不同功率的激光刺激對小鼠C2C12成肌細胞耗氧率水平的影響及機制*

馮 鈺， 程澤鵬， 孫 鵬， 史仍飛

(上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院， 上海 200438)

低強度激光療法在20世紀(jì)80年代已經(jīng)引起了國內(nèi)外重視，目前在眼科、牙科方面已被廣泛使用。隨著大眾健身的熱潮，運動損傷(尤其是骨骼肌損傷)的發(fā)生率呈爆發(fā)式增加，而對骨骼肌損傷后康復(fù)治療的研究逐漸成為運動醫(yī)學(xué)的熱點。對肌細胞的基礎(chǔ)研究方面，之前的實驗發(fā)現(xiàn)低強度激光具有提高肌衛(wèi)星細胞增殖、加強骨骼肌細胞萎縮及創(chuàng)傷后的恢復(fù)、促進肌細胞分化為肌管等作用[1,2]。在激光刺激的劑量方面，SHEFER G等[3]發(fā)現(xiàn)0.5 J/cm2的激光劑量會促進肌衛(wèi)星細胞增殖，這與抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白合成有關(guān)[4]，而過高劑量的激光會抑制細胞增殖，甚至引起凋亡[5]。

低強度激光會影響線粒體內(nèi)膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運，對細胞供氧能力有一定影響，進而影響細胞線粒體氧化磷酸化能力。且細胞消耗氧的速率也可以作為評判能量代謝的一種指標(biāo)。激光作為一種特異性光能源，是否會對細胞代謝產(chǎn)生積極效應(yīng)仍未有足夠的實驗證明。已知的研究認為mTOR-PGC1α通路對細胞轉(zhuǎn)錄因子有調(diào)控作用[6, 7]，從而影響細胞氧化磷酸化水平，那么，低強度激光是否對離體肌細胞氧化磷酸化水平有影響，是否影響mTOR-PGC1α通路中信號蛋白表達？本實驗旨在探討不同劑量的650 nm低強度激光對C2C12小鼠成肌細胞氧化磷酸化水平的影響，并對相關(guān)合成酶進行檢測，為進一步豐富低強度激光對離體細胞氧化磷酸化的影響及其機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM、胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco，美國)；PBS緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)；BCA蛋白濃度試劑盒、ECL發(fā)光液試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)；細胞外耗氧率試劑盒(Luxcel Biosciences，愛爾蘭)；MyoD一抗、山羊抗兔HRP、PGC-1α一抗、mTOR一抗、p-mTOR一抗、β-actin抗體(CST，美國)；一抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)；Trans-Blot電泳槽、Trans-Blot轉(zhuǎn)膜槽(Bio-Rad，美國)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；Leica倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀(CLARIOstar，德國)；激光二極管；全自動熒光成像顯影儀(Tanon 5200 Multi)。

1.2 小鼠C2C12成肌細胞培養(yǎng)

以體外培養(yǎng)的C2C12小鼠成肌細胞(購于中國科學(xué)院細胞庫；上海)為實驗對象，用含有10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，置于恒溫37℃，含有5% CO2的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細胞在培養(yǎng)皿中生長至80%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化，以1∶2比例進行傳代培養(yǎng)，將細胞接種至6孔板上，接種密度為4×105個細胞/孔，接種24 h后進行激光刺激。

1.3 激光干預(yù)方案

本實驗采用輸出功率5 mW，波長650 nm的二極管進行激光干預(yù)，根據(jù)照射劑量不同分為3組，每組6個復(fù)孔，C組為對照組，即無激光刺激；L組為低劑量組，激光劑量為0.4 J/cm2(激光刺激時間12.8 min)；H組為高劑量組，激光劑量為0.8 J/cm2(激光刺激時間25.6 min)。

1.4 細胞氧化磷酸化水平測定

采用耗氧率試劑盒檢測細胞耗氧率水平。將含有氧敏感性的熒光探針加入懸浮細胞中，并加入礦物油隔絕空氣與細胞懸液，隨著時間變化，細胞懸液中的氧含量會隨著氧消耗逐漸減少，熒光信號增加，其熒光壽命斜率即耗氧速率。檢測方法：將實驗后6孔板中貼壁細胞用PBS清洗兩遍，0.25%胰酶消化，制備成為細胞懸液，并進行計數(shù)，將細胞接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液為150 μl(細胞數(shù)為1×106)，探針10 μl及礦物油100 μl，放入37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀測量耗氧率。

1.5 Western blot法測定蛋白表達量

待激光刺激結(jié)束24 h后，用PBS清洗6孔板兩遍，每孔加入150 μl裂解液裂解細胞，所有操作保證低溫環(huán)境。用刮板將裂解好的細胞從6孔板中刮下，放入1.5 ml的eppendorf管中，離心15 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min。取上清，用BCA試劑盒檢測細胞總蛋白濃度，確定上樣量(25 μg)，蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離(濃縮膠5%，分離膠10%)后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉進行封閉1 h后孵育一抗(1∶1 000)，4℃過夜，結(jié)束后用TBST漂洗3次，孵育二抗(1∶3 000)室溫1 h。將孵育好的PVDF膜浸入發(fā)光液中，用全自動熒光成像分析系統(tǒng)進行顯影，并曝光拍照。使用ImageJ軟件分析目標(biāo)蛋白與內(nèi)參灰度值，進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 激光刺激對C2C12細胞耗氧率的影響

