4種解釋系統(tǒng)對HIV-1基因型耐藥解釋相關(guān)性評價(jià)

赫天一，關(guān)琪（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧　沈陽110024）

4種解釋系統(tǒng)對HIV-1基因型耐藥解釋相關(guān)性評價(jià)

赫天一，關(guān)琪*
（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽110024）

目的：比較HIVDB（7.0.1）、ANRS（25_09/2015）、REGA（9.1.0）和HIV GRADE（12/2015）4種解釋系統(tǒng)對HIV-1基因型耐藥結(jié)果解釋的一致性。方法：選取我國3種主要HIV-1流行亞型和流行重組模式（B'、CRF01_AE和CRF07_BC），每種選取200條序列，共600條序列。分別用4種解釋系統(tǒng)進(jìn)行耐藥結(jié)果分析，分為耐藥（R）、中度耐藥（I）和敏感（S）3個(gè)水平。對4種結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：4種系統(tǒng)基因型耐藥解釋結(jié)果比較相關(guān)性較高（r均＞0.57，P均＜0.01）。針對亞型來說，CRF07_BC的解釋結(jié)果相關(guān)性最高，其次為B'亞型，CRF01_AE略低。結(jié)論：對于我國主要流行的HIV來說，4種解釋系統(tǒng)對11種常用的抗病毒治療藥物耐藥結(jié)果的解釋具有較好的一致性。

HIV-1；基因型耐藥解釋系統(tǒng)；耐藥突變

doi：10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.04.004

［Abstract］Objective：To compare the correlation of four drug-resistance interpretation system including HIVDB，ANRS，REGA and HIV GRADE for testing HIV-1 genotype drug resistance.Methods：Trendy subtypes and restructuring model of HIV-1 including B'，CRF01＿AE and CRF07_BC were selected，each genotype was 200 series，600 samples were analyzed by four drug?resistance interpretation system，the results were divided into three levels including resistance（R），possible drug?resistance （I）and susceptible（S）.Results：Four drug?resistance interpretation system had a high correlation in genotypic drug?resistance consequence（rs＞0.57，P＜0.01），CRF07_BC had the highest correlation，followed by subtype B，CRF01_AE was slightly lower.Conclusion：Four drug?resistance interpretation system has a high correlation in analyzing antiviral drug resistance for major epidemic of HIV in China.

［Key words］HIV-1；genotype resistant interpretation system；drug?resistant mutation

基于生物信息學(xué)方法建立的基因型耐藥分析技術(shù)，能夠在進(jìn)行抗病毒治療之前，對患者基因型進(jìn)行檢測，并結(jié)合分析結(jié)果制定最優(yōu)的抗病毒治療方案，它不僅能夠降低由耐藥性導(dǎo)致的治療失敗，甚至有可能決定抗病毒治療的成敗，因而在HIV-1抗病毒治療中起到非常重要的作用，本文比較了4種最為常用的基因型耐藥解釋系統(tǒng)HIV DB、ANRS、REGA和HIV GRADE，針對我國主要流行的3種HIV-1病毒亞型解釋結(jié)果上的異同，以期篩選出最符合我國國情的基因型耐藥解釋系統(tǒng)。

1　資料與方法

1.1一般資料本研究以我國主要流行的3種HIV-1亞型和流行重組模式（B'、CRF01_AE和CRF07_BC）為研究對象，檢索NCBI序列數(shù)據(jù)庫中2012至2015年中國地區(qū)HIV-1感染者pol基因區(qū)序列（n=600）并進(jìn)行分析。

1.2方法從NCBI共獲得600條我國3種主要HIV-1流行亞型和流行重組模式的病毒序列（B'、CRF01_AE和CRF07_BC），分別利用HIV DB［1］、ANRS［2］、REGA［3］和HIV GRADE［4］進(jìn)行耐藥分析，比較11種藥物基因型耐藥解釋結(jié)果的相關(guān)性情況。包括7種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleo?side reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）：3TC （lamivudine，拉米夫定）、ABC（abacavir，阿巴卡韋）、AZT（zidovudine，齊多夫定）、D4T （stavu?dine，司他夫定）、DDI（didanosine，地達(dá)諾新）、FTC（emtricitabine，恩曲他濱）和TDF（tenofovirdisoproxil fumarate，替諾福韋酯）；4種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptaseinhibitors，NNRTIs）：EFV（efavirenz，依非韋倫）、ETR（etravirine，依曲韋林）、NVP（nevi-rapine，奈韋拉平）和RPV （rilpivirine，利匹韋林）。

4種解釋系統(tǒng)對耐藥程度的劃分標(biāo)準(zhǔn)并不相同，其中HIV DB一般將耐藥程度劃分為以下5個(gè)區(qū)間：敏感、潛在低度耐藥、低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥［5］。ANRS和REGA的耐藥程度劃分只包括敏感、中度耐藥、耐藥。HIV GRADE則分為過敏、敏感、敏感度受限、中度耐藥和耐藥。

