冬蟲夏草菌粉對(duì)腎缺血-再灌注損傷大鼠Klotho基因和免疫調(diào)節(jié)的影響*

李莉 楊敏 何華瓊 張秋芳 吳勝英（湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北十堰442000）

·證治探討·

冬蟲夏草菌粉對(duì)腎缺血-再灌注損傷大鼠Klotho基因和免疫調(diào)節(jié)的影響*

李莉 楊敏 何華瓊 張秋芳 吳勝英△
（湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北十堰442000）

目的觀察冬蟲夏草菌粉對(duì)大鼠腎缺血-再灌注損傷動(dòng)物模型Klotho基因和免疫調(diào)節(jié)的影響，探討其可能的機(jī)制。方法30只Wistar大鼠分為假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠采用夾閉雙腎動(dòng)脈45min后復(fù)灌方法造模，假手術(shù)組不夾閉雙腎動(dòng)脈作為對(duì)照。術(shù)后實(shí)驗(yàn)組給予10%冬蟲夏草菌粉按2.0mL/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組則給予2.0mL/（kg·d）生理鹽水。灌胃治療7 d后，檢測(cè)尿磷（UP）含量、血清總蛋白（STP）、白蛋白（ALB）和腎功能3項(xiàng)［胱抑素C（Cys C）、肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）］，RT-PCR法檢測(cè)腎組織Klotho蛋白和Klotho-mRNA表達(dá)及腎組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脫氫酶（LDH）含量。結(jié)果模型組腎組織勻漿中Klotho蛋白和Klotho-mRNA與假手術(shù)組比較下調(diào)（均P＜0.05）；模型組大鼠心室內(nèi)血STP和ALB治療后與假手術(shù)組比較差別不大（均P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組Klotho蛋白、Klotho-mRNA、STP和ALB與模型組比較均升高（均P＜0.05）。模型組心室內(nèi)血清SOD與假手術(shù)組比較降低，而MDA升高（均P＜0.05），LDH則差別不大（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組MDA與模型組比較降低，SOD活性增強(qiáng)（均P＜0.05）。模型組Cys C、Scr、BUN和UP與假手術(shù)組比較均升高（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組Cys C、Scr、BUN 和UP與模型組比較均降低（均P＜0.05）。結(jié)論冬蟲夏草菌粉在抑制腎缺血-再灌注造成的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的同時(shí)，免疫力得以提升，并通過(guò)上調(diào)Klotho蛋白和lotho-mRNA達(dá)到抗衰老、增加UP排泄來(lái)減輕腎功能損害。

腎缺血-再灌注損傷冬蟲夏草菌粉Klotho基因免疫調(diào)節(jié)腎功能大鼠

【Abstract】Objective：To establish the rat renal ischemia-reperfusion injury animalmodel，to observe the effect of Cordyceps sinensis on the Klotho gene and immune regulation of the anti-ischemia-reperfusion injury and immune regulation mechanism.Methods：30 Wistar rats were random ly divided into sham operation group，the model group and the experimental group.Themodel group and the experimental group weremodelled with reperfusionmethod 45min after clamping bilateral renal，sham operation group without clamping bilateral renal as control.After operation，the experimental group received 10%Cordyceps powder，with gavage of 2.0mL/（kg·d），sham operation group and themodel group with 2.0mL/（kg·d）irrigation saline as control.7 days after gavage administration，urine phosphorus（up）contentwas detected；heart blood sampleswere taken formeasurement of STP，ALB and renal function in three［Cys C，SCRand BUN］.Rats were sacrificed from the right kidney and detected through RT-PCR to detect Klotho protein and Klotho-mRNA expression，then the contentof MDA，SOD and LDH in renal tissue.Results：Compared with the model group，STP，ALB and SOD in the experimental group increased；Klotho protein and Klotho-mRNA significantly up-regulated；Cys C，SCR，BUN and UP decreased，and MDA was significantly inhibited（P＜0.05）.Compared with sham operation group，Klotho protein and Klotho-mRNA significantly down-regulated in the model group（all P＜0.05）；there was little difference between the two groups in STP and ALB after treatment（all P＞0.05）.Compared with themodel group，Klotho protein，KlothomRNA，STP and ALB in the experimental group rose（all P＜0.05）.Compared with the sham operation group，the serum SOD in themodel group was lower，while the MDA was increased（all P＜0.05）.Compared with themodelgroup，MDA activity of the experimental group decreased，and the activity of SOD was enhanced（all P＜0.05）.Cys C，Cr，BUN，UP and Cys in themodel group were higher than that in the sham operation group（all P＜0.05）.Cys C，Cr，BUN，UP and Cys in the experimental group was lower than that of themodel group（all P＜0.05）.Conclusion：Cordyceps sinensis can inhibit lipid peroxidation caused by renal ischemia reperfusion injury；immunity can be improved，and through the regulation of Klotho protein and klotho-mRNA，it can have an effect of anti-aging and ramped-up excretion to reduce renal damage.

