膀胱癌BIU-87細(xì)胞靶向超聲納米脂質(zhì)微泡造影劑的制備及體外超聲成像

蘇西西，楊曉峰，張　帆，羅　芳，賈　凡，李宏州，潘　佐

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原　030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原　030001；3，山西醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,山西太原　030001；4.山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院泌尿外科，山西太原　030032)

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·基礎(chǔ)研究·

膀胱癌BIU-87細(xì)胞靶向超聲納米脂質(zhì)微泡造影劑的制備及體外超聲成像

蘇西西1，楊曉峰2，張帆3，羅芳3，賈凡1，李宏州1，潘佐4

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原030001；3，山西醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,山西太原030001；4.山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院泌尿外科，山西太原030032)

目的制備具有膀胱癌BIU-87細(xì)胞靶向結(jié)合的超聲納米脂質(zhì)微泡造影劑，并觀察體外靶向能力、檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響和體外超聲成像效果。方法通過機(jī)械振動(dòng)法制備納米脂質(zhì)微泡，用生物素-親和素橋接法將NYZL1連接到納米脂質(zhì)微泡的表面制備靶向納米脂質(zhì)微泡造影劑，利用倒置顯微鏡觀察其一般特性，Zate檢測(cè)儀檢測(cè)粒徑大小和表面電荷，使用倒置顯微鏡來觀察其體外靶向效果，用MTT法檢測(cè)其不同濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響，使用超聲診斷儀觀察體外顯影效果。結(jié)果膀胱癌BIU-87細(xì)胞靶向超聲納米脂質(zhì)微泡呈圓形，分布均勻，無聚集；在體外靶向?qū)嶒?yàn)中，靶向納米脂質(zhì)微泡造影劑能高效特異性的結(jié)合在膀胱癌BIU-87細(xì)胞表面并沿細(xì)胞表面規(guī)則排列；不同濃度下兩種微泡對(duì)細(xì)胞增殖無明顯變化(P>0.05)；體外超聲成像實(shí)驗(yàn)中，靶向納米微泡呈點(diǎn)狀細(xì)密高回聲。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功制備膀胱癌BIU-87細(xì)胞超聲納米脂質(zhì)微泡造影劑，能夠在體外與膀胱癌BIU-87細(xì)胞特異性地靶向結(jié)合，兩種微泡對(duì)細(xì)胞生長無明顯影響且體外超聲顯像效果良好。

納米脂質(zhì)微泡；膀胱癌；靶向超聲造影劑；體外實(shí)驗(yàn)

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.07.014

靶向超聲納米脂質(zhì)微泡作為一種新型、無創(chuàng)、靶向性的技術(shù)越來越引起人們的重視，一方面通過微泡聚集特點(diǎn)對(duì)腫瘤進(jìn)行早期精準(zhǔn)診斷[1]，另一方面借助微泡載體攜帶基因、藥物進(jìn)行靶向治療[2]。隨著膀胱導(dǎo)向肽的研制，加速了靶向膀胱腫瘤研究。羅俊茜等[3]利用噬菌體展示技術(shù)篩選膀胱癌靶向肽，獲得與中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系高度結(jié)合的CSSPIGRHC導(dǎo)向肽,命名為NYZL1，為膀胱癌的早期診斷和靶向治療提供理論依據(jù)[4]。因此，隨著納米微泡技術(shù)及膀胱腫瘤導(dǎo)向肽的研究日益成熟，兩者結(jié)合成為膀胱靶向納米微泡，為膀胱腫瘤早期精準(zhǔn)診斷及借助納米微泡攜帶基因、藥物等進(jìn)行靶向治療成為可能。

1　材料與方法

1.1材料、試劑泊羅沙姆124(太原市貝倍科貿(mào)易有限公司)、甘油(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)、全氟丙烷氣體(C3F8，天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢博士德有限公司)、親和素(武漢博士德有限公司)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，美國AVANTI公司)、生物素化二脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG(2000)Biotin，美國NANOCS公司)、生物素化NYZL(杭州中肽生化有限公司)、人膀胱癌BIU-87細(xì)胞株(北京大學(xué)泌尿外科研究所)等。儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司)、Zate檢測(cè)儀(太原理工大學(xué)提供)、YCD-EL259低溫冰箱(中科美菱低溫科技責(zé)任有限公司)、CKX41倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、SC-04低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、SHA-B恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)、UTP313電子天平(上海華抄電器有限公司)、YJT銀汞膠囊調(diào)和器(上海醫(yī)療器械股份有限公司)、logicE9超聲儀(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲科)等。