本文為了方便分析和比較，將4種分析獲得的耐藥解釋結(jié)果統(tǒng)一合并為三個(gè)水平：敏感（包括過敏、敏感和潛在低度耐藥）、中度耐藥（包括敏感度受限和低度耐藥）和耐藥。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HIV GRADE、ANRS、HIV DB和REGA耐藥解釋結(jié)果一致性分析GRF01_AE中ANRS和HIV GRADE、HIV DB的相關(guān)系數(shù)最低，分別為0.57和0.586，其余方法間兩兩比較相關(guān)性較好（r=0.7～0.895，P＜0.01）。B'亞型中4種系統(tǒng)間的相關(guān)系數(shù)一致性較高（r=0.768～0.882，P＜0.01）。CRF 07_BC中4種系統(tǒng)間的相關(guān)性在3種亞型中最好（r=0.817～0.916，P＜0.01）。在研究中涉及到的兩大類藥品CRF 01_AE和CRF 07_BC中，NNRTIs藥品基因型耐藥分析結(jié)果（r=0.894、0.843，P＜0.01）一致性高于NRTIs（r=0.742、0.828，P＜0.01），B'亞型中則是NRTIs（0.831）高于NNRT Is（0.79）。見圖1～圖3和表1。

4種系統(tǒng)耐藥解釋結(jié)果差別最小的是CRF07_BC。CRF07_BC中4種方法對3TC、AZT、FTC、TDF、NVP的耐藥解釋結(jié)果完全相同，而4種方法對EFV解釋為耐藥（R）的比例完全相同，但對于中度耐藥（I）和敏感（S）存在差別，對于ABC、D4T來說，HIV GRADE和ANRS結(jié)果一致，另外2種方法的差別比較明顯。針對于DDI、ETR和RPV，4種方法差別比較明顯，相對于其他3種系統(tǒng)，ANRS的結(jié)果耐藥比例較高，見圖3。CRF01_AE中，4種方法對3TC、FTC、NVP的耐藥解釋結(jié)果基本一致，對其余8種藥物的耐藥解釋水平存在明顯差異，見圖1。B'亞型的解釋結(jié)果一致性程度介于CRF01_AE和CRF07_BC之間。4種方法對3TC、FTC、NVP 3種藥品的耐藥（R）解釋結(jié)果基本一致，但對于中度耐藥（I）和敏感（S）的解釋存在差異；對AZT、D4T、EFV 3種藥物解釋為敏感（S）的比例完全相同，而關(guān)于中度耐藥（I）和耐藥（R）的解釋存在差異，對ABC、DDI、TDF、ETR、RPV 5種藥物的耐藥水平解釋存在差異，見圖2。

圖1　不同系統(tǒng)對CRF01_AE亞型解釋的結(jié)果比較

2.2影響4種系統(tǒng)耐藥解釋結(jié)果一致性的主要耐藥突變在CRF07_BC中，4種耐藥解釋系統(tǒng)對3TC、AZT、NVP、FTC和TDF的耐藥解釋結(jié)果完全相同，對于其他幾種藥物則存在差別；在B'亞型和CRF01_AE中，4種耐藥解釋系統(tǒng)對11種藥物的耐藥解釋結(jié)果均存在不同程度的差異，3種亞型都存在針對不同治療藥物的亞型依賴耐藥突變，主要耐藥突變位點(diǎn)分別見表2～表4。M184V引起3TC和FTC的高度耐藥，G190A引起NVP和EFV的耐藥，Y181C引起NVP和DLV的高度耐藥，這些耐藥突變形式在很大程度上影響耐藥解釋結(jié)果的相關(guān)性程度。

圖2　不同系統(tǒng)對B'亞型解釋的結(jié)果比較

圖3　不同系統(tǒng)對CRF07_BC亞型解釋的結(jié)果比較

注：4種解釋系統(tǒng)結(jié)果兩兩比較的相關(guān)系數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