【Key words】Renal ischemia-reperfusion injury；Cordyceps sinensis；Klotho gene；Immune regulation；Rat

腎缺血-再灌注損傷（IRI）導(dǎo)致的缺血性急性腎功能衰竭（ARF）病死率極高，存活者多轉(zhuǎn)變?yōu)榻K末期腎病［1］。IRI包括腎血流再通后再灌注損傷和腎缺血性損傷［2］。IRI腎功能損傷與機(jī)體氧化應(yīng)激密切相系，因此，抗氧自由基或及時(shí)清除氧自由基可能改善IRI造成的急性腎功能損傷［3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)Klotho基因在腎組織表達(dá)上調(diào)可改善腎功能并達(dá)到抗衰老作用［4］，并且利用滋補(bǔ)性中藥冬蟲夏草進(jìn)行腎缺血預(yù)處理和控制自身免疫反應(yīng)可減輕腎細(xì)胞毒性反應(yīng)，減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)腎小管細(xì)胞功能恢復(fù)而達(dá)到調(diào)節(jié)自身免疫和治療作用［5］。在本研究中，筆者應(yīng)用冬蟲夏草菌粉對(duì)IRI進(jìn)行干預(yù)和治療，通過(guò)比較大鼠腎組織Klotho基因表達(dá)及酶學(xué)等指標(biāo)改變來(lái)探討冬蟲夏草菌粉對(duì)大鼠IRI的保護(hù)作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠30只，周齡39～40周，體質(zhì)量182～193 g。大鼠許可證為SCXK（鄂）2011-0008，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SYXK（鄂）2011-0031］。實(shí)驗(yàn)盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，減輕動(dòng)物術(shù)中疼痛，創(chuàng)口消毒時(shí)盡量減少動(dòng)物的疼痛和不適等，滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本福利要求［6］。室內(nèi)溫度恒定在20～22℃，濕度60%～80%。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，24 h交替光照，普通飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物自由飲水，每日室內(nèi)紫外線消毒并及時(shí)清理糞便。

1.2藥物與試劑冬蟲夏草菌粉購(gòu)自杭州華東制藥（批號(hào)：20120121），使用前用注射用水配制成10%混懸液；戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，德國(guó)進(jìn)口分裝，批號(hào)：061222）；丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠可溶性Klotho蛋白檢測(cè)試劑盒及RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司。

1.3造模與分組30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組共3組，各10只。參照文獻(xiàn)［7］造模，術(shù)前動(dòng)物均禁食12 h，不禁水。3%戊巴比妥鈉腹腔注射（1mL/kg）麻醉，動(dòng)物麻醉后腹部向上仰臥位固定于鼠臺(tái)，整個(gè)腹部碘伏消毒后用75%酒精脫碘，自劍突下2 cm腹部正中切開長(zhǎng)1.5～2.0 cm切口，逐層分離皮膚和大網(wǎng)膜，采用37℃無(wú)菌生理鹽水浸泡過(guò)的無(wú)菌紗布包裹胃、腸等器官防止器官干燥壞死。用玻璃分針順腹主動(dòng)脈向下找到雙側(cè)腎臟動(dòng)脈并分離干凈腎臟周脂肪及結(jié)締組織，用動(dòng)脈夾夾閉雙腎動(dòng)脈45min后松開動(dòng)脈夾復(fù)灌的方法造模。一般在夾閉雙腎30min左右后可見腎臟由鮮紅逐漸變紫黑色，說(shuō)明血液阻斷成功動(dòng)脈。45min后去掉動(dòng)脈夾復(fù)灌，恢復(fù)血流后可見腎臟由紫黑色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色。造模后清理無(wú)菌紗布，分層關(guān)閉腹腔，縫合皮膚并用碘伏消毒。假手術(shù)組手術(shù)開腹并分離雙腎動(dòng)，但不夾閉雙腎動(dòng)脈，45min后關(guān)閉腹腔作為對(duì)照。肌肉注射慶大霉素預(yù)防感染（每日1次，連續(xù)3 d）。

