān)性；FoxO1蛋白表達(dá)水平與胃癌的分化程度明顯相關(guān)，與患者的性別、年齡、胃癌發(fā)生部位、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、侵及胃壁深度無明顯相關(guān)性。結(jié)論：自噬相關(guān)基因LC3和FoxO1在胃癌組織中表達(dá)水平增高，均與胃癌的分化程度相關(guān)，且FoxO1高表達(dá)是胃癌早期頻發(fā)事件，提示自噬活動(dòng)水平的上調(diào)對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要促進(jìn)作用。

胃癌；自噬；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；叉頭框蛋白O1

doi：10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.04.005

［Abstract］Objective：To investigate the expression of autophagy related genes microtubule-associated protein 1 light 3（LC3）and forkhead box protein 1 light 3（FoxO1）in gastric cancer tissues and its significance.Methods：The expression of LC3 and FoxO1 protein were examined by immunohistochemical SP method in 29 gastric cancer tissues and adjacent cancer tissues，their relationship with some tumor pathological parameters was analyzed.Results：The positive rates of expression of LC3 and FoxO1 protein in gastric cancer tissues were significantly higher than those in adjacent cancer tissues（P＜0.01）.The expression level of LC3 in gastric cancer tissues was significantly correlated with tumor differentiation，lymph node metastasis，clinical stage and depth of tumor invasion，while it had no correlation with gender，age，tumor location and size of gastric cancer.The expression level of FoxO1 in gastric cancer was significantly correlated with tumor differentiation，while it had no correlation with gender，age，tumor location，size of gastric cancer，lymph node metastasis，clinical stage and depth of tumor invasion.Conclusion：Expression level of autophagy related genes LC3 and FoxO1 increased in gastric cancer tissues，and both of them are correlated with tumor differentiation，moreover，a high expression of FoxO1 is an frequent event in early gastric cancer，which suggested that increased level of autophagy activity plays an important role in promoting the occurrence and development of gastric cancer.

［Key words］gastric cancer；autophagy；LC3；FoxO1

自噬是一種復(fù)雜的降解代謝過程，多種自噬相關(guān)基因如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubuleassociates protein 1 light 3，LC3）、叉頭框蛋白O1 （forkheas box protein O1，F(xiàn)oxO1）和Beclin1等通過復(fù)雜而有序的調(diào)控來介導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生［1］。無論正常的生理過程還是異常的病理過程，均有不同程度的自噬活動(dòng)參與，腫瘤的發(fā)病過程亦不例外［2］。本研究通過檢測胃癌及癌旁組織中自噬相關(guān)基因LC3和FoxO1的表達(dá)水平，以探討自噬水平與胃癌發(fā)病過程的關(guān)系，為胃癌的治療提供一定的理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料選取皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院2011 年1月至2012年12月行手術(shù)切除的29例胃癌組織標(biāo)本，并選取相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本29例作為對(duì)照組，所有標(biāo)本的臨床和病理資料均完整，均未接受過放化療等治療。

1.2主要試劑兔抗人LC3多克隆抗體和兔抗人FoxO1單克隆抗體分別由日本MBL公司和美國CST公司生產(chǎn)。

1.3方法采用免疫組化SP法染色，對(duì)所有標(biāo)本組織進(jìn)行固定、水洗、脫水、浸蠟、包埋、切片，后經(jīng)脫蠟、水化、熱抗原修復(fù)；修復(fù)后經(jīng)冷卻、磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，滴加一抗（其中FoxO1以1∶150稀釋，LC3以1∶200稀釋）孵育切片過夜，用PBS代替一抗作對(duì)照；二抗孵育切片，滴加SP試劑，DAB染色、蘇木素復(fù)染、樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判定免疫組化結(jié)果采用盲法由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，部分不一致的結(jié)果經(jīng)共同商討后最終達(dá)成共識(shí)。

LC3依據(jù)Choi等［3］的判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)切片中陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占同一視野下總細(xì)胞數(shù)的比率分別進(jìn)行評(píng)估。陽性細(xì)胞比率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無陽性細(xì)胞；1分，陽性細(xì)胞數(shù)＜30％；2分，陽性細(xì)胞數(shù)≥30％。染色深度評(píng)分：0分，無染色；1分，淡黃色；3分，黃色至棕黃色；1分和3分之間的染色強(qiáng)度為2分。將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞比率評(píng)分相加的和即為總分值，總分值≥2分為陽性，＜2分為陰性。FoxO1依據(jù)Kim等［4］的判定標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)oxO1在癌細(xì)胞的表達(dá)超過全片的10％即判定為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，采用Spearman相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組織和癌旁正常組織中LC3和FoxO1蛋白的表達(dá)水平免疫組化SP法染色的組織切片在電子顯微鏡下觀察后，發(fā)現(xiàn)LC3蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不同程度表達(dá)，而FoxO1蛋白在細(xì)胞核中不同程度表達(dá)，見圖1。LC3蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率［62.1％（18/29）］高于癌旁正常組織［27.6％ （8/29）］（χ2=5.267，P＜0.01）；FoxO1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率［55.2％（16/29）］高于癌旁正常組織［17.2％（5/29）］（χ2=9.032，P＜0.01）。

2.2LC3和FoxO1蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系LC3蛋白表達(dá)水平與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、侵及胃壁深度明顯相關(guān)（P＜0.05），與患者的性別、年齡、胃癌發(fā)生部位及大小無關(guān)（P＞0.05）。FoxO1蛋白表達(dá)水平與胃癌的分化程度相關(guān)（P＜0.01），與胃癌的發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、侵及胃壁深度、大小及患者的性別、年齡無相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

