成熟型與幼稚型Nav1.5 Na+通道變構(gòu)體在神經(jīng)損傷大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)

鄭家濤，王軍，歐紹武，王運(yùn)杰（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧　沈陽(yáng)110001）

成熟型與幼稚型Nav1.5 Na+通道變構(gòu)體在神經(jīng)損傷大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)

鄭家濤，王軍，歐紹武，王運(yùn)杰*
（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧沈陽(yáng)110001）

目的：研究幼稚型和成熟型Nav1.5 Na+通道變構(gòu)體在選擇性神經(jīng)損傷（SNI）大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（DRG）中的表達(dá)情況。方法：建立SNI大鼠模型。采用RT-PCR、DNA測(cè)序、限制性酶切技術(shù)、免疫組化等方法檢測(cè)幼稚型和成熟型Nav1.5 Na+通道變構(gòu)體在SNI大鼠DRG中的表達(dá)；采用Western blot法檢測(cè)DRG神經(jīng)元中蛋白激酶C（PKC）的表達(dá)。結(jié)果：成熟型和幼稚型Nav1.5 Na+通道變構(gòu)體在大鼠DRG神經(jīng)元中的表達(dá)比例為2.5∶1。在SNI大鼠模型中，幼稚型和成熟型Nav1.5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低50％左右，PKC-γ表達(dá)水平增加大約1倍。結(jié)論：幼稚型和成熟型Nav1.5 Na+通道變構(gòu)體在大鼠DRG中有表達(dá)，在疼痛模型中的表達(dá)水平顯著降低；在SNI模型中，PKC-γ表達(dá)水平的上調(diào)直接或間接導(dǎo)致了Nav1.5亞型的低表達(dá)，此機(jī)制可能參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

Nav1.5 Na+通道；背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；疼痛模型

doi：10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.04.002

［Abstract］Objective：To study the expression of adult and neonatal Nav1.5 isoforms in the dorsal root ganglia（DRG）neurons of rats with spared nerve injury（SNI）.Methods：The expression of adult and neonatal Nav1.5 isoforms in the DRG neurons of rats with SNI was detected by RT-PCR，DNA sequencing，restriction enzyme digestion，immunohistochemistry and immunofluorescence methods.The expression of PKC-γ was detected by Western blot.Results：Both adult and neonatal Nav1.5 isoforms were expressed in the DRG neurons，but their expression ratio was approximately 2.5∶1.In SNI rat models，the expression of both adult and neonatal Nav1.5 isoforms decreased by approximately a half in both mRNA and protein levels.In contrast，the expression of PKC-γ increased by approximately one-fold.Conclusions：Both adult and neonatal Nav1.5 isoforms expressed in the DRG neurons of rat，but their expression levels decrease in pain models.The up-regulation of PKC-γ may directly or indirectly down-regulate the expression of Nav1.5 isoforms in SNI rat models，which may further involve in the pathological process of neuropathic pain.