1.4給藥方法術(shù)后實(shí)驗(yàn)組給予10%冬蟲夏草菌粉2.0 mL/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組則給予2.0 mL/（kg·d）生理鹽水。3組大鼠灌胃治療7 d。

1.5標(biāo)本采集與檢測(cè)1）治療7 d后再次麻醉動(dòng)物，收集1 mL尿液檢測(cè)尿磷（UP）含量，然后心臟采血1 mL置于0℃冰箱備用，檢測(cè)時(shí)取1mL樣品血于離心管（4500 r/min）離心5min，然后取上血清于檢驗(yàn)科測(cè)定血清總蛋白（STP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Scr）、胱抑素（Cys C）和尿素氮（BUN）等指標(biāo)。2）采血完成后處死動(dòng)物取腎，置于0℃冰箱備用，檢測(cè)SOD、MDA和LDH含量時(shí)，取少量腎組織樣本，研磨勻漿，嚴(yán)格按說(shuō)明檢測(cè)腎組織勻漿中SOD、MDA和LDH含量。3）參考文獻(xiàn)［8］采用RT-PCR法檢測(cè)Klotho基因，取動(dòng)物腎組織樣本用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因Klotho片段，上游引物5′-GTTTCT GCTGCCTTGTAT-3′；下游引物5′-ACTATGTCGCTTT CTTGG-3′。93℃預(yù)變性5min，61℃退火1min，71℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析條帶灰度值以確定Klotho-mRNA表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)數(shù)資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠Klotho基因、STP和ALB水平比較見表1。結(jié)果示，模型組腎組織勻漿中Klotho蛋白和Klotho-mRNA與假手術(shù)組比較下調(diào)（均P＜0.05），血STP和ALB治療后與假手術(shù)組比較差別不大（均P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組Klotho蛋白、Klotho-mRNA、STP和ALB與模型組比較均升高（均P＜0.05）。

表1　各組大鼠K l o t h o基因、STP和ALB水平比較（±s）

表1　各組大鼠K l o t h o基因、STP和ALB水平比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n實(shí)驗(yàn)組10假手術(shù)組10模型組10 Klotho蛋白灰度值Klotho-mRNA灰度值STP（g/L）ALB（g/L）152.17±17.14△109.26±14.35△57.25±7.68△29.17±4.61△101.57±14.73 73.01±11.22 47.25±7.02 23.42±3.27 72.57±9.25*51.85±7.34*46.35±6.76 22.39±4.81

2.2各組大鼠腎組織勻漿中MDA、LDH和SOD水平比較見表2。結(jié)果示，模型組心室內(nèi)血清SOD與假手術(shù)組比較降低，而MDA升高（均P＜0.05），LDH則差別不大（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組MDA與模型組比較降低，SOD活性增強(qiáng)（均P＜0.05）。

表2　各組大鼠腎組織勻漿中MDA、LDH和SOD比較（±s）

表2　各組大鼠腎組織勻漿中MDA、LDH和SOD比較（±s）

組別n SOD（U/L）實(shí)驗(yàn)組10 130.52±20.57△假手術(shù)組10 127.21±15.46模型組10 80.55±13.37*MDA（nmoL/mL）LDH（U/L）3.03±0.17△375.71±67.29 2.51±0.33 372.07±59.35 7.01±0.52*379.75±71.04

2.3各組大鼠Cys C、Scr、BUN和UP水平比較見表3。結(jié)果示，模型組Cys C、Scr、BUN和UP與假手術(shù)組比較均升高（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組Cys C、Scr、BUN和UP與模型組比較均降低（均P＜0.05）。

表3　各組大鼠腎功能Cy s C、Sc r、BUN和UP比較（±s）

表3　各組大鼠腎功能Cy s C、Sc r、BUN和UP比較（±s）

組別n實(shí)驗(yàn)組10假手術(shù)組10模型組10 CysC（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）UP（mg/L）17.25±9.17△90.03±12.11△30.57±5.86△12.21±4.09△15.51±3.56 52.57±7.31 27.27±5.41 12.01±4.43 42.72±9.51*143.71±15.50*39.53±6.32*20.25±7.09*

