棉花粉蚧化學(xué)感受蛋白基因PsCSP10的克隆及表達(dá)譜分析

趙　潔，程代鳳，陸永躍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系，廣東廣州，510642)

Lartigue A, Campanacci V, Roussel A,et al. X-ray structure and ligand binding study of a moth chemosensory protein[J]. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(35): 32094-32098.

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棉花粉蚧化學(xué)感受蛋白基因PsCSP10的克隆及表達(dá)譜分析

趙潔，程代鳳，陸永躍*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系，廣東廣州，510642)

本研究克隆出了棉花粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley化學(xué)感受蛋白(CSPs)基因PsCSP10的全長cDNA(GenBank登錄號：KT958555)，其核苷酸序列長640 bp，編碼128個(gè)氨基酸，預(yù)測其成熟蛋白分子量14.99 kD，等電點(diǎn)6.61，且含有4個(gè)保守的半胱氨酸，符合昆蟲CSPs的典型特征。該基因編碼的氨基酸序列和其他昆蟲化學(xué)感受蛋白基因編碼的氨基酸序列相似性為50%-56%。應(yīng)用Real-time PCR測定的結(jié)果表明棉花粉蚧各發(fā)育階段中PsCSP10均有表達(dá)，但在雄成蟲中的相對表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育階段。在分別用扶桑Hibiscusrosa-sinensisL.、棉花GossypiumhirsutumL.、馬纓丹LantanacamaraL.飼養(yǎng)獲得的雄成蟲中PsCSP10相對表達(dá)量不存在差異。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確棉花粉蚧中PsCSP10的功能奠定了基礎(chǔ)。

棉花粉蚧；化學(xué)感受蛋白基因；克??；序列分析；表達(dá)譜

昆蟲在長期進(jìn)化過程中形成了一套高度精細(xì)、靈敏的化學(xué)信息感受系統(tǒng)，用以識別來自外界環(huán)境、種間、種內(nèi)的化學(xué)信息物質(zhì)，從而進(jìn)一步調(diào)控其寄主定位、尋偶、躲避不利環(huán)境等行為(Craddock and Boake，1992；Shaveretal.，1998；Saverschek and Roces，2011)。氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)及化學(xué)感受蛋白(Chemosensory proteins，CSPs)在這種化學(xué)感受機(jī)制中起著重要作用。與氣味結(jié)合蛋白主要結(jié)合揮發(fā)性的氣味分子和性信息素分子不同，化學(xué)感受蛋主要結(jié)合和運(yùn)載非揮發(fā)性氣味分子(Steinbrechtetal.，1995)。CSPs廣泛分布于幾乎所有昆蟲類群各種化學(xué)感受器中，且具有廣泛的功能(劉金香等，2005；柳曉磊等，2011)，其分子進(jìn)化保守性非常明顯，同種昆蟲或者不同目、科昆蟲間化學(xué)感受蛋白同源性在30%-90%；化學(xué)感受蛋白相對分子量平均13 kD，多肽鏈有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，形成兩個(gè)二硫鍵，目前發(fā)現(xiàn)的昆蟲化學(xué)感受蛋白均為單體，未發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾(Krieger and Breer，1999；Briandetal.，2002；Lartigueetal.，2002；Campanaccietal.，2003)。