圖1　LC3和FoxO1蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)（免疫組化SP染色，×200）

表1　LC3和FoxO1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3胃癌組織中LC3和FoxO1蛋白表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman相關(guān)分析，LC3和FoxO1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（r=-0.133，P＞0.05），見表2。

表2　胃癌組織中LC3和FoxO1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3　討論

胃癌是全球第5位高發(fā)惡性腫瘤，并且位居惡性腫瘤死因順位第3位，約有50％的全球新發(fā)病例出現(xiàn)在東亞，尤其在中國［5］。盡管治療腫瘤的各種方法在不斷發(fā)展，但在大部分國家胃癌的5年生存率仍不超過30％［6］。因此，積極探索胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找影響胃癌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素是改善胃癌治療效果的重要途徑，而自噬靶向治療胃癌成為近年來胃癌治療方法的研究熱點(diǎn)。自噬是一種高度保守的多步驟的代謝過程，通過降解發(fā)生病變的細(xì)胞器和已受損的蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及基因組的完整性［7］，其在眾多腫瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在腫瘤形成早期可通過降解損傷細(xì)胞器和啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡等途徑而抑制腫瘤的形成［8］，相反，自噬的發(fā)生可使腫瘤細(xì)胞在中晚期時(shí)對(duì)抗因血供不足造成的營養(yǎng)缺乏和缺氧致腫瘤細(xì)胞不斷繁殖增長，可以看出自噬在腫瘤發(fā)病過程中飾演著雙重角色，學(xué)者們現(xiàn)在普遍接受的假說是自噬促進(jìn)了腫瘤的建立與發(fā)展，但抑制了腫瘤的啟動(dòng)。此外，饑餓、營養(yǎng)不良、接觸放射線以及缺氧等生理和病理狀態(tài)均能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，且細(xì)胞自噬的發(fā)生過程在分子水平上受多種自噬相關(guān)基因如LC3、FoxO1及Beclin1等的調(diào)控。

LC3是自噬體的重要組成部分，分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型LC3即LC3?Ⅱ基因始終位于胞內(nèi)自噬體膜上，是自噬體的標(biāo)志性基因，其含量代表了自噬體的數(shù)目。本研究所測LC3基因均為LC3?Ⅱ基因。目前，自噬相關(guān)基因在胃癌中研究較少，Liao等［9］研究表明，胃癌組織中LC3基因表達(dá)水平是明顯升高的，提示LC3基因相關(guān)的自噬水平在胃癌組織中是上調(diào)的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LC3?Ⅱ蛋白在胃癌組織中表達(dá)水平較癌旁正常組織明顯增高；相比高、中分化胃癌，TNMⅠ、Ⅱ期，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未侵及漿膜者，LC3?Ⅱ蛋白在低分化，TNMⅢ、Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵及漿膜的胃癌組織中的自噬水平進(jìn)一步上調(diào)，推測惡性程度越高和進(jìn)展期胃癌自噬活動(dòng)水平明顯上調(diào)，并且腫瘤細(xì)胞可通過上調(diào)自身自噬水平來促進(jìn)其增殖生長［9］，提示LC3相關(guān)的自噬水平上調(diào)對(duì)胃癌的發(fā)展具有重要促進(jìn)作用。

FoxO轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的自噬調(diào)控相關(guān)因子，以FoxO3和FoxO1的作用最為廣泛。FoxO在血管、腦組織、肝臟、胃腸道等組織器官中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、代謝等過程。研究表明，F(xiàn)oxO1基因與食管癌［10］、前列腺癌、肺癌等腫瘤的發(fā)病過程關(guān)系密切，同時(shí)，Visal等［11］研究發(fā)現(xiàn)FoxO1的高表達(dá)可持續(xù)上調(diào)自噬活性水平進(jìn)而在腫瘤的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。Kim等［4］進(jìn)行了FoxO1在胃癌方面的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)FoxO1表達(dá)是胃癌形成的早期頻發(fā)事件；周英姿等［12］報(bào)道FoxO1在正常胃黏膜中和低分化腺癌不表達(dá)或低表達(dá)，而在高、中分化腺癌中表達(dá)較高。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中FoxO1蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃組織（P＜0.05），且在高、中分化胃癌組織中陽性表達(dá)率高于低分化胃癌（P＜0.01）。結(jié)合以上研究結(jié)果，推測FoxO1高表達(dá)是胃癌發(fā)生的早期頻發(fā)事件，且其相關(guān)的自噬活動(dòng)水平上調(diào)對(duì)胃癌的發(fā)生起著重要的促進(jìn)作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中自噬相關(guān)基因LC3和FoxO1蛋白的表達(dá)水平增高，均與胃癌的分化程度相關(guān)，且FoxO1高表達(dá)是胃癌早期頻發(fā)事件，提示自噬活動(dòng)水平的上調(diào)對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要促進(jìn)作用，但是其在胃癌發(fā)病過程中的具體機(jī)制尚未明確闡述。深入研究自噬在胃癌發(fā)病中的詳細(xì)機(jī)制對(duì)開辟靶向藥物治療胃癌的新途徑有著重要意義。

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（文敏編輯）

Expression of Autophagy Related Genes LC3 and FoxO1 in Gastric Cancer and Its Significance

LU Huifei1，NIU Xiaoping1*，SHEN Hao1，ZHANG Wei2
（1.Department of Gastroenterology，Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China；2.Department of Pathology）

R735.2

A

1008-2344（2016）04-0242-03

牛小平（1975—），女（漢），醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤的診治.E-mail：47440311@qq.com

2016-03-08