［Key words］sodium channel Nav1.5；dorsal root ganglia neurons；pain model

作為跨膜蛋白的電壓-門控Na+通道是可興奮細(xì)胞動(dòng)作電位產(chǎn)生和傳導(dǎo)的重要離子通道，在傷害感受性電興奮中扮演著重要角色［1-2］。電壓-門控Na+通道的三維空間結(jié)構(gòu)目前尚不清楚，一般認(rèn)為它由一個(gè)大的α亞單位和2～4個(gè)小的β亞單位構(gòu)成［3］。到目前為止，已有9種Na+通道α亞單位（Nav1.1-Nav1.9）在不同的哺乳動(dòng)物組織中被克隆出來(lái)［4］。除Nav1.4Na+通道變構(gòu)體外，其余幾種Na+通道α亞單位均可在成熟背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元中檢測(cè)到表達(dá)［5-6］。河豚毒-抵抗型（TTX-R）的Nav1.5 Na+通道首先在心臟中被克隆，被認(rèn)為是心肌特異性Na+通道，與心肌細(xì)胞電生理活動(dòng)密切相關(guān)［7-8］，但是在其他哺乳動(dòng)物腦組織和DRG神經(jīng)元中也能夠檢測(cè)到表達(dá)［7-17］。既往的研究證實(shí)Nav1.5 mRNA（包括Nav1.5a和Nav1.5c亞型）在成年小鼠和大鼠DRG神經(jīng)元中有表達(dá)［14-15］。此外，Nav1.5電流被認(rèn)為是構(gòu)成大鼠的小DRG神經(jīng)元“第3種TTX-R鈉離子電流”的基礎(chǔ)［12］。到目前為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9種Nav1.5剪接變異體（Nav1.5a-f，E28B-D），其中的4種（Nav1.5a、Nav1.5c、Nav1.5d、Nav1.5e）被證實(shí)形成了功能性的Nav1.5Na+通道［8］，但其它亞型的Nav1.5剪接變異體，特別是與成熟Nav1.5功能不同的幼稚型Nav1.5變構(gòu)體（Nav1.5e）是否在DRG神經(jīng)元中表達(dá)，目前仍不清楚［19］。本研究通過(guò)RT-PCR、DNA測(cè)序、限制性酶切技術(shù)、免疫組化等技術(shù)手段，系統(tǒng)地研究幼稚型和成熟型Nav1.5亞型在選擇性神經(jīng)損傷（SNI）大鼠DRG中的表達(dá)情況。此外，對(duì)TTX-R Na+電流起激活作用的蛋白激酶C （PKC）在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)情況也進(jìn)行了檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及SNI模型的制備選取8～10周齡健康雄性SD大鼠18只，體重200～250 g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)。本研究獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵守NIH指南中關(guān)于關(guān)懷和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的原則（NIH出版物No.80-23）。將大鼠隨機(jī)分為2組，SNI組12只，對(duì)照組6只。根據(jù)文獻(xiàn)方法［20］建立SNI大鼠模型。

1.2RT-PCR手術(shù)后14 d，將DRG（L4-6）和外周感覺神經(jīng)元移除，使用RNA提取試劑盒提取總的RNA。使用RT-PCR技術(shù)從1 μg總的RNA中產(chǎn)生得到cDNAs（美國(guó)生命科學(xué)技術(shù)公司）。用來(lái)擴(kuò)增產(chǎn)生成熟型和幼稚型Nav1.5的PCR引物，被設(shè)計(jì)目標(biāo)為第6外顯子和第6A外顯子。正向引物為5'-TTCTGCC TGCATGCATTCACCTT-3'，反向引物為5'-GCAGAAGACAGTGAGGACC A-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為240 bp。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，然后95℃保持30 s，66℃保持30 s，72℃保持30 s，進(jìn)行36個(gè)周期，最終72℃延伸5 min。使用GAPDH作參考對(duì)照：正向引物為5'-GACCACCCAGCCCAGCAAG G-3'，反向引物為5'-TCCCCAGGCCCCTCCTGTT G-3'，引物長(zhǎng)度為144 bp。通過(guò)凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行mRNA表達(dá)的分析。

1.3DNA測(cè)序使用凝膠回收試劑盒（美國(guó)Qiagen公司）來(lái)萃取和提純得到期望大小的片段，之后采用3730 xl全自動(dòng)DNA測(cè)序儀（美國(guó)BioSystem公司）進(jìn)行直接測(cè)序。

1.4限制性內(nèi)切酶消化使用限制性內(nèi)切酶SacⅠ將總的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，從總的Nav1.5 cDNAs中區(qū)分出幼稚型Nav1.5剪接變異體。此反應(yīng)系統(tǒng)總共有30 μl，包含8 μl PCR產(chǎn)物，0.5 μl SacⅠ，3 μl加樣緩沖液，18.5 μl特級(jí)純化水。在38℃中孵化1 h或室溫下過(guò)夜，通過(guò)電泳的方法將PCR產(chǎn)物在2％瓊脂凝膠中進(jìn)行分離得到結(jié)果。