棉花粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley在巴基斯坦、印度等國暴發(fā)成災(zāi)(Muhammadetal., 2009)，2008年8月我國大陸在廣東廣州首次發(fā)現(xiàn)其入侵為害(武三安和張潤志，2009)，成為了我國新的入侵害蟲，且對我國園林、果蔬和多種大田作物等的安全生產(chǎn)存在潛在的嚴(yán)重威脅(陸永躍等，2008；馬駿等，2009)。該蟲寄主范圍廣，危害多種重要經(jīng)濟(jì)作物(孫峰等，2011；孫峰和陸永躍，2011；Huangetal.，2013；王飛飛等，2014)；繁殖能力強(qiáng)，年發(fā)生世代多，種群增長潛力大(陸永躍等，2008；Ghulametal.，2009；王超等，2014)，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)(Nikametal.，2010；Wangetal.，2010；關(guān)鑫等，2011；陳芳和陸永躍，2014a)。目前關(guān)于棉花粉蚧的研究大多集中在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)方面(王飛飛等，2014；關(guān)鑫和陸永躍，2012；Zhouetal.，2013)，關(guān)于該蟲化學(xué)感受蛋白基因已鑒定出12個(gè)相關(guān)基因(PsolCSP1-PsolCSP12)，并進(jìn)行了進(jìn)化分析(趙潔和陸永躍，2015)，但對各個(gè)基因的表達(dá)模式、功能等還未見研究。本文在已有研究基礎(chǔ)克隆得到了一個(gè)棉花粉蚧的化學(xué)感受蛋白基因PsCSP10，并對該蟲不同發(fā)育階段、不同寄主飼養(yǎng)獲得的雄成蟲中該基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究明確該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試樣品與試劑

供試棉花粉蚧為本實(shí)驗(yàn)室用新鮮扶桑葉飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：溫度28℃±1℃、相對濕度70%±5%、光周期為(L∶D)16 h∶8 h。分別取卵、一齡若蟲、二齡若蟲、三齡若蟲、雄成蟲、雌成蟲樣品及其混合樣品，經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組由北京諾和致源生物信息科技有限公司測定，轉(zhuǎn)錄組樣本為各齡期混合樣提取的RNA。Ttizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、載體pGM-T、DNA純化回收試劑盒及SuperReal熒光定量預(yù)混試劑等均購自天根生化科技(北京)有限公司；所用引物自行設(shè)計(jì)并由生工生物科技有限公司(廣州)合成，試劑盒、克隆感受態(tài)菌株DH5α購自寶生物工程(大連)有限公司。

寄主植物扶桑Hibiscusrosa-sinensisL.、棉花GossypiumhirsutumL.、馬纓丹LantanacamaraL.種植于實(shí)驗(yàn)室陽臺上，常規(guī)管理，不使用任何藥劑防治病蟲害。將粉蚧飼養(yǎng)于寄主上，3代之后分別取雄成蟲樣品，經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2棉花粉蚧不同發(fā)育階段總RNA的提取及cDNA的合成

按照Trizol試劑使用說明書分別提取棉花粉蚧各發(fā)育階段、各階段混合樣及不同寄主植物飼養(yǎng)獲得的雄成蟲的總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，經(jīng)Nanodrop2000 Spectrophotometer(Thermo，USA)核酸濃度測定儀測定其濃度和純度。按照Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒的操作說明反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并稀釋2倍保存在-20 ℃冰箱備用，以此為熒光定量PCR模板。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)測得的棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組，棉花粉蚧化學(xué)感受蛋白PsCSP10基因序列(GenBank登錄號：KT958555)，利用NCBI中prime blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index. cgi?LINK_LOC=BlastHome)設(shè)計(jì)PsCSP10的3′RACE(CSP3′outer和CSP3′inner)和5′RACE(CSP5′outer和CSP5′inner)。用于real-time定量PCR反應(yīng)的特異性引物(CSP10F和CSP10R)、內(nèi)參基因?yàn)棣?tubulin(GenBank登錄號：KJ909508)(陳芳和陸永躍，2014b)。引物序列如下：

表1　用于PCR的引物序列

1.4RACE克隆PsCSP 10基因全長序列

根據(jù)RACE試劑盒操作步驟進(jìn)行3′和5′RACE PCR擴(kuò)增，以各發(fā)育階段混合樣RNA反轉(zhuǎn)的第一鏈cDNA為模版。將3′和5′ RACE PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并割膠純化，克隆于pMD-T載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取白色菌落，放入含有100 μg/L氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)液震蕩過夜，經(jīng)菌液PCR鑒定后，送樣測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。將獲得的片段進(jìn)行拼接獲得PsCSP10的全長cDNA序列。

