正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選忍冬藤中綠原酸提取工藝

毛　瑩　李東霞　夏春麗

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連，116622)

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正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選忍冬藤中綠原酸提取工藝

毛瑩李東霞夏春麗

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連，116622)

目的：對(duì)忍冬藤中綠原酸的提取工藝進(jìn)行研究。方法：采用正交設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)忍冬藤中綠原酸的微波提取工藝和超聲波提取工藝，采用高效液相法測(cè)定各提取工藝下的綠原酸含量，并將兩種提取方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：微波提取法的最佳提取工藝為：微波時(shí)間為60 s，乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，綠原酸含量為0.357%。超聲波法最佳提取工藝為：提取功率為50 Hz，甲醇濃度為50%，料液比為1∶20，綠原酸含量為0.321%。以綠原酸含量為指標(biāo)，微波提取法優(yōu)于超聲波提取法。結(jié)論：忍冬藤中綠原酸的最佳提取方法為微波提取法，此方法時(shí)間短，耗能低，提取率優(yōu)于超聲波提取法，可用于忍冬藤中綠原酸的提取。

忍冬藤；綠原酸；正交設(shè)計(jì)；提取方法；含量測(cè)定

忍冬藤為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥莖枝，具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)之功效。綠原酸是忍冬藤的主要有效成分之一[1-2]，現(xiàn)代研究表明忍冬藤與金銀花具有相近的化學(xué)成分和藥理活性[3]，均可做為臨床常用清熱解毒藥，而且還作為提取綠原酸的工業(yè)原料，用量較大，價(jià)格較高，貨源較緊。因此從忍冬藤中提取綠原酸應(yīng)用于臨床和市場(chǎng)迫在眉睫。目前對(duì)忍冬藤的研究報(bào)道主要集中在化學(xué)成分、藥理作用等方面，對(duì)其有效成分提取方法的系統(tǒng)性研究較少，這直接影響到忍冬藤的開發(fā)與利用。因此，本文根據(jù)忍冬藤中綠原酸提取方法的一些前期研究，以綠原酸含量為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)忍冬藤中綠原酸的微波和超聲提取工藝進(jìn)行研究，旨在為更好的開發(fā)利用忍冬藤打下基礎(chǔ)。

1　材料

忍冬藤(采自大連大學(xué)藥植園)，經(jīng)大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)研究所鑒定為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥莖枝；綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201213)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

HITACHI L2000型高效液相色譜儀(HITACHI L-2013送液泵，HITACHI UV-detector 2-2400檢測(cè)器)；甲醇(Tedia.)，乙腈(Tedia.)為色譜純，其他試劑為分析純。

2　方法

2.1HPLC色譜條件色譜柱：Hypersil Gold柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取綠原酸對(duì)照品2.6 mg，用50%甲醇定容于50 mL的容量瓶中，搖勻，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3微波提取試驗(yàn)[4-8]取忍冬藤粉末(過(guò)三號(hào)篩)各1 g精密稱定，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)進(jìn)行微波提取，得到9組提取液，冷卻后過(guò)濾，取續(xù)濾液5 mL置25 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，靜止，上清液用0.45 μm濾膜濾過(guò)即可。

2.4超聲波提取試驗(yàn)[9-12]取忍冬藤粉末(過(guò)三號(hào)篩)各1 g精密稱定，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表2)進(jìn)行超聲波提取，得到9組提取液，冷卻后過(guò)濾，取續(xù)濾液5 mL置25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜止，上清液用0.45 μm濾膜濾過(guò)即可。

表1　微波法正交試驗(yàn)因素水平表

表2　超聲波法正交試驗(yàn)因素水平表

2.5線性關(guān)系考察精密吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液3、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)為流動(dòng)相，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的含量為橫坐標(biāo)，對(duì)照品峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=3E+06X+7276，R2=0.9992(n=5)，表明綠原酸在0.15～1.04 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)在規(guī)定色譜條件下精密吸取同一濃度的對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算，RSD=1.05%。

2.7重現(xiàn)性試驗(yàn)稱取供試品0.5 g，共6份，精密稱定后，依法測(cè)定綠原酸含量，RSD=1.12%(n=6)。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)在規(guī)定色譜條件下，精密稱取同一樣品溶液10 μL，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算含量，RSD=1.32%(n=6)結(jié)果表明綠原酸在避光條件下放置24 h基本穩(wěn)定。

2.9加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的忍冬藤藥材，加入一定量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)得平均回收率為99.1%，RSD=1.8%(n=6)。

2.10樣品測(cè)定以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)為流動(dòng)相，按照上述色譜條件，測(cè)定不同提取方法提取的忍冬藤中綠原酸的含量。

