HBV不同感染狀態(tài)患者CD4+T細胞功能的差異研究

張丹 李明慧 屈曉晶 靳麗 張璐 路遙 謝堯 劉順愛 成軍 華文浩 宋淑靜

100015首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院肝病中心

HBV不同感染狀態(tài)患者CD4+T細胞功能的差異研究

張丹 李明慧 屈曉晶 靳麗 張璐 路遙 謝堯 劉順愛 成軍 華文浩 宋淑靜

100015首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院肝病中心

目的 探討適應(yīng)性免疫應(yīng)答（adaptive immune response）中CD4+T淋巴細胞在不同HBV感染狀態(tài)患者中功能的差異。方法 采集健康成人（hea1thy individua1s，HI）、急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）、慢性HBV感染免疫耐受期（immune to1erance phase，IT）和免疫清除期（immune c1earance phase，IC）患者的外周靜脈全血。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測外周血CD4+T細胞頻數(shù)，表面功能分子CD69表達，Th1、Th2亞群細胞頻數(shù)及Th1/Th2比值，并分析其在HBV感染不同狀態(tài)患者中的差異。結(jié)果 共收集健康人、急性乙型肝炎、慢性HBV感染免疫耐受期和免疫清除期患者各12、33、30、49例。急乙肝組CD4+T細胞頻數(shù)（AHB，39.99±8.00%）顯著高于免疫耐受組（IT，33.86 ±6.87%）和免疫清除組（IC，34.52±9.17%）（F=4.584，P=0.004），其余各組差異無顯著性；急乙肝組的CD69分子的平均熒光強度（mean f1uorescence intensity，MFI）（25.56±9.01）也顯著高于免疫清除組（21.66±3.38）和免疫耐受組（21.57±5.58）（F=3.291，P=0.023），而AHB、IC、IT、HI各組的CD69分子絕對分子數(shù)（abso1ute mo1ecu1ar count，ABC）依次降低，且差異均有統(tǒng)計學意義（F= 15.201，P=0.000）。HBV各感染狀態(tài)的Th2/Th1比值均無顯著性差異（1.76±0.54，1.57±0.59，1.76±0.67，P＞0.05）。結(jié)論 急性乙型肝炎患者的CD4+T細胞頻數(shù)及細胞表面活化分子CD69均顯著高于慢性HBV感染組；Th2型應(yīng)答在HBV各感染狀態(tài)的CD4+T細胞應(yīng)答中均占主導地位。

【主題詞】 肝炎；乙肝病毒；CD4+T淋巴細胞免疫耐受期；免疫清除期

Fund programs：Nationa1 Natura1 Science Fundation of China（NSFCNO.81071344），Beijing Science and Techno1ogy Commission Major Project（D121100003912001）乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）HBV是引起人類慢性肝臟疾病的一個重要原因，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化、肝癌（HCC），我國肝硬化和HCC患者中，分別有60%和80%是由HBV感染引起［1］。由于機體遺傳背景、免疫狀況的差異，HBV感染后的臨床轉(zhuǎn)歸也不同。大量研究已經(jīng)證實肝臟炎癥嚴重程度及病毒清除與特異性細胞毒性 T淋巴細胞（cytotoxic T 1ymphocyte，CTL）有關(guān)［2］，但是對于輔助型 CD4+T細胞在臨床發(fā)病和轉(zhuǎn)歸中的作用并不是很清楚。本實驗旨在對不同感染狀態(tài)的HBV感染人群CD4+T細胞功能進行研究，探討其與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。

1 對象及方法

1.1研究對象 2014年9月至2016年1月到北京地壇醫(yī)院就診的急性乙型肝炎、慢性HBV感染免疫耐受期和慢乙肝免疫清除期患者及地壇醫(yī)院健康職工的外周靜脈全血。各組人群入組標準：慢性HBV感染免疫耐受組（IT）：年齡≤38歲，HBVDNA≥107拷貝/m1，HBeAg≥1200 S/CO，ALT≤30 U/L，半年以上未服用過保肝降酶藥。急乙肝組（AHB）：診斷符合病毒性肝炎防治指南［7］。慢乙肝免疫清除期組（IC）：HBsAg陽性6個月以上，HBVDNA（+），HBeAg≥100 S/CO，ALT≥190 U/L，且至少有3個月以上的 ALT異常史。所有入組者排除 HIV、HCV、梅毒及其他感染性疾病。該研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2標本采集 入組者新鮮EDTA抗凝靜脈全血，4 h內(nèi)上機檢測。

1.3主要儀器及試劑 FACSCa1ibur流式細胞分析儀、熒光標記單克隆抗體（鼠抗人CD3-PercP、CD4-APC、CD69-PE、CD4-FITC、CD45RO-APC、CD62LPE）、QuantiBRITE PE微球和紅細胞裂解液（FACS Lysing So1ution）均購自美國BD公司。