1.5定量PCR檢測PsCSP10的時(shí)空表達(dá)

熒光定量PCR采用20 μL體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向引物、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模板1 μL，50× ROX Reference Dye Δ 0.4 μL，加水至20 μL，混勻，輕微離心，反應(yīng)在Stratagene Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；之后95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后跟隨一個(gè)生成溶解曲線的程序。檢測過程中每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.6定量PCR檢測PsCSP10在不同寄主飼養(yǎng)下雄成蟲中表達(dá)

熒光定量PCR采用20 μL體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向引物、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，以1 μL扶桑、棉花、馬纓丹飼養(yǎng)下雄成蟲的cDNA為模板，50 × ROX Reference Dye 0.4 μL，加水至20 μL，混勻，輕微離心，反應(yīng)在Stratagene Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為同1.5。

1.7分析方法

應(yīng)用BLAST比對方法比較化學(xué)感受蛋白氨基酸序列的相似度(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；基于沙漠蝗化學(xué)感受蛋白CSP-sg4:A三維結(jié)構(gòu)2gvs.1.A模板，利用在線網(wǎng)站swiss-model(http://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)；利用2-△△Ct法相對定量的方法，以卵中表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，研究PsCSP10在棉花粉蚧卵、1齡若蟲、2齡若蟲、3齡若蟲、雄成蟲、雌成蟲中的相對表達(dá)量及不同寄主飼養(yǎng)獲得的雄蟲中的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果與分析

2.1棉花粉蚧PsCSP10基因克隆及序列分析

通過3′和5′RACE PCR克隆得到棉花粉蚧化學(xué)感受蛋白PsCSP10的全長基因，序列分析表明PsCSP10 cDNA全長為640 bp，包括94 bp的5′非翻譯區(qū)，158 bp的3′非翻譯區(qū)，以及387 bp的開放閱讀框，編碼128個(gè)氨基酸殘基(包括N端29個(gè)氨基酸的信號肽)(圖1)。成熟蛋白預(yù)測分子量為14.99 kD，等電點(diǎn)為6.61。利用BLAST對PsCSP10的同源蛋白進(jìn)行搜索、對氨基酸序列的多重比對結(jié)果表明該基因編碼的成熟肽中含有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，具昆蟲化學(xué)感受蛋白的典型特征。

通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)棉花粉蚧PsCSP10與半翅目昆蟲煙粉虱Bemisiatabaci(GenBank登錄號：AEY84055.1)、綠盲蝽Apolyguslocorum(GenBank登錄號：AGD80085.1)、褐飛虱Nilaparvatalugens(GenBank登錄號：ACJ64054.1)化學(xué)感受蛋白氨基酸序列的相似度分別為50%、51%、52%；與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(GenBank登錄號：AFR92095.1)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(GenBank登錄號：AKT26484.1)、大螟Sesamiainferens(GenBank登錄號：AGY49265.1)、小地老虎Agrotisipsilon(GenBank登錄號：AGR39573.1)化學(xué)感受蛋白氨基酸序列的相似度分別為50%、52%、52%、52%；與雙翅目昆蟲致倦庫蚊Culexquinquefasciatus(GenBank登錄號：XP_001844696.1)、廄螫蠅Stomoxyscalcitrans(GenBank登錄號：ADG96052.1)化學(xué)感受蛋白氨基酸序列的相似度分別為56%、53%；與鞘翅目昆蟲稻水象甲Lissorhoptrusoryzophilus(GenBank登錄號：AHE13802.1)、暗黑鰓金龜Holotrichiaparallela(GenBank登錄號：AKI84394.1)化學(xué)感受蛋白氨基酸序列的相似度分別為55%、50%(表2、圖2)。

圖1　PsCSP10 cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig 1.　cDNA and predicted amino acid sequences of PsCSP10注：終止子以*號表示，下劃線表示N端推導(dǎo)的信號肽。Note：The stop codon is indicated by an asterisk. Putative signal peptides at the N-termini are underlined