3　討論

從1985年我國首次發(fā)現(xiàn)艾滋病至2003年推出“四免一關(guān)懷”政策，高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒（highly active antiretroviral therapy，HAART）治療取得了良好效果［6］，在降低并發(fā)癥和死亡率的同時(shí)提高了患者的生活質(zhì)量。然而，隨著治療的深入，治療失敗現(xiàn)象愈加頻發(fā)，其最主要的原因就是耐藥毒株的出現(xiàn)。2007年中國艾滋病防治聯(lián)合評估報(bào)告顯示我國治療人群中的耐藥突變發(fā)生率高達(dá)17％［7］，這也意味著治療前的耐藥檢測必不可少［8］。本文利用HIV GRADE、ANRS、HIV DB、REGA 4種解釋系統(tǒng)對600份樣本的11種抗病毒藥物基因型耐藥檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢測后發(fā)現(xiàn)，4種解釋系統(tǒng)之間具有很高的相關(guān)性，兩兩比較相關(guān)系數(shù)為r=0.57～0.916（P＜0.01），以上結(jié)果與之前報(bào)道的其他結(jié)果［9］類似。針對于CRF01_AE亞型來說，HIV GRADE、HIV DB、REGA 3種系統(tǒng)兩兩之間耐藥解釋結(jié)果相關(guān)性程度較好（r=0.895、0.857、0.833），僅ANRS和其他3種系統(tǒng)的耐藥解釋結(jié)果相關(guān)性略低（r= 0.57、0.586、0.706），但其與REGA間預(yù)測的相關(guān)性較好，這與其他研究結(jié)果［3，10］一致。

表2　B'亞型中導(dǎo)致4種解釋結(jié)果出現(xiàn)差異的主要耐藥突變形式

表4　CRF01_AE亞型中導(dǎo)致4種解釋結(jié)果出現(xiàn)差異的主要耐藥突變形式

在基因型層面：4種解釋系統(tǒng)對3種亞型耐藥解釋結(jié)果相關(guān)性程度存在略微差別，從低到高依次是CRF01_AE、B'亞型、CRF07_BC。研究發(fā)現(xiàn)，在CRF01_AE［11］，CRF07_BC和B'［12］3種亞型中，逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)分別存在12個(gè)、8個(gè)和3個(gè)氨基酸替換率＞50％的基因位點(diǎn)，主要突變形式為CRF01_AE（K219E、D67N、M184V、K65R），CRF07_BC（K65R、V179D、E138A、Y188L），B'（M41L、T215Y、L210W、D67N）。結(jié)合本文結(jié)果，CRF01_AE具有3個(gè)亞型中最低的相關(guān)性，可能就是因?yàn)镃RF01_AE具有更為復(fù)雜的突變種類和突變組合形式導(dǎo)致的［13］。同時(shí)，作為我國主要流行毒株，CRF01_AE主要在性傳播人群和吸毒人群中流行［14-15］，這些人群中HIV-1病毒傳播速度快，耐藥突變產(chǎn)生的頻率高等原因也都可能導(dǎo)致耐藥解釋結(jié)果相關(guān)性降低［16-17］。在抗病毒藥物層面：對常見的11種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑檢測結(jié)果分析顯示，在CRF01_AE和CRF07_BC 2個(gè)流行重組模式中，最一致的結(jié)果出現(xiàn)在NNRTIs類藥物的耐藥預(yù)測上，其次是NRTIs，與之前報(bào)道［2，10］相符，但在B'亞型中，情況正好相反。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是NRTIs類耐藥突變比NNRTIs具有更為復(fù)雜的耐藥突變模式以及突變間存在復(fù)雜的相互作用和組合形式。此外相關(guān)性程度差異的產(chǎn)生原因主要有以下幾個(gè)方面：首先，4種耐藥解釋系統(tǒng)的分析原理、數(shù)據(jù)庫、耐藥程度劃分和分析形式上都略有不同；其次，4種系統(tǒng)檢測出的耐藥相關(guān)位點(diǎn)和組合方式（混合堿基［11］）也略有差異；最后，本研究只針對基因型耐藥解釋結(jié)果進(jìn)行了分析和比較，并未結(jié)合表型耐藥結(jié)果，也會影響結(jié)果的判別。

本文針對我國主要流行的3種亞型和流行重組模式HIV-1，11種相關(guān)抗病毒治療藥物進(jìn)行了基因型耐藥解釋的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)4種基因型耐藥解釋系統(tǒng)間存在著較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性和較好的結(jié)果解釋一致性。從整體上看，上述幾種HIV-1基因型耐藥解釋系統(tǒng)，可對我國HIV-1基因型耐藥程度進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測，同時(shí)可對耐藥突變位點(diǎn)和各突變位點(diǎn)間的復(fù)制作用進(jìn)行加權(quán)評估，適合于我國HIV?1的耐藥性評價(jià)。由上述可見，HIV GRADE、ANRS、HIV DB、REGA 4種基因型耐藥解釋系統(tǒng)均可用于指導(dǎo)我國主要流行HIV-1感染者的治療方案的選擇［18-19］，對我國HIV-1的防治具有重要的意義?？紤]到數(shù)據(jù)庫規(guī)模、更新程度、應(yīng)用范圍的原因，HIV DB更為推薦。

［1］Sterrantino G，Zaccarelli M，Di Biagio A，et al.Darunavirbaseddualtherapyoftreatment-experiencedHIV-infected patients：analysis from a national multicenter database［J］. Infection，2015，43（3）：339-343.

［2］Frange P，Assoumou L，Descamps D，et al.HIV-1 subtype B-in-fected MSM may have driven the spread of transmitted resistant strains in France in 2007-12：impact on susceptibility to first?line strategies［J］.J Antimicrob Chemother，2015，70 （7）：2084-2089.

［3］Houssaini A，Assoumou L，Miller V，et al.Scoring methods for building genotypic scores：an application to didanosine resistance in a large derivation set［J］.PLoS One，2013，8（3）：e590 14.

［4］Meixenberger K，Yousef KP，Somogyi S，et al.Characterization of natural polymorphic sites of the HIV-1 integrase before the introduction of HIV-1 integrase inhibitors in Germany［J］.J Int AIDSSoc，2014，17（4 Suppl 3）：19746.

［5］Kim JY，Kim EJ，Choi JY，et al.Genetic variation of the HIV-1 integrase region in newly diagnosed anti?retroviral drugna?ve patients with HIV/AIDS in Korea［J］.Clin Microbiol Infect，2011，17（8）：1155-1159.

［6］Xing H，Wang X，Liao L，et al.Incidence and associated factors of HIV drug resistance in Chinese HIV-infected patients receiving antiretroviral treatment［J］.PLoS One，2013，8 （4）：e62408.

［7］國務(wù)院防治艾滋病工作委員會辦公室，聯(lián)合國艾滋病中國專題組.中國艾滋病防治聯(lián)合評估報(bào)告（2007）［R］.北京，2007.

［8］Gonzalez D，Digmann B，Barralon M，et al.Comparison of HIV-1 drug resistance profiles generated from novel software applications for routine patient care［J］.J Int AIDS Soc，2014，17（4 Suppl3）：19751.

［9］Snoeck J，Kantor R，Shafer RW，et al.Discordances between interpretation algorithms for genotypic resistance to protease and reverse transcriptase inhibitors of human immunodeficiency virus are subtype dependent［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（2）：694-701.

［10］李晶，蔣巖，呂超，等.三種HIV-1基因型耐藥檢測方法的一致性評價(jià)［J］.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，47（11）：1050-1055.

［11］Zhou Z，Wagar N，DeVos JR，et a1.Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistancesurveillanceandmonitoringinresource-limited settings［J］.PLoS One，2011，6（11）：e28184.

［12］Li Y，Uenishi R，Hase S，et al.Explosive HIV-1 subtype B' epidemics in Asia driven by geographic and risk group founder events［J］.Virology，2010，402（2）：223-227.

［13］Guo H，Xu X，Hu H，et al.Low prevalence of the transmitted HIV-1 drug resistance among newly diagnosed HIV-1 individuals duals in Jiangsu Province，China during 2009-2011［J］.BMC Public Health，2015，15：120.

［14］蘇迎盈，劉慧鑫，吳靜，等.中國HIV-1基因亞型分布及流行趨勢［J］.中國流行病學(xué)雜志，2014，35（10）：1164-1168.

［15］Feng Y，He X，Hsi JH，et al.The rapidly expanding CRF01_ AE epidemic in China is driven by multiple lineages of HIV-1 viruses introduced in the1990s［J］.AIDS，2013，27（11）：1793-1802.

［16］Zhang L，Wang YJ，Wang BX，et al.Prevalence of HIV-1 subtypes among men who have sex with men in China：a systematic review［J］.Int J STD AIDS，2015，26（5）：291-305.

［17］Zhou HW.Analysis of Resistance-Associated Genetic Characteristic from Subtype B，CRF01_AE and CRF07_BC Isolates Prevailing in China［R］.Chinese Center for Disease Control and Prevention，2008.

［18］余水勤.HIV的基因突變與其耐藥性［J］.傳染病信息，2011，14（4）：156-159.

［19］赫天一，關(guān)琪，王禮寧.不同基因型耐藥分析系統(tǒng)在HIV耐藥預(yù)測中的應(yīng)用［J］.中國生化藥物雜志，2015，35 （7）：182-184.

（文敏編輯）

Evaluation of the Correlation of Four System for Testing HIV-1 Genotype Drug Resistance

HE Tianyi，GUAN Qi*
（Central Lab of the Central HospitalAffiliated to Shenyang Medical Collage，Shenyang 110024，China）

R512.91

A

1008-2344（2016）04-0237-05

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2013020210）；沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（F16-206-9-15）；沈陽醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目（No. 20142049；20123044）

赫天一（1987—），女（滿），碩士，檢驗(yàn)師.研究方向：感染性和遺傳性疾病分子診斷.E-mail：candy_1004_cnady@sina.com

關(guān)琪（1969—），男（錫伯），博士，教授，主任檢驗(yàn)師.研究方向：感染性和遺傳性疾病分子診斷.E-mail：guanqi1231@sina. com

2016-03-15