1.4流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞分子頻數(shù)及表面分子表達 細胞染色后BD FACS Ca1ibur上機，根據(jù)FSC、SSC設(shè)定淋巴細胞門，CD3-PercP （+）CD4-FITC（+）設(shè)定CD4+T細胞，并劃分Th1 （CD45RO+CD62L-）、Th2（CD45RO+CD62L+）亞群；設(shè)定 CD3-PercP（+）CD4-APC（+）CD69-PE （+）群，并用F1owjo 7.6軟件分析出細胞頻率、平均熒光強度（Mean f1uorescence intensity，MFI），以QuantiBRITE微球制作標準曲線計算平均每個細胞表面功能分子 CD69的絕對分子數(shù)（Abso1ute mo1ecu1ar count，ABC）。

1.5統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示，計量資料以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。正態(tài)分布資料的四組間數(shù)據(jù)的比較采用方差分析完成，若四組間數(shù)據(jù)比較差別有統(tǒng)計學意義，則采用LSD方法進行兩兩比較，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計學意義。

表1　入組患者基本信息Tab.1 Genera1 information of subjects in this study（Mean±SD）

表2　各組間CD4+T細胞亞群的細胞頻數(shù)及功能分子比較（Mean±SD）Tab.2 The frequency of CD4+T and their surface functiona1 mo1ecu1es in different groups

圖1　CD4+T細胞頻數(shù)、各亞群頻數(shù)、表面CD69活化分子表達在健康成人、慢性HBV感染免疫耐受期患者、急性乙型肝炎患者、慢性HBV感染免疫清除期患者中比較Fig.1 Comparison of CD4+T ce11 frequency、the subsets of CD4+T ce11 and the expression of ear1iest activation signa1s CD69 in hea1thy individua1s（HI），patients in the immune to1erance（1T），patients with acute hepatitis B（AHB）and patients in immune c1earance（IC）phase

2 結(jié)果

外周血CD4+T細胞頻數(shù)，Th1、Th2亞群分布及表面分子CD69、IFNAR2表達如下：

2.1HBV各感染狀態(tài)臨床指標比較 AHB組的ALT顯著高于IC、IT組（F=42.83，P=0.00），而HBVDNA，HBsAg，HBeAg顯著低于IC、IT組（P= 0.00），差異均有統(tǒng)計學意義（表1）。

2.2HBV感染各組CD4+T細胞頻數(shù) 急乙肝組CD4+T細胞頻數(shù)（AHB，39.99±8.00%）較免疫耐受組（IT，33.86±6.87%）和免疫清除組（IC，34.52 ±9.17%）顯著升高（F=4.584，P=0.004），其余各組無顯著差異。（圖1，表2）。

2.3Th1、Th2頻數(shù)及Th2/Th1比值 HBV感染各組的Th2細胞頻數(shù)（F=1.406，P=0.244）和Th2/Th1比值（F=5.464，P=0.01）差異無統(tǒng)計學意義，Th1顯著高于健康成人組（F=4.469，P= 0.005）（圖1，表2）。

2.4CD4+T細胞表面表達的CD69分子的平均熒光強度和絕對分子計數(shù) 急乙肝組的 CD69MFI （25.56±9.01）較免疫清除組（21.66±3.38）和免疫耐受組（21.57±5.58）明顯升高（F=3.291，P= 0.023），AHB，IC，IT，HI各組的CD69分子的絕對分子數(shù)依次降低，差異均有統(tǒng)計學意義（F= 15.201，P=0.000）。（圖1，表2）。

3 討論

CD4+T細胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中主要通過輔助型T細胞發(fā)揮免疫學效應(yīng)，而Th細胞根據(jù)分泌細胞因子不同主要分為兩個亞群（Th1和Th2），其中Th1細胞主要通過釋放IL-2、IFN-γ等細胞因子，調(diào)節(jié)CTL細胞發(fā)揮細胞毒作用，介導細胞免疫，有利于自身病毒的清除，而Th2細胞主要分泌細胞因子IL-4、IL-6、IL-10等，表達協(xié)同刺激分子配體CD40L，結(jié)合B細胞表面CD40，調(diào)節(jié)體液免疫［3］，與肝臟炎癥損傷有關(guān)。很多研究顯示外周血中Th1/ Th2比例失衡，細胞免疫紊亂可能是導致HBV感染不能完全恢復的重要原因［4-5］。CD69是表達在活化的淋巴細胞表面的早期活化標志，當淋巴細胞受到抗原刺激時，CD69表達可上調(diào)，而Luisa Barboza a等的研究顯示慢性HBV感染的患者CD4+T細胞的早期活化并不充分，體外以HBcAg刺激CD4+T細胞后表面的活化分子CD69是下調(diào)的，CD4+T細胞不能完全發(fā)揮作用，也許可以在一定程度上解釋為何病毒在人體內(nèi)持續(xù)存在［6］。