1.2普通納米脂質(zhì)微泡的制備及物理性質(zhì)測(cè)定將9.61 mg DPPC和4.39 mg DSPE-PEG(2000)Biotin混合加入3 mL的西林瓶中，并加入1 mL的水化液(甘油和加入一定量泊洛沙姆124的PBS,體積比1∶9)，將混合的西林瓶放入37 ℃ 120 r/min恒溫振蕩器中30 min均勻混合，置于4 ℃冰箱冷卻20 min，然后用全氟丙烷置換西林瓶中的空氣并用封口膜使其密閉，銀汞膠囊調(diào)和器夾住西林瓶，水平重復(fù)式超聲機(jī)械振動(dòng)，振動(dòng)60 s，形成乳白色液體，4 ℃冰箱靜置分層，棄去下清液，用PBS純化微泡3次，收集中間層乳白色液體加入1 mL PBS,完成普通納米脂質(zhì)微泡制備。應(yīng)用血球計(jì)數(shù)儀在光鏡下測(cè)定微泡的濃度，利用倒置光學(xué)顯微鏡觀察微泡顏色、分布、大小、形態(tài)，Zate的檢測(cè)儀檢測(cè)粒徑大小、電位，4 ℃冰箱7 d、13 d光鏡下觀察。

1.3膀胱癌BIU-87細(xì)胞靶向納米脂質(zhì)微泡的制備及物理性質(zhì)測(cè)定取上述200 μL普通納米脂質(zhì)微泡加入2 mL PBS與飽和量的100 μg親和素置于4 ℃冰箱反應(yīng)30 min，200 r/min離心2 min去下清液，PBS沖洗3次，置于4 ℃冰箱冷卻20 min，收集中間層微泡，將所收集的微泡與飽和量的10 ug生物素化NYZL置于4 ℃冰箱反應(yīng)30 min，200 r/min離心2 min去下清液，PBS沖洗3次，收集微泡，膀胱癌BIU-87細(xì)胞靶向納米脂質(zhì)微泡制備完畢。應(yīng)用血球計(jì)數(shù)儀在光鏡下測(cè)定微泡的濃度，利用倒置光學(xué)顯微鏡觀察微泡顏色、分布、大小、形態(tài)，Zate檢測(cè)儀檢測(cè)粒徑大小、電位，4 ℃冰箱7 d、13 d光鏡下觀察。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)膀胱癌BIU-87細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%的CO2孵育箱培養(yǎng)，隔日傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5靶向脂質(zhì)微泡與普通微泡體外靶向膀胱癌BIU-87細(xì)胞實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期膀胱癌BIU-87細(xì)胞接種于放置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%并將蓋玻片細(xì)胞貼壁面放置在培養(yǎng)基上，分為4組。A組:取200 μL靶向納米脂質(zhì)微泡加入培養(yǎng)基中，常溫下孵育30 min，用PBS沖洗細(xì)胞表面3次，光鏡下觀察靶向納米脂質(zhì)微泡與細(xì)胞結(jié)合情況；B組:取200 μL普通納米脂質(zhì)微泡加入培養(yǎng)基中，常溫下孵育30 min，用PBS沖洗細(xì)胞表面3次，光鏡下觀察普通納米脂質(zhì)微泡與細(xì)胞結(jié)合情況；C組 預(yù)先將10 μg生物素化NYZL與細(xì)胞常溫下共孵育30 min，取200 μL靶向納米脂質(zhì)微泡加入培養(yǎng)板中，常溫下孵育30 min，用PBS沖洗細(xì)胞表面3次，光鏡下觀察靶向納米脂質(zhì)微泡與細(xì)胞結(jié)合情況；D組 預(yù)先將10 μg生物素化NYZL與細(xì)胞常溫下共孵育30 min，取200 μL普通納米脂質(zhì)微泡加入培養(yǎng)板中，常溫下孵育30 min，用PBS沖洗細(xì)胞表面3次，光鏡下觀察普通納米脂質(zhì)微泡與細(xì)胞結(jié)合情。

1.6MTT法檢測(cè)不同濃度微泡對(duì)細(xì)胞增值的影響取96孔板，分A、B、C兩組，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μL,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至5×103孔，邊緣孔用無菌PBS填充。5%CO2，37 ℃孵育，24 h后至細(xì)胞單層鋪滿孔底, A組分別加靶向微泡0、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107(個(gè)/mL)各10 μL；B組分別加普通微泡(濃度同上)；C組分別加入相同量的PBS；之后放入5%CO2、37 ℃孵育。24 h后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，細(xì)胞相對(duì)存活率%=(實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值)×100%。