圖2　PsCSP10和其他昆蟲化學(xué)感受蛋白的全氨基酸序列比對Fig.2　Alignment of full amino acid sequences from PsCSP10 and chemosensory proteins of other insects

基因Gene昆蟲種類SpeciesGenBank登錄號GenBankaccessionno.蛋白名稱Proteinname最高一致性(%)MaximalidentityE值Evalue致倦庫蚊CulexquinquefasciatusXP_001844696.1CquiCSP564e-43煙粉虱BemisiatabaciAEY84055.1BtabCSP1506e-39棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraAFR92095.1HarmCSP11509e-36稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusAHE13802.1LoryCSP6559e-36綠盲蝽ApolyguslucorumAGD80085.1AlucCSP5518e-36PsCSP10甜菜夜蛾SpodopteraexiguaAKT26484.1SexiCSP7534e-36暗黑鰓金龜HolotrichiaparallelaAKI84394.1HparCSP11503e-36大螟SesamiainferensAGY49265.1SinfCSP522e-36廄螫蠅StomoxyscalcitransADG96052.1ScalCSP534e-36褐飛虱NilaparvatalugensACJ64054.1NlugCSP8525e-36小地老虎AgrotisipsilonAGR39573.1AipsCSP3521e-38

2.2PsCSP10蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用Swiss-model預(yù)測得到了PsCSP10編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)，表明其三維結(jié)構(gòu)與其他昆蟲的PsCSP編碼蛋白一樣主要形成α-螺旋(圖3)。

圖3　預(yù)測的PsCSP10編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.3　The predicted three-dimensional structure of PsCSP10

2.3PsCSP10基因的表達(dá)特征

各個(gè)蟲期中PsCSP10均有表達(dá)，在雄成蟲中的相對表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育階段(ANOVA，F(xiàn)=37.430，df=17，P= 0.000；圖4)。而在扶桑、棉花、馬纓丹3種植物上分別飼養(yǎng)3代之后的雄成蟲中PsCSP10的表達(dá)量無顯著差異(ANOVA，F(xiàn)=0.472，df=8，P=0.645；圖5)。

圖4　棉花粉蚧不同發(fā)育階段PsCSP10的相對表達(dá)水平Fig.4　Relative mRNA expression levels of the PsCSP10 in different development stages

圖5　不同寄主飼養(yǎng)的棉花粉蚧雄成蟲中PsCSP10的相對表達(dá)水平Fig.5　Relative mRNA expression levels of the PsCSP10 in male adults feed on different host plants

3　討論

本研究應(yīng)用real time-PCR和RACE技術(shù)克隆了編碼棉花粉蚧化學(xué)感受蛋白PsCSP10的cDNA全長序列，經(jīng)BLASTX分析結(jié)果顯示該基因編碼的氨基酸序列與其他半翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲化學(xué)感受蛋白的氨基酸序列一致性均在50%-56%，可見在以上多個(gè)類群昆蟲中化學(xué)感受蛋白結(jié)構(gòu)相對保守。PsCSP10與其他昆蟲化學(xué)感受蛋白氨基酸序列中有19個(gè)氨基酸完全保守，推測這些氨基酸殘基對維持化學(xué)感受蛋白的功能可能起著重要的作用，反映了昆蟲在長期進(jìn)化過程中對大量不同類型的環(huán)境化學(xué)因子刺激的適應(yīng)和進(jìn)化(劉金香等，2005；柳曉磊等，2011)。

昆蟲化學(xué)感受蛋白二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成(Picimbonetal.，2000；Lartigueetal.，2002；Briandetal.，2002；劉金香等，2005)。本研究預(yù)測了PsCSP10編碼蛋白空間結(jié)構(gòu)，其建模模板為沙漠蝗跗節(jié)化學(xué)感受蛋白CSP-sg4。其分子內(nèi)4個(gè)保守的半胱氨酸兩兩相連構(gòu)成兩個(gè)二硫鍵，是典型的α-螺旋，整個(gè)分子呈球形狀(Piconeetal.，2001)。PsCSP10編碼的蛋白三維結(jié)構(gòu)與其他化學(xué)感受蛋白一樣都主要是α-螺旋。可見二硫鍵和α-螺旋在昆蟲化學(xué)感受蛋白中是相當(dāng)普遍和保守的。

