加味良附丸聯(lián)合5-FU對荷人胃癌裸鼠血清TGF-β1、IL-17水平的影響

趙林濤　宋延平　侯　麗　陳信義　吳曉勇

(1 陜西省中醫(yī)藥研究院藥理研究室,西安,710003; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腫瘤血液科,北京,100700;3 貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院苗醫(yī)藥科,貴陽,550001)

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實驗研究

加味良附丸聯(lián)合5-FU對荷人胃癌裸鼠血清TGF-β1、IL-17水平的影響

趙林濤1宋延平1侯麗2陳信義2吳曉勇3

(1 陜西省中醫(yī)藥研究院藥理研究室,西安,710003; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腫瘤血液科,北京,100700;3 貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院苗醫(yī)藥科,貴陽,550001)

目的:觀察加味良附丸聯(lián)合5-FU對荷人胃癌裸鼠血清TGF-β1、IL-17水平的影響。方法:60只裸鼠造模成功后隨機分為模型組、5-FU組、加味良附丸中劑量+5-FU組(聯(lián)合給藥組)及加味良附丸高、中、低劑量組。加味良附丸高、中、低劑量組給藥劑量分別為10 g/(d·kg)、5 g/(d·kg)、2.5 g/(d·kg);5-FU組給藥劑量為17 mg/(d·kg);模型組給予等體積生理鹽水,聯(lián)合給藥組劑量為加味良附丸中劑量5 g/(d·kg)聯(lián)合應(yīng)用5-FU(17 mg/(d·kg)。連續(xù)給藥10 d,眼球取血,ELISA法檢測血清TGF-β1、IL-17含量。結(jié)果:聯(lián)合給藥組、5-FU組、加味良附丸高、中、低劑量組裸鼠血清中TGF-β1、IL-17含量明顯低于模型組(P<0.01);聯(lián)合給藥組血清TGF-β1含量與新加良附高丸劑量組、5-FU組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與加味良附丸中、小大劑量組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各給藥干預(yù)組血清IL-17含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:炎性反應(yīng)細(xì)胞因子TGF-β1、IL-17可能參與了胃癌發(fā)生發(fā)展,加味良附丸聯(lián)合5-FU具有抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901移植瘤裸鼠血清中炎性反應(yīng)細(xì)胞因子TGF-β1、IL-17的表達,其可能通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的表達來影響胃癌的發(fā)生與發(fā)展。

加味良附丸;胃腫瘤;SGC-7901;炎性反應(yīng)細(xì)胞因子

CollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,China)

胃癌(Gastric Cancer,GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一[1],在國內(nèi)其發(fā)病率居第2位、死亡率居第3位,而農(nóng)村地區(qū)胃癌發(fā)病率與死亡率均居前2位[2],嚴(yán)重危害人民健康。長期臨床實踐表明“寒凝氣滯血瘀”是胃癌發(fā)生以及發(fā)展過程中的重要病機,本團隊針對性擬定的加味良附丸在胃癌的治療中療效明確。既往臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果,表明該方具有抗腫瘤作用,其具體機制包括誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、抗胃癌新生血管生成等多種機制[3-5]。有研究表明腫瘤微環(huán)境中存在大量炎性反應(yīng)細(xì)胞因子,TGF-β、IL-17是其中之一,其在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[6-7],但其在胃癌中的發(fā)病尚不完全清楚。本研究通過動物實驗,運用ELISA方法檢測人胃癌細(xì)胞SGC-7901移植瘤裸鼠血清炎性反應(yīng)細(xì)胞因子TGF-β1、IL-17的表達,旨在探討TGF-β1、IL-17在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及加味良附丸治療胃癌的作用機制。

1　資料與方法

1.1實驗材料1)細(xì)胞株:人胃癌細(xì)胞SGC-7901株購于第四軍醫(yī)大學(xué)。2)實驗動物:Balb/C裸鼠,4～5周,60只,雌雄各半,購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK(滬)2012-0002,合格證號:20070005441312,在第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。3)實驗藥物:加味良附丸(浸膏或干燥原粉):陜西星華制藥有限公司提供(按照中藥新藥制備工藝制備);5-FU,上海旭東海普藥業(yè)有限公司,批號:110608。4)儀器:超凈工作臺SW-CJ-IF(BIOLOGICAL公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(SHELDON公司);TDZ4AWS臺式低速自動平衡離心機;低溫冰箱(SANYO公司)。酶標(biāo)儀(美國伯樂)。5)試劑:1640培養(yǎng)液(Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司)。TGF-Β1、IL-17 ELISA試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型建立及分組液氮中取出SGC-7901細(xì)胞,37 ℃水浴,加入10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)傳代,待細(xì)胞長滿單層后0.25%胰酶消化,1 000 r/min離心5 min,去上清收集細(xì)胞,PBS稀釋后鏡下調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×107個/mL,取0.2 mL接種于裸鼠頸背部,待腫瘤長至1 000 mm3時移植。接種裸鼠腫瘤體積約在100～300 mm3之間時,據(jù)瘤體體積、性別按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、5-FU組、加味良附大、中、小劑量組、加味良附中劑量+5-FU組(聯(lián)合給藥組)6組,10只/組。