1.7靶向納米脂質(zhì)微泡體外超聲成像取1×107/mL靶向納米脂質(zhì)微泡5 mL注滿橡膠塞封口的透明西林瓶，同時(shí)取5 mL無離子水注入同樣規(guī)格的西林瓶中作為空白對(duì)照組。用logicE9超聲儀進(jìn)行實(shí)時(shí)成像(中心頻率22 MHz超高頻探頭，機(jī)械指數(shù)為0.06)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。A組、B組、C組對(duì)細(xì)胞的毒性作用均采用One-Way ANOVE,方差不齊則選用近似F檢驗(yàn)Welch法進(jìn)行方差分析，差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05(雙側(cè))。

2　結(jié)　果

2.1普通納米脂質(zhì)微泡的物理特性普通納米脂質(zhì)微泡外觀呈乳白色混懸液； 400倍鏡下觀察微泡分布均勻，無聚集，單個(gè)微泡外觀呈圓形，濃度為3.5×109/mL(圖1A)；Zate檢測(cè)儀示粒徑范圍為321～559 nm，平均集中于466 nm，電位為-14.6 mV。室溫下保存7 d，外觀仍圓整，分布均勻，無聚集現(xiàn)象； 13 d微泡開始變大，大小不一，有集聚現(xiàn)象，分布不均(圖1B)。

2.2靶向納米脂質(zhì)微泡的物理特性靶向納米脂質(zhì)微泡外觀呈乳白色混懸液； 400倍鏡下觀察微泡分布均勻，無聚集，單個(gè)微泡外觀呈圓形，濃度為2.1×109/mL(圖1C)；Zate檢測(cè)儀示粒徑范圍為337～683 nm，平均集中于582 nm，電位為-14.6mV。室溫下保存7 d，外觀仍圓整，分布均勻，無聚集現(xiàn)象； 13 d微泡開始變大，大小不一，有集聚現(xiàn)象，分布不均(圖1D)。

圖1光學(xué)顯微鏡下納米脂質(zhì)微泡變化(×400)

A、B:普通納米微泡(1 d、13 d)；C、D:靶向納米微泡(1 d、13 d)。

2.3MTT法檢測(cè)不同濃度微泡對(duì)細(xì)胞增值的影響MTT結(jié)果顯示3組均未明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(P>0.05，圖2)，提示微泡不直接影響腫瘤細(xì)胞生長，且隨著濃度的升高，A值變化不明顯。

2.4靶向納米脂質(zhì)微泡與普通脂質(zhì)微泡分組體外靶向?qū)嶒?yàn)A組靶向納米微泡造影劑能高效特異性地結(jié)合在膀胱癌BIU-87細(xì)胞表面并沿細(xì)胞表面規(guī)則排列，見圖3A；而B、C、D組未見微泡與膀胱癌BIU-87細(xì)胞明顯結(jié)合，見圖3B、3C、3D。

圖2不同濃度下板孔的A值

圖3　光鏡下納米脂質(zhì)微泡與BIU-87細(xì)胞的結(jié)合(×400)

A:靶向納米微泡與膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合圖；B:普通納米微泡與膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合圖；C:預(yù)先將生物素化的NYZL1阻斷后靶向納米微泡與膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合圖；D:預(yù)先將生物素化的NYZL1阻斷后普通納米微泡與膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合圖。

圖4　超聲顯像效果圖

3　討　論

膀胱癌居中國男性泌尿生殖系惡性腫瘤發(fā)病率第1位[5]，膀胱癌具有惡性程度高、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。準(zhǔn)確早期診斷腫瘤及切實(shí)有效的治療方法是提高患者生存率的關(guān)鍵因素。