3　討論

冬蟲夏草是由蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲感染麥角菌科真菌后形成復(fù)合體［8］。蟲草含有多種氨基酸、多糖、核苷及甾醇類等化學(xué)成份，其中蟲草多糖具有護(hù)腎、抗炎及增強(qiáng)免疫力等作用，《本草從新》記載蟲草“保肺益腎、止血化痰”之功效，是我國(guó)重要的滋補(bǔ)性中藥［9］。在治療手術(shù)創(chuàng)傷、藥物腎毒等急慢性腎功能損害性疾病時(shí)，冬蟲夏草主要通過(guò)改善腎小管濾過(guò)和重吸收等代謝機(jī)制，增加Cys C、Scr、BUN和UP的排泄率，減少尿蛋白和腎臟病理改變而發(fā)揮改善腎功能的作用［10］，同時(shí)冬蟲夏草還具有明顯的抗衰老及提高免疫力作用，在多病因造成的急慢性腎功能損害被作為免疫調(diào)節(jié)劑而廣泛應(yīng)用并取得了可靠療效［10］。

本實(shí)驗(yàn)研究中所用冬蟲夏草菌粉的藥理成分與中藥冬蟲夏草一致，在用其灌胃治療7 d后，實(shí)驗(yàn)組Klotho蛋白和Klotho-mRNA上調(diào)，UP則降低。腎臟保護(hù)性因子Klotho基因主要在大腦脈絡(luò)膜和腎臟腎小管上皮細(xì)胞上表達(dá)。Klotho基因是Kuro等在1997年在小鼠模型中被發(fā)現(xiàn)，是一種新型抗衰老基因-Klotho，Klotho具有抗氧化、調(diào)節(jié)鈣磷代謝和抗凋亡等多種作用［11］，Klotho基因表達(dá)上調(diào)能夠延緩人類衰老，在調(diào)整機(jī)體磷代謝中也起到重要作用，Klotho主要在腎組織尤其在腎小管上皮細(xì)胞上表達(dá)，故其表達(dá)下調(diào)是腎損傷的標(biāo)志，Klotho高表達(dá)可減緩腎臟損傷促進(jìn)損傷腎小管內(nèi)皮修復(fù)，其基因上調(diào)可調(diào)整機(jī)體磷代謝、保護(hù)腎功能而延緩人類衰老［4］。冬蟲夏草上調(diào)Klotho基因的機(jī)制不太明確，冬蟲夏草菌粉吸收后有可能參與拮抗膜外的磷對(duì)細(xì)胞的毒性作用，抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，增加UP的排泄而減緩腎缺血-再灌注損傷。實(shí)驗(yàn)組Cys C、Scr、BUN和腎組織勻漿中MDA降低，提示冬蟲夏草菌粉能明顯降低腎缺血-再灌注損傷動(dòng)物模型大鼠腎功能的作用；同時(shí)SOD升高，提示冬蟲夏草菌粉減少腎缺血-再灌注MDA和氧自由基的產(chǎn)生，抑制腎缺血-再灌注后脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而達(dá)到保護(hù)腎功能的目的。冬蟲夏草菌粉保護(hù)腎缺血-再灌注腎臟機(jī)制可能與其增加腎小管對(duì)Cys C、Scr和BUN的排泄率，改善腎小管濾過(guò)和重吸收，促進(jìn)腎缺血-再灌注后脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)受到損傷的腎小管細(xì)胞修復(fù)，抑制醛糖還原酶和腎小球代償性肥大，降低腎小管和集合管對(duì)Na+、K+重吸收而減輕腎組織水腫有關(guān)［12-13］。冬蟲夏草中的腺苷可提高SOD活性，在清除自由基和降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA方面已有大量實(shí)驗(yàn)報(bào)道，在改善腎缺血-再灌注腎血流和腎功能等起著重要作用［14］。實(shí)驗(yàn)組大鼠STP、ALB亦升高，研究證實(shí)冬蟲夏草菌粉對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，一方面可降低細(xì)胞免疫（降低T淋巴細(xì)胞吞噬功能），另一方面提高體液免疫（STP、ALB）而達(dá)到提高免疫力，這與宋艷麗、劉江等報(bào)道冬蟲夏草菌粉具有增強(qiáng)免疫功能和抗氧化保護(hù)腎功能作用一致［14-15］。

綜上所述冬蟲夏草可通過(guò)“補(bǔ)虛損、益精氣、實(shí)腠理”［16］，并上調(diào)Klotho基因和增加UP排泄，提高SOD活性來(lái)抑制腎缺血-再灌注后氧自由基生成、提高免疫力、減輕腎功能損害而達(dá)到腎缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。

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Effect of Cordyceps Sinensis on Rat K lotho Gene and Immune Regulation of Renal Ischem ia-reperfusion

Injury

LILi，YANGMin，HEHuaqiong，etal.Hubei University ofMedicine，Hubei，Shiyan 442000，China.

·研究報(bào)告·

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）07-1290-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.008

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（D20122402）
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（電子郵箱：csxchensaoxuo@163.com）

2016-03-25）