1.2.2給藥方法模型組:0.9%NS 0.2 mL/10 g灌胃;5-FU組:17 mg/(d·kg)灌胃,2次/周。加味良附丸大、中、小劑量組分別按10 g/(d·kg)、5 g/(d·kg)、2.5 g/(d·kg)灌胃,分別相當(dāng)于成人用藥劑量的20倍、10倍、5倍。聯(lián)合給藥組:加味良附中劑量與5-FU劑量同上。給藥10 d。

1.3ELISA法檢測血清TGF-β1、IL-17給藥第10天后,裸鼠眼球取血1 mL,3 000 r/min離心10 min后取血清凍存,ELISA檢測血清TGF-β1、IL-17的表達水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書由專人操作。

2　結(jié)果

聯(lián)合給藥組、5-FU組、加味良附丸高、中、低劑量組裸鼠血清中TGF-β1、IL-17含量明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);聯(lián)合給藥組血清TGF-β1含量與加味良附丸高劑量組、5-FU組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與加良附丸中、小劑量組比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各給藥干預(yù)組血清IL-17含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組裸鼠血清TGF-β1、IL-17含量

注:與模型組比較,*P<0.05,△P<0.05;與加良附丸中、小劑量組比，▲P<0.05。

3　討論

TGF-β是一個具有免疫抑制功能的多功能細(xì)胞因子,在腫瘤微環(huán)境中,TGF-β主要由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌,TGF-β與受體TβRII結(jié)合后啟動經(jīng)典Smad和非Smad信號通路,參與腫瘤的生長、血管生成、轉(zhuǎn)移和侵襲等多個進程[8]。TGF-β對腫瘤的作用具有雙向性,在腫瘤發(fā)生早期階段,TGF-β是一種有效的腫瘤抑制劑,而對于已形成的腫瘤,TGF-β則促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[6-7]。TGF-β1是TGF-β超家族主要成員之一,是目前已知和腫瘤關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子之一[6]。彭素芳等[9]研究提示胃癌患者血漿中TGF-β水平明顯高于健康對照組,中晚期胃癌血漿中TGF-β水平明顯高于早期胃癌,提示監(jiān)測胃癌患者外周血相關(guān)細(xì)胞因子水平,有助于對病程的判斷。孟欣穎等[10]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中IL-17、IL-6和TGF-β1陽性表達明顯高于對照組,且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。沈衛(wèi)東等[11]的研究中,胃癌組織中TGF-β1蛋白表達的陽性率為77.8%,mRNA表達的陽性率為88.9%,均明顯高于正常對照組,并發(fā)現(xiàn)其與與腫瘤病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、脈管浸潤有相關(guān)性,已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或浸潤已達到漿膜層的組織、有脈浸潤的組織TGF-β1表達高。Yuan等[12]研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中TGF-β1水平明顯上調(diào),且胃癌晚期患者血清中TGF-β1水平高于早期胃癌患者,并且胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時,血清中TGF-β1水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。以上研究均提示TGF-β1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能起促進作用。