本課題組前期利用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選膀胱癌特異性結(jié)合肽(NYZL1)并得到證實(shí)[6]，但其缺乏有效的載體；本研究通過機(jī)械振動(dòng)法和生物素-親和素橋接法制備出靶向膀胱癌的納米脂質(zhì)微泡造影劑NYZL1-NBs，即有效的靶向載體。該納米微泡表面光滑，分布均勻，性質(zhì)穩(wěn)定，平均粒徑集中于582 nm，理論上可以闖過病變血管間隙被動(dòng)靶向腫瘤組織。體外靶向?qū)嶒?yàn)顯示，膀胱癌BIU-87細(xì)胞能與NYZL1-NBs充分結(jié)合并沿細(xì)胞表面規(guī)則排列，而預(yù)先用生物素化-NYZL1與BIU-87細(xì)胞飽和結(jié)合后，細(xì)胞周圍無NYZL1-NBs結(jié)合，結(jié)果表明NYZL1-NBs能與膀胱癌BIU-87細(xì)胞主動(dòng)靶向結(jié)合。體外超聲觀察靶向納米微泡超聲顯像明顯。

與傳統(tǒng)的微泡造影劑相比，納米顆粒尺寸小、比表面積大，表面原子數(shù)、表面能和表面張力隨粒徑的下降急劇增大；表面原子周圍缺少相鄰的原子，有許多懸空鍵，具有不飽和性質(zhì)，易與其他原子相結(jié)合而穩(wěn)定下來，具有很大的化學(xué)活性[7]。由于納米顆粒粒徑小，易逃避體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用，延長其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，而利于細(xì)胞的攝取，從而使藥物緩慢釋放，維持一定的血藥濃度，有效延長了藥物持續(xù)時(shí)間，提高了藥物效能，同時(shí)產(chǎn)生較少的代謝產(chǎn)物，減少身體其他部位的藥物作用，大大減少副作用[8-9]。表面粘附或包裹藥物、基因的納米級(jí)微泡通過靜脈進(jìn)入體內(nèi)，在超聲顯影后給予一定的高聲壓，微泡會(huì)發(fā)生瞬態(tài)熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，致使微泡非對(duì)稱的壓縮、膨脹，最終破裂，從而達(dá)到藥物治療、基因轉(zhuǎn)染的作用[10]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備膀胱癌BIU-87細(xì)胞靶向納米脂質(zhì)微泡超聲造影劑，具有粒徑均勻、性質(zhì)穩(wěn)定、無毒性、體外顯影效果佳、靶向細(xì)胞能力強(qiáng)等特性，為下一步在體內(nèi)移植瘤靶向顯像診斷和載藥靶向治療研究提供重要的基礎(chǔ)，有望進(jìn)一步開拓超聲在膀胱腫瘤中的診斷和治療新領(lǐng)域。

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(編輯何宏靈)

Preparation of BIU-87 cells targeting nanobubbles as ultrasound contrast agent and imaging study in vitro

SU Xi-xi1, YANG Xiao-feng2, ZHANG Fan3, LUO Fang3, JIA Fan1, LI Hong-zhou1, PAN Zuo4

(1. the First Clinical Medical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 2.Department of Urology, First Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 3.Department of Microbiology and Immunology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 4.Department of Urology,Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030032, China)

Objective To prepare nanobubbles specifically targeting BIU-87 cells, and to observe the targeting ability and effect on cell proliferation and ultrasound imaging in vitro. MethodsMechanical vibration method was used to prepare non-targeting nanobubbles. The biotin-avidin bridge method was used to conjugate biotinylated NYZL1, and non-targeting nanobubbles linked to biotin-NYZL1 become targeted nanobubbles. The morphology, concentration and shelf life of nanobubbles were detected with optical microscope, and the particle size and surface charge were measured with Zate detector. The targeting ability was observed with microscope. The proliferation of cells was detected by MTT method. Ultrasound imaging was observed in vitro. ResultsThe targeted nanobubbles were successfully generated, which were round, evenly distributed, without aggregation. In targeted in vitro experiment, the nanobubbles attached to the surface of BIU-87 cells firmly and regularly arranged along the cell surface. There was no significant difference between different concentrations of nanobubbles on cell proliferation (P>0.05). In in vitro ultrasound imaging experiment, the targeted nanobubbles showed fine punctuate hyper echo. ConclusionThe targeted nanobubbles are successfully prepared, which can specifically target and attach to BIU-87 cells in vitro and their ultrasound imaging is fine.

nanobubble; bladder cancer; targeted ultrasound contrast agent; in vitro

2016-01-13

2016-03-04

國家自然科學(xué)基金(No.81172444)

楊曉峰, 主任醫(yī)師, 教授. E-mail：yxfylq@163.com

蘇西西(1989-), 男(漢族),碩士研究生.研究方向:膀胱腫瘤精準(zhǔn)診療新技術(shù). E-mail：2008101033@163.com

R737.14

A