本研究結(jié)果顯示，急性乙型肝炎組的CD4+T細胞頻數(shù)及細胞表面的活化分子CD69均顯著高于慢性HBV感染免疫清除和免疫耐受組，提示急性乙型肝炎患者CD4+T細胞水平的應(yīng)答較慢性HBV感染者明顯增強，同時顯示不論在慢性HBV感染的免疫清除還是免疫耐受患者，HBV感染均可誘導CD4+T細胞的活化和活化分子CD69表達上調(diào)，這與Luisa Barboza a等的研究是相反的。但其上調(diào)水平有限，在免疫清除期會引起一定程度的肝臟炎癥，不能達到與AHB相當?shù)母闻K炎癥，HBV感染自然也不能完全恢復，而免疫耐受期雖然也有CD4+T細胞應(yīng)答，但可能由于長期在高載量HBVDNA、HBsAg和HBeAg誘導下，Treg細胞較急乙肝患者顯著升高，CD4+T細胞表面抑制性受體（CTLA-4、PD-1等）及抑制性細胞因子（IL-10、TGF-β）表達上調(diào)，使宿主的免疫應(yīng)答整體處于低能水平［7-9］。本研究結(jié)果還顯示，三組HBV感染者Th2/Th1均大于1，AHB與IC組的Th2細胞頻數(shù)高于IT組和HI組，IT、IC、AHB、HI四組Th1細胞頻數(shù)呈下降趨勢，但無顯著性差異，可能與有限的入組例數(shù)有關(guān)。其中HI較其余三組明顯下降，提示不論是急性還是慢性HBV感染的炎癥期均以Th2應(yīng)答為主，尤其是急性乙型肝炎早期，Th2分泌大量炎癥因子，攻擊HBV感染肝細胞從而引起的重度肝損傷，而Th1主要介導細胞免疫并不引起轉(zhuǎn)氨酶升高，但其在急性乙型肝炎恢復期徹底清除病毒中發(fā)揮著重要作用。而慢性HBV感染者雖然也有Th2升高，但由于機體免疫功能不足，反復引起肝臟損傷，病毒不能徹底清除，從而使肝炎逐漸向肝硬化發(fā)展。

綜上所述，CD4+T細胞頻數(shù)和功能的改變在宿主的抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用，Th2應(yīng)答在HBV各感染狀態(tài)的CD4+T細胞免疫應(yīng)答中占主導地位。通過對免疫細胞的功能進行研究為我們在不同HBV感染狀態(tài)選擇合適的治療手段提供了依據(jù)。

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CD4+T cell function of the patients in different states of HBV infection

Zhang Dan，Li Minghui，QuXiaojing，Jin Li，Zhang Lu，Lu Yao，Xie Yao，Liu Shunai，Cheng Jun，Hua Wenhao，Song Shujing Liver Center of Beijing Ditan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100015，China

Xie Yao，Email：xieyao00120184@sina.com；Liu Shunai，Email：liusa1031@ sina.com

Objective To exp1ore the functiona1 differences of CD4+T 1ymphocytes in patients with different states of HBV infection.Methods Co11ect hea1thy adu1ts（HI），acute vira1 hepatitis（AHB），chronic HBV infection in immune to1erant phase（IT），and chronic hepatitis B in immune c1earance phase （IC）patients with venous b1ood.Use f1ow cytometry to detect periphera1 b1ood CD4+T frequencies，the expression of surface mo1ecu1e CD69，Th1 and Th2 subsets frequency and the ratio of Th1/Th2.and ana1yze the difference in different states of HBV infection.Results Co11ect 12，33，30，49 cases patients of HI，AHB，IT，IC respective1y.The frequency of CD4+T ce11s in the acute hepatitis B group（AHB，39.99± 8.00%）was significant1y higher than that in the immune to1erance group（IT，33.86±6.87%）and the immune c1earance group（IC，34.52±9.17%），（F=4.584，P=0.004），and there was no significant difference among the other groups（1.76±0.54，1.57±0.59，1.76±0.67，P＞0.05）.Acute hepatitis B group（25.56±9.01）increased significant1y in CD69MFI than in the immune c1earance group（21.66± 3.38）and immune to1erance group（21.57±5.58），In acute hepatitis B，immune c1earance，immune to1erance group and the group of hea1thy adu1ts，the CD69 mo1ecu1ar abso1ute number decreased in turn（F= 15.201，P=0.000）.Conclusions The frequency of CD4+T ce11s and the surface mo1ecu1e CD69 in patients with acute hepatitis B were significant1y higher than those in chronic HBV infection group；Th2 response was dominant in the CD4+T ce11 response to HBV infection.

Hepatitis B；hepatitis B virus；CD4+T 1ymphocytes；immune to1erance phase；immune c1earance phase

國家自然科學基金（81071344）北京市科學技術(shù)委員會重大項目（D121100003912001）

謝堯，Emai1：xieyao00120184@sina.com；劉順愛，Emai1：1iusa1031@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.019

2016-03-01）