Th17細(xì)胞是不同于Th1和Th2細(xì)胞的CD+4T細(xì)胞亞群,其分化發(fā)育過程中受到包括自身分泌的細(xì)胞因子在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。TGF-β和IL-6是Th17的分化的啟動因子,IL-6通過活化STAT3抑制Foxp3的表達并阻止其與RORγt的相互作用,促進Th17分化[13]。Th17細(xì)胞可特異性地產(chǎn)生IL-17效應(yīng)因子[14],是一種促炎性細(xì)胞因子。IL-17可以通過促進血管形成、促進腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡促進腫瘤生長以及調(diào)控腫瘤的免疫應(yīng)答等多種途徑促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展[15],其在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤組織中表達均顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及其功能性細(xì)胞因子IL-17在胃癌組織及血清中的濃度也明顯增高,且與胃癌的進展相關(guān)[16-19]。Zeng等[20]對實體瘤中IL-17表達進行meta分析顯示,實體瘤組織中IL-17的高表達與較低的無病生存率(DFS)密切相關(guān),高表達IL-17的胃癌患者總生存率(OS)和DFS較差。Jiang等[21]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌患者腫瘤組織中IL-17RA的表達顯著高于正常組織,并且與腫瘤的進展、淋巴結(jié)的侵襲、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床腫瘤分期等密切相關(guān),認(rèn)為可以作為判斷預(yù)后的一個獨立因素。動物實驗研究表明,IL-17R敲除小鼠和IL-17/IFN-γ雙敲小鼠抑制腫瘤生長,而在IL-17敲除小鼠中腫瘤的生長速度顯著加快,提示IL-17具有促進或抑制腫瘤的效應(yīng)[22-23]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901移植瘤裸鼠血清中TGF-β1、IL-17的含量明顯高于各給藥組,經(jīng)藥物干預(yù)后,聯(lián)合給藥組、5-FU組、加味良附丸高、中、低劑量組裸鼠血清中TGF-β1、IL-17含量明顯低于模型組,推測炎性反應(yīng)細(xì)胞因子TGF-β1、IL-17可能參與了胃癌發(fā)生與發(fā)展。聯(lián)合給藥組移植瘤裸鼠血清TGF-β1含量與加味良附丸高劑量組、5-FU組比差異不顯著無統(tǒng)計學(xué)意義,但加味良附丸和5-FU聯(lián)合用藥對TGF-β1的抑制優(yōu)于單獨用藥,與加味良附丸中、小劑量組比,差異顯著;各給藥干預(yù)組移植瘤裸鼠血清中IL-17含量無顯著性差異。本研究顯示,加味良附丸聯(lián)合5-FU具有協(xié)同作用,具有抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901移植瘤裸鼠血清中炎性反應(yīng)細(xì)胞因子TGF-β1、IL-17的表達,其可能通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的表達來影響胃癌的發(fā)生與發(fā)展。盡管炎性反應(yīng)細(xì)胞因子在胃癌發(fā)生發(fā)展中起一定的作用,但細(xì)胞因子一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),僅依賴于TGF-β1、IL-17這個細(xì)胞因子來評價加味良附丸治療胃癌的效應(yīng)機制是不夠的,有待進一步深入研究炎性反應(yīng)細(xì)胞因子在胃癌中作用機制,為胃癌的防治策略提供幫助。

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(2016-01-15收稿責(zé)任編輯：王明)

Effects of Modified Liang-Fu Pill Combined with 5-FU on TGF-β1 Level in Serum of SGC-7901 Tumor-bearing Nude Mice

Zhao Lintao1, Song Yanping1, Hou Li2, Chen Xinyi2, Wu Xiaoyong3

(1PharmacologyLaboratory,ShaanxiprovincePharmacologicalInstituteofTraditionalChinesemedicine,Xi′an710003,China; 2DepartmentofHematologyandOncology,DongzhimenHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China; 3MiaomedicineDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofGuiyang

Objective: To observe the effects of Supplemented Liang-fu Pill(SLFP) combined with 5-FU on TGF-β1、IL-17 level in serum of SGC-7901 tumor bearing nude mice. Methods: The tumor-bearing nude mice models with human gastric cancer cell line SGC-7901were established and randomly divided into six groups: model group, 5-FU group, combination group and SLFP in high, medium, low dose groups. The dosage of SLFP in high, medium, low dose groups were 10 g·d-1·kg-1、5 g·d-1·kg-1、2.5 g·d-1·kg-1respectively. The 5-FU group′s dosage is 17 mg·d-1·kg-1, the model group were given equal normal saline and the combination group were given Supplemented Liang-Fu Pill (5 g·d-1·kg-1) and 5-FU(17 mg·d-1·kg-1). The mice were treated for 10 days and then detected for the level of TGF-β1 and IL-17 in serum of SGC-7901 tumor bearing nude mice with the method of ELISA. Results: The levels of TGF-β1 and IL-17 in 5-FU group, combination group, SLFP in high, medium, low dose groups were significantly lower than those in model group (P<0.01). The levels of serum TGF-β1 in the combination group was not significantly different compared with that of SLFP in high dose group and the 5-FU group (P<0.05). But there was significant different compared with SLFP in high, medium and dose groups. There were no significant difference of the levels of serum IL-17 in each group(P>0.05). Conclusion: Inflammatory cytokine TGF-β1, IL-17 may result in gastric cancer. The SLFP combined with 5-FU maybe inhibit the expression of TGF-β1and IL-17 in the serum of human gastric cancer cell SGC-7901 tumor bearing nude mice, which may affect the growth of gastric cancer by regulating the expression of inflammatory cytokines.

Supplemented Liang-Fu Pill; Gastric cancer; SGC-7901; Inflammatory cytokines

貴州省科技廳基金項目(編號:黔科合J字[2011]2296號);貴州省科學(xué)技術(shù)廳、貴陽中醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金(編號:黔科合中藥字[2010]LKZ7034);2010年貴陽中醫(yī)學(xué)院博士啟動基金;北京中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)科研基地建設(shè)項目,北京市重點實驗室(中醫(yī)內(nèi)科學(xué))(編號:2011-JDJS-02)

趙林濤(1983.08—),男,碩士,助理研究員,研究方向:中藥抗腫瘤新藥研究,E-mail：75959634@qq.com

吳曉勇(1979.02—),男,醫(yī)學(xué)博士,副教授,研究方向:中醫(yī)藥防治腫瘤臨床及實驗研究,E-mail:xyongwu79@163.com

R289.3

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.040