1.5免疫組化染色使用Histostain-SP試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），將新鮮的DRG（L4-6）標(biāo)本使用1％～4％多聚甲醛固定，制成4 μm后用石蠟包埋。標(biāo)本使用原始Nav1.5抗體（兔，1∶100，以色列Alomone公司）進(jìn)行孵化，接著使用二抗（生物素化山羊抗兔IgG，1∶500，美國(guó)Invitrogen公司）進(jìn)行繼續(xù)孵化。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，并將已知的Nav1.5正性表達(dá)的人心房肌作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6Western blot使用的抗體包括兔抗Nav1.5多克隆抗體（1∶200，以色列Alomone公司）；兔多克隆抗PKC-γ抗體（1∶1 000，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）；兔抗α微管蛋白單克隆抗體（1∶10 000，美國(guó)Millipore公司）；辣根過(guò)氧化物酶相關(guān)的抗兔、抗小鼠IgG二抗（1∶2 000，美國(guó)CST公司）。將100 mg左右的組織通過(guò)預(yù)冷的PBS （4℃）進(jìn)行沖洗，混合500 μl RIPA強(qiáng)溶解緩沖劑，用高速攪拌器攪勻，在4℃環(huán)境中過(guò)夜使之溶解。在4℃的環(huán)境中使用12 000 r/min高速離心30 min，收集上層清液后鑒定蛋白成分。使用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，將100 μg蛋白裝進(jìn)每一個(gè)通道中，在80 V環(huán)境下通過(guò)6％～10％SDS-PAGE電泳2 h。蛋白經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、10％脫脂蛋白封堵、孵化過(guò)夜、漂洗、室溫下震動(dòng)、ECL處理，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑和定量密度測(cè)量方法進(jìn)行免疫反應(yīng)性蛋白條帶的檢測(cè)。使用凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)的分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Nav1.5 mRNA在SNI大鼠DRG神經(jīng)元中的表達(dá)下降RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SNI大鼠模型中總的Nav1.5 mRNA（包括幼稚型和成熟型Nav1.5）下降大約55％。限制性內(nèi)切酶結(jié)果顯示，在SNI大鼠的DRG神經(jīng)元中，成熟型和幼稚型Nav1.5 mRNA表達(dá)均下降，其中成熟型Nav1.5 mRNA下降53％，幼稚型Nav1.5 mRNA下降56％。見圖1～圖3。

2.2幼稚型和成熟型Nav1.5 mRNA在SNI模型大鼠的DRG神經(jīng)元中均表達(dá)PCR結(jié)果顯示有2％的瓊脂糖膠能顯示帶有預(yù)期大?。?40 bp）的條帶，見圖1。單一序列存在于第5外顯子和第7外顯子編碼區(qū)域，對(duì)偶序列存在于第6外顯子和第6A外顯子編碼區(qū)域。DNA序列分析顯示SCN5A基因的第6外顯子和第6A外顯子均包含在PCR產(chǎn)物中，提示成熟型和幼稚型Nav1.5通道（Nav1.5e）均表達(dá)于DRG神經(jīng)元中。PCR碎片中包含第6A外顯子的部分被消化成兩帶，而包含第6外顯子的部分完整保存。因此，被酶消化和未被消化的PCR產(chǎn)物量的對(duì)比可以分別定量代表幼稚型和成熟型的Nav1.5 cDNA。對(duì)酶消化前和消化后通過(guò)放射自顯影方法比較DRG神經(jīng)元中成熟型Nav1.5與幼稚型Nav1.5表達(dá)的比例大約是2.5∶1，見圖1。

2.3PKC-γ在SNI模型大鼠DRG神經(jīng)元中的表達(dá)上調(diào)Western blot結(jié)果顯示，PKC-γ在SNI模型大鼠DRG神經(jīng)元中的表達(dá)上調(diào)，增加了接近1倍。見圖4。

圖1　RT-PCR和直接DNA序列結(jié)果

圖2　Nav1.5 mRNA在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)

3　討論

在DRG神經(jīng)元中，電壓-門控鈉離子通道是傷害性感受動(dòng)作電位產(chǎn)生和傳播的必要條件［1，6，21-22］，至少發(fā)現(xiàn)了8種鈉通道［5，6，22］。既往的研究表明，在小鼠的外周神經(jīng)切斷7 d后，L4和L5神經(jīng)元中Nav1.5a和Nav1.5/Nav1.5c mRNA的表達(dá)分別下降了48.1％和46.4％［14］。本研究RT-PCR結(jié)果顯示在SNI模型大鼠中，DRG神經(jīng)元中幼稚型和成熟型的Nav1.5 mRNA表達(dá)下降了接近一半，與上述研究結(jié)果一致。免疫組化和免疫熒光結(jié)果也顯示總Nav1.5蛋白在上述結(jié)構(gòu)中的表達(dá)下降。以往研究和本研究均顯示在SNI模型中，Nav1.5通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)水平均下降。