實驗采用耗氧率試劑盒檢測細胞氧化磷酸化水平，當(dāng)細胞與空氣隔絕，細胞逐漸消耗培養(yǎng)基中的氧，探針?biāo)ぐl(fā)的熒光信號隨之增加，熒光壽命曲線斜率越高代表了細胞耗氧率越高[7]，圖1為各組熒光壽命-時間曲線。與對照組相比，低劑量組耗氧率水平顯著增高(P<0.05)，而高劑量刺激組則無明顯差別(P>0.05，表1)。

Fig.1Fluorescence lifetime curve of each group

2.2 激光刺激對PGC-1α蛋白表達的影響

PGC-1α是線粒體生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，其對線粒體的合成與表達有關(guān)。各組PGC-1α蛋白相對表達量如表1所示，低劑量組和高劑量組PGC-1α蛋白相對表達量均顯著增高于對照組(P<0.01)，且高劑量刺激組顯著低于低劑量刺激組(P<0.05)。

Tab. 1 The analysis of oxygen consumption rate and protein

C: Control group; L: Low dose group; H: High dose group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；#P<0.05vslow dose group

2.3 激光刺激對p-mTOR/mTOR蛋白表達量的影響

mTOR可以通過轉(zhuǎn)錄因子(YY1)-PGC-1α來調(diào)控線粒體氧化功能[7]，對于細胞生長有重要影響，同時對細胞增殖，蛋白轉(zhuǎn)運也有一定作用。如表1所示，與對照組相比，低劑量組對p-mTOR/mTOR蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)，高劑量組蛋白表達量顯著降低(P<0.05， 圖2)。

Fig.2Immunoblotting images in mouse C2C12myoblasts by Western blot

C: Control group; L: Low dose group; H: High dose group

2.4 激光刺激對MyoD蛋白表達的影響

MyoD是肌細胞再生的主要調(diào)節(jié)因子，能促進成肌細胞的增殖及分化。各組C2C12成肌細胞MyoD蛋白相對表達結(jié)果如表1，與對照組相比，低劑量組和高劑量組MyoD蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05,P<0.01)，且高劑量組也顯著性高于低劑量組(P<0.05)。

3 討論

激光療法對在體肌細胞損傷修復(fù)功能已被許多文獻報道[8]，其不僅可以促進肌肉質(zhì)量增加及減少疤痕產(chǎn)生，也對機體抗氧化能力也有一定增強作用。離體實驗證明適量的低強度激光可以促進肌細胞增殖，但對離體細胞分化及線粒體氧化能力的報道較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，650 nm的低強度激光照射促進小鼠C2C12成肌細胞MyoD蛋白表達，增強細胞分化能力。且兩種劑量的低強度激光均可增強MyoD蛋白表達，是否更高劑量的低強度激光刺激會抑制成肌細胞分化能力，還有待進一步研究。MyoD作為骨骼肌細胞形成的重要蛋白被人們熟知[9]，對細胞分化有著調(diào)控作用[10]，之前在體實驗中也發(fā)現(xiàn)低強度激光可以提高大鼠骨骼肌中MyoD mRNA和蛋白的表達，但對激光劑量要求較高，需3.2 J/cm2及以上[11, 12]，本實驗中0.4 J/cm2的低強度激光便可影響MyoD蛋白表達，表明離體成肌細胞對激光劑量較在體肌肉組織更為敏感。

我們研究發(fā)現(xiàn)適宜劑量的激光照射不僅誘導(dǎo)骨骼肌細胞分化，同時對線粒體氧化功能也有一定促進作用。但過高劑量的激光照射會抑制兩種蛋白表達。之前研究發(fā)現(xiàn)激光刺激可以促進線粒體相關(guān)合成酶的表達，從而增強線粒體活性[13, 14]，PGC-1α作為一種細胞核受體轉(zhuǎn)錄輔助激活因子和細胞能量代謝輔助激活因子，可以通過控制轉(zhuǎn)錄因子如雌激素相關(guān)受體(estrogen related receptor，ERR-α)和核呼吸因子(nuclear respiratory factor，NRF)來調(diào)控線粒體功能，對細胞氧化磷酸化水平有著重要影響[6, 7]。為進一步探討不同劑量的激光對成肌細胞線粒體的氧化能力，我們也檢測成肌細胞中PGC-1α和p-mTOR/mTOR蛋白，研究結(jié)果顯示0.4 J/cm2激光照射促進PGC-1α蛋白的表達，而0.8 J/cm2的激光照射抑制成肌細胞PGC-1α蛋白表達的增加，與細胞耗氧率檢測結(jié)果相吻合。

p-mTOR/mTOR蛋白檢測結(jié)果顯示過高劑量的激光照射會抑制蛋白的表達，但低劑量的激光刺激對其無顯著影響，這可能與mTOR功能有關(guān)，mTOR屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)超家族，是一種絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，具有誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、核糖體合成，調(diào)控PGC-1α[15]，控制線粒體自噬，影響骨骼肌肥大等多種功能[7, 16]，雖然mTOR可以通過YY1-PGC-1α途徑來調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[5-6]，但mTOR所調(diào)控的通路較為復(fù)雜。激光刺激可能不僅影響了mTOR-PGC1α通路，對AKT/mTOR通路也有一定影響[17]。

綜上所述，較低劑量(0.4 J/cm2)的650 nm低強度激光增強成肌細胞氧消耗水平，即氧化代謝能力，并對細胞分化有一定影響。其機制可能與適宜的激光刺激影響PGC-1α蛋白的表達，進而影響線粒體氧化呼吸有關(guān)。