2.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)方差分析。

3　結(jié)果

3.1微波提取法從表3和表4中可以看出，各因素對(duì)綠原酸影響的順序?yàn)锳>C>B。以綠原酸含量為指標(biāo)得出的最佳工藝條件是A1B3C3，即提取時(shí)間為60 s，乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，綠原酸含量為0.357%。

表3　微波提取法L9(33)試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

表4　微波提取法綠原酸含量方差分析表

注：在試驗(yàn)水平α=0.05(或0.01)的情況下,分別檢驗(yàn)各因素的顯著性,如果Fi>F0.05(i=A,B,C),即認(rèn)為該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著影響，反之沒(méi)有顯著影響。經(jīng)查表得F0.05=19。

3.2超聲波提取法從表5和表6中可以看出，各因素對(duì)綠原酸影響的順序?yàn)锳>C>B。以綠原酸含量為指標(biāo)得出的最佳工藝條件是A2B1C2，即甲醇濃度為50%，超聲功率為50W，料液比為1∶20，綠原酸含量為0.321%。

3.3不同提取工藝的對(duì)比分析在上述正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別在微波提取法和超聲提取法中篩選出綠原酸含量最高的一組進(jìn)行比較，得出最佳提取工藝為微波提取法提取時(shí)間為60s，乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，綠原酸含量為0.357%。

表5　超聲波提取法L9(33)試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

表6　超聲波提取法綠原酸含量方差分析表

注：在試驗(yàn)水平α=0.05(或0.01)的情況下,分別檢驗(yàn)各因素的顯著性,如果Fi>F0.05(i=A,B,C),即認(rèn)為該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著影響,反之沒(méi)有顯著影響。經(jīng)查表得F0.05=19。

表7　微波提取法與超聲提取法提取工藝對(duì)比分析表

4　討論

本實(shí)驗(yàn)在前期預(yù)試驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了正交試驗(yàn)因素水平的設(shè)置,選擇了最為影響微波提取法和超聲波提取法工藝的主要條件，進(jìn)行了正交試驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，所選擇的實(shí)驗(yàn)條件能夠篩選出微波提取法和超聲波提取法的最佳提取工藝，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供方法和參考。

本實(shí)驗(yàn)中兩種提取方法的最佳提取工藝在綠原酸含量上接近，但微波提取法具有熱效率高、設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、重現(xiàn)性好、節(jié)省試劑、污染小等特點(diǎn)，從提取溶劑上來(lái)講，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇作為綠原酸的微波提取溶劑，結(jié)果表明乙醇能夠較完全的提取藥材中的綠原酸成分，并且乙醇與甲醇相比，具有污染小，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，甲醇比乙醇揮發(fā)快，毒性大，工業(yè)上大量提取不宜采用。同時(shí)，微波提取工藝可有效地克服傳統(tǒng)煎煮提取方法中藥材細(xì)粉易出現(xiàn)糊化、堵塞等問(wèn)題，適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)[13-15]。所以本實(shí)驗(yàn)初步認(rèn)為微波提取法可作為忍冬藤的最佳提取工藝，具體方法有待于進(jìn)一步研究。

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(2015-07-17收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Optimization of Extraction Process of Chlorogenic Acid in Lonicerae japonicae Caulis by Orthogonal Design

Mao Ying, Li Dongxia, Xia Chunli

(MedicalCollege,DalianUniversity,Dalian116622,China)

Objective: To study the extraction methods for chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis. Methods: The microwave extraction and ultrasonic extraction of chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis were set based on orthogonal design. The chlorogenic acid contents of different extraction techniques were detected by HPLC. The results of the two extraction methods were compared. Results: The results show that the chlorogenic acid was highest, up to 0.357%, when microwave time was set at 60s with 50% ethanol concentration and solid-liquid ratio of 1∶15 by microwave extraction. The chlorogenic acid was highest when methanol concentration, up to 0.321%, was set at 50%, ultrasonic power 50W and solid-liquid ratio 1:20 by ultrasonic extraction. By taking chlorogenic acid content as an indicator, microwave extraction method was better than ultrasonic extraction. Conclusion: According to the results, the best extraction method for Chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis was microwave extraction with less time cost and low energy consumption and the extraction rate is better than that of the ultrasonic extraction. It can be applied in the extraction of chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis.

Lonicerae japonicae Caulis; Chlorogenic acid; Orthogonal design; Extraction methods; Determination

遼寧省大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2008E11SF171)

毛瑩(1982.01—)，女，博士研究生，研究方向：中藥鑒定方法學(xué)、中藥藥效組分及藥效組分質(zhì)量評(píng)價(jià)體系研究，E-mail:maoyingying2004@sina.com

R284.2

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.049