既往的研究證實(shí)Nav1.5a是在DRG神經(jīng)元中表達(dá)的Nav1.5最主要的同工型，跟全長(zhǎng)Nav1.5相比有不同的功能特性［13-14］。后來(lái)的電生理檢查方法也表明Nav1.5通道在大鼠的小DRG神經(jīng)元中產(chǎn)生第三TTX-R電流。但是，除了目前已知的9種Nav1.5剪接變異體（Nav1.5a-f，E28B-D）之外，是否有其它的Nav1.5亞型存在于DRG神經(jīng)元中目前仍不得而知。因此，本研究系統(tǒng)地分析了Nav1.5在SNI模型大鼠的DRG神經(jīng)元中的表達(dá)情況。結(jié)果首次證實(shí)了成熟型和幼稚型Nav1.5在DRG神經(jīng)元和外周感覺神經(jīng)軸突中均表達(dá)。但是，兩種不同Nav1.5亞型的表達(dá)比例目前仍不是很清楚，而這種表達(dá)比例可能會(huì)影響總的Nav1.5功能特性。因此，我們分析了第6外顯子和第6A外顯子的不同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種特異性限制內(nèi)切酶位點(diǎn)SacⅠ存在于第6A外顯子中，而第6外顯子中沒有。因此，SacⅠ被用來(lái)消化PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示在DRG神經(jīng)元和外周感覺神經(jīng)軸突中，成熟型Nav1.5和幼稚型Nav1.5（Nav1.5e）表達(dá)比例大約為2.5∶1。因此，結(jié)果提示在成熟型和幼稚型Nav1.5亞型形成混合產(chǎn)物之前檢測(cè)到Nav1.5鈉電流。

圖3　Nav1.5在大鼠DRG神經(jīng)元中的表達(dá)情況（免疫組化染色，A和E：×40；B和F：×100；C和G：×200）

圖4　Western blot檢測(cè)PKC-γ在SNI模型大鼠和正常對(duì)照組DRG神經(jīng)元中的表達(dá)

既往的研究通過(guò)Western blot方法發(fā)現(xiàn)了Nav1.5蛋白在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)。本研究使用免疫組化和免疫熒光的方法檢測(cè)Nav1.5蛋白在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)。結(jié)果顯示，均能檢測(cè)到Nav1.5在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)，并且在小直徑的DRG神經(jīng)元中表達(dá)強(qiáng)度要強(qiáng)于大的DRG神經(jīng)元。結(jié)合本次研究和之前的電生理學(xué)結(jié)果，證實(shí)了Nav1.5蛋白在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)。但它在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)中的功能目前仍不是很清楚。既往的研究表明，Nav1.5在DRG神經(jīng)元中的一些功能特性被證實(shí)不同于其他TTX-R鈉通道（如Nav1.8和Nav1.9通道），體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：激活的半衰期、失活的時(shí)間常量，激活和失活的中點(diǎn)［12］。進(jìn)一步研究有待于更深層次的研究Nav1.5 在DRG神經(jīng)元和外周感覺神經(jīng)軸突中的功能特性。

作為一種常規(guī)PKC（cPKC）的同工酶，PKC-γ在神經(jīng)系統(tǒng)中大量的表達(dá)。本研究檢測(cè)了SNI模型大鼠DRG神經(jīng)元中PKC-γ的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKC-γ在大鼠疼痛模型DRG神經(jīng)元中具有可重復(fù)性上調(diào)作用。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了成熟型和幼稚型Nav1.5亞型在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)。在SNI疼痛模型大鼠的DRG神經(jīng)元中，成熟型和幼稚型Nav1.5mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降一半左右，PKC-γ的表達(dá)增加了近1倍。PKC-γ的表達(dá)上調(diào)可能跟SNI模型大鼠中成熟型與幼稚型Nav1.5的表達(dá)下調(diào)有關(guān)，從而參與了神經(jīng)性疼痛的發(fā)生。關(guān)于疼痛模型中PKC-γ的表達(dá)上調(diào)與Nav1.5的表達(dá)下調(diào)之間的特殊關(guān)系，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（文敏編輯）

Expression of Adult and Neonatal Nav1.5 Isoforms in the Dorsal Root Ganglia Neurons of Rats with Spared Nerve Injury

ZHENG Jiatao，WANG Jun，OU Shaowu，WANG Yunjie*
（Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China）

R651.3

A

1008-2344（2016）04-0229-05

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2014021097）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31100770）

鄭家濤（1981—），男（漢），主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)外科.E-mail：xy_810927@163.com

王運(yùn)杰（1956—），男（漢），主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)外科.E-mail：wyj024@vip.sina.com

2016-05-16