目前發(fā)現(xiàn)CSPs廣泛存在于各種昆蟲中，且在觸角、喙、性腺、下唇須、跗節(jié)、復(fù)眼等多個(gè)組織部位中都有廣泛的表達(dá)(Maleszka and Stange，1997；Angelietal.，1999；Nagan-Leetal.，2000；Jacquin-Jolyetal.，2001；Gongetal.，2007)。CSPs不僅可以溶解運(yùn)輸不容化學(xué)感受器親脂性配體，同時(shí)還可調(diào)節(jié)昆蟲生長發(fā)育、生理節(jié)律，參與體內(nèi)免疫、信號傳導(dǎo)等多項(xiàng)生理功能(Mcdonaid and Rosbash，2001；Lartigueetal.，2002；Montefortietal.，2002；Sandozetal.，2003；Wanneretal.，2004；Ozakietal.，2005；徐浩智等，2015)。多種昆蟲中CSPs表達(dá)規(guī)律研究已完成，可根據(jù)CSPs表達(dá)情況初步推測CSPs所行使的功能。本研究表明棉花粉蚧不同發(fā)育階段PsCSP10均能表達(dá)，尤以雄成蟲中表達(dá)量最大，而扶桑、棉花、馬纓丹等不同寄主上雄成蟲中PsCSP10表達(dá)量無差異。棉花粉蚧雄成蟲存活期較短，僅為2-4 d，在與雌成蟲交配后1-2 d便死亡；雄性棉花粉蚧在交配過程起著主導(dǎo)作用，通過飛行、爬動(dòng)尋找雌性成蟲交配(朱藝勇等，2011)。因此，推測PsCSP10與識別寄主揮發(fā)物質(zhì)可能無關(guān)，而可能與雄蟲接受雌蟲化學(xué)信息、調(diào)節(jié)生長發(fā)育或者其他生理過程等有關(guān)。

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Molecular cloning and expression analysis of chemosensory protein genePsCSP10 inPhenacoccussolenopsisTinsley (Hemiptera: Pseudococcidae)

ZHAO Jie, CHENG Dai-Feng, LU Yong-Yue

(Department of Entomology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study, one CSP gene in cotton mealybugPhenacoccussolenopsisTinsley was cloned and characterized, and was namedPsCSP10 (GenBank accession no.: KT958555). ThePsCSP10 cDNA was 640 bp in length, encoding 128 amino acid residues with the predicated molecular mass of approximately 14.99 kD and pI of 6.61, of which four conservative cysteines were included. The alignment ofPsCSP10 showed moderate similarity (50%-56%) with the CSP genes of other insects analyzed with the deduced amino acid sequences.By Real-time PCR analysis, PsCSP10 was revealed to express across various development stages, and the expression level was more in the male adult. The expression ofPsCSP10 in the mealybug male adults fed on Chinese rose (Hibiscusrosa-sinensisL.), cotton (GossypiumhirsutumL.) and common lantana (LantanacamaraL.),respectively, had not significant difference. The results became the basis for further research onPsCSP10 gene functions inP.solenopsis.

PhenacoccussolenopsisTinsley; chemosensory protein gene; molecular cloning; sequence analysis; expression profile

廣東省自然科學(xué)基金(S2013010013526);廣東省研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃(2013JDXM14)

趙潔,女，1990年生，山西人，碩士研究生，研究方向?yàn)槔ハx分子生態(tài)學(xué)，E-mail: zhaojie129scau@163.com

Author for correspondence, E-mail: luyongyue@scau.edu.cn

2016-05-13；接受日期Accepted：2016-06-30

Q963; S433

A

1674-0858(2016)04-0728-08