瘦素誘導(dǎo)乳腺癌三陰細(xì)胞系MDA-MB-231侵襲的形態(tài)學(xué)觀察

周偉強(qiáng)（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧　沈陽(yáng)110034）

瘦素誘導(dǎo)乳腺癌三陰細(xì)胞系MDA-MB-231侵襲的形態(tài)學(xué)觀察

周偉強(qiáng)
（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110034）

目的：研究瘦素對(duì)乳腺癌三陰細(xì)胞系MDA-MB-231侵襲力的影響。方法：采用細(xì)胞劃痕、Transwell細(xì)胞侵襲力測(cè)定等方法從形態(tài)學(xué)角度觀察瘦素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲力產(chǎn)生的影響。結(jié)果：與對(duì)照組相比，瘦素可顯著增強(qiáng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞向劃痕中心移走的能力。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瘦素處理后的乳腺癌細(xì)胞侵襲性較對(duì)照組細(xì)胞明顯增強(qiáng)，穿透Transwell基底膜的細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞鋪展良好，顯示出較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)論：瘦素可誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的游走，增強(qiáng)其侵襲力。

瘦素；乳腺癌；MDA-MB-231；侵襲力

doi：10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.04.003

［Abstract］Objective：To study the influence of Leptin on cell invasiveness in triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231.Method：Cell scratching and Transwell invasion assay were used to observe the impact of Leptin on cell invasiveness. Results：Compared with the control group，Leptin could significantly enhance the MDA-MB-231 migration to the center of scratches.Transwell experiment found that，compared to control cells，the invasive ability of MDA-MB-231 cells significantly increased with Leptin induction.It was displayed for the increasing cells that had penetrated the basement membrane and spread well. Conclusion：Leptin can significantly induce the migration and invasiveness for the breast cancer MDA-MB-231 cells.

［Key words］Leptin；breast cancer；MDA-MB-231；invasiveness

三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）作為一種特殊的乳腺癌類型，其免疫組化標(biāo)記雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達(dá)均陰性，約占全部乳腺癌類型的15％左右［1-3］。由于TNBC具有惡病質(zhì)高、易侵襲和轉(zhuǎn)移，且治愈后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)［4］，因此研究其致病機(jī)制并尋找有效的的預(yù)防和治療手段是乳腺癌治療和預(yù)防領(lǐng)域所面臨的重大問題之一。

瘦素（Leptin）作為一種脂肪細(xì)胞因子，通過與其特異受體OB-Rb結(jié)合刺激乳腺癌細(xì)胞增殖［5］。但Leptin是否能通過機(jī)體內(nèi)環(huán)境以自分泌或旁分泌途徑刺激乳腺鄰近上皮細(xì)胞使其增殖，目前還沒有定論。因此本研究將Leptin作用于乳腺癌三陰細(xì)胞系MDA-MB-231，通過形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察Leptin對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由本實(shí)驗(yàn)室凍存；Leibovitz's L-15培養(yǎng)基、胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；人重組Leptin蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞染色液購(gòu)自美國(guó)Cell Biolabs公司；其他的化學(xué)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含15％胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基中。

1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將3×105/ml的MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板的各孔中。當(dāng)細(xì)胞鋪滿至90％時(shí)，用無菌200 μl移液槍頭在24孔板各孔中心位置劃一條垂直線。PBS液洗3次去除劃下的細(xì)胞后加入無血清Leibovitz's L-15培養(yǎng)基同步化處理24 h。加入0.625 nmol/L的Leptin與MDAMB-231細(xì)胞共同孵育0、4、12、24、32、48、72 h后分別取樣加入400 μl細(xì)胞染液。待染色15 min后在Leica DMI6000 B相差顯微鏡下觀察。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)取用Leibovitz's L-15培養(yǎng)基稀釋的100 μl Matrigel膠分別加入24孔Transwell各室中，37℃孵育4 h。將6×106/ml乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞鋪滿率＞50％時(shí)，加入0.625 nmol/L Leptin共同孵育32 h后，以5×105/ml比例懸浮細(xì)胞并移入Transwell上室200 μl，Transwell下室加入含5 μg/ml纖維連接蛋白（fibronectin）的600 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h。將附有細(xì)胞的Transwell膜剪下后經(jīng)1 mmol/L Calcein AM（1∶500稀釋）染色10 min后在Leica DMI6000 B熒光顯微鏡下觀察。

圖1　Leptin可顯著增強(qiáng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移力

2　結(jié)果

2.1Leptin可顯著增強(qiáng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移力Leptin處理MDA-MB-231細(xì)胞12 h就有明顯的誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞向劃痕中心移走的作用；48 h后移走的細(xì)胞基本填滿劃痕缺口；72 h后完全封閉。而對(duì)照組細(xì)胞向劃痕中心移動(dòng)的程度明顯小于Leptin處理組的細(xì)胞，細(xì)胞72 h才基本填滿劃痕缺口。見圖1。

2.2Leptin顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞侵襲力

Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Leptin處理后的乳腺癌細(xì)胞侵襲性較對(duì)照組細(xì)胞明顯增強(qiáng)，穿透Transell基底膜的細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞鋪展良好，顯示較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，而非Letptin處理的對(duì)照組細(xì)胞侵襲性明顯減弱，穿透膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少。見圖2。

圖2　Leptin顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞侵襲力（×10；左側(cè)是相差顯微鏡照片；右側(cè)是熒光顯微鏡照片）

3　討論

乳腺癌的高侵襲、高轉(zhuǎn)移性是目前乳腺癌治療的關(guān)鍵［6］。而Leptin通過與其特異受體Ob-Rb結(jié)合誘發(fā)乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，目前國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道［7-11］，但具體作用機(jī)制不清。我們先前實(shí)驗(yàn)也證明，Leptin可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞膜表面白細(xì)胞介素1受體-I的高表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)胞質(zhì)白細(xì)胞介素1家族蛋白分泌的增加，通過激活胞內(nèi)JAK/STAT、MAPK、cAMP/PI3K等蛋白激酶途徑，上調(diào)NF-κ B、VEGF等胞內(nèi)效應(yīng)分子表達(dá)水平，促進(jìn)新生血管形成，加速乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展［12］。在乳腺癌細(xì)胞系4T1、EMT6和MMT細(xì)胞中都可檢測(cè)到Leptin和VEGF的表達(dá)；通過免疫組化實(shí)驗(yàn)可以觀察到OB-R、VEGFR2在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)；另外固相血管增生抗體芯片篩查實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了經(jīng)Leptin作用后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中與血管增生相關(guān)的蛋白表達(dá)作用明顯，其中Ang-1、Ang-2、FLG、CXCL16、VEGF、IL-1Β、MMP-8等表達(dá)明顯增高，這說明Leptin可作為一種新型促血管生成因子參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。

本文從形態(tài)學(xué)角度觀察了Leptin誘導(dǎo)乳腺癌的侵襲，從一種全新的角度研究了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，是對(duì)Leptin在乳腺癌發(fā)生過程中的作用機(jī)制的有力補(bǔ)充，具有重要的科學(xué)和臨床應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然Leptin任何誘導(dǎo)乳腺癌侵襲，其作用途徑有哪些，均有待進(jìn)一步研究。

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（文敏編輯）

Morphological Study for the Cell Invasiveness in Triple-negative Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231 Induced by Leptin

ZHOU Weiqiang
（Shenyang Medical College，Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

R394.3

A

1008-2344（2016）04-0234-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81172509）

周偉強(qiáng)（1970—），男（漢），教授，研